劉曉蕾, 高明

(1.寧夏回族自治區(qū)農(nóng)業(yè)學(xué)校, 銀川 750021; 2.寧夏葡萄酒與防沙治沙職業(yè)技術(shù)學(xué)院, 銀川 750021)

丹參(SalviamiltiorrhizaBunge)作為我國的傳統(tǒng)大宗藥材，其有效成分主要包括脂溶性的丹參酮類化合物和水溶性的丹酚酸類化合物。目前，對(duì)于丹參的研究主要集中在栽培模式[1]、栽培技術(shù)[2]、有效成分積累[3-4]、臨床研究[5-7]等方面。

國內(nèi)外對(duì)丹參脂溶性成分已進(jìn)行了大量研究[8-9]，而我國中醫(yī)傳統(tǒng)用藥多以水煎服，即以丹參的水溶性成分入藥為主，其藥理作用廣泛，具有多種活性[10]。丹參水溶性有效成分更容易制作成注射液,在治療心腦血管疾病、惡性腫瘤等疾病方面表現(xiàn)突出[11-13]。目前對(duì)于丹參水溶性成分研究多集中在測(cè)定方法[14]、提取工藝[15]等方面，同一種藥用植物在不同生長時(shí)期、不同環(huán)境下，其次生代謝物含量處于動(dòng)態(tài)變化中[16]。土壤是植株賴以生存的基質(zhì)，土壤水分的多少?zèng)Q定著植物成活與否、長勢(shì)好壞，對(duì)于根類藥材更與其有效成分的積累有著密切關(guān)系，嚴(yán)重水分脅迫和水分過多都不利于菘藍(lán)中靛玉紅積累，中度水分脅迫能促進(jìn)根部靛玉紅積累[17]。水分脅迫促進(jìn)短葶飛蓬中藥用成分燈盞乙素和咖啡酸酯的積累[18]。但是，關(guān)于不同土壤水分下、不同生長時(shí)期丹參水溶性有效成分積累規(guī)律方面的報(bào)道較少。掌握藥材有效成分積累的動(dòng)態(tài)變化規(guī)律，是確定藥材最佳采收期的前提。因此，本研究采用盆栽法控制土壤水分，監(jiān)測(cè)不同土壤水分下丹參的生長指標(biāo)，應(yīng)用高效液相色譜法(high performance liquid chromatography, HPLC)測(cè)定不同土壤水分含量、不同生長時(shí)期根部丹參素、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B的含量變化，擬闡明丹參水溶性有效成分的積累規(guī)律，揭示4種成分的最佳土壤水分條件和采收期，為寧夏等干旱地區(qū)丹參的規(guī)范化栽培、質(zhì)量“穩(wěn)定、可控”提供一定的理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料和試劑

試驗(yàn)用苗期的丹參幼苗(約180 d)，來自陜西商洛天士力藥源基地。

甲醇(色譜純和分析純)、乙腈(色譜純)、磷酸(色譜純)購自西安化學(xué)試劑廠。丹參素鈉、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B標(biāo)準(zhǔn)品均購自中國食品藥品檢驗(yàn)研究院。

1.2 試驗(yàn)方法

試驗(yàn)采用盆栽法。將試驗(yàn)地耕層土壤與蚯蚓糞、細(xì)河沙按3∶1∶1混勻，每桶裝入10 kg，桶尺寸：高27 cm、上口徑35 cm、下口徑22 cm。于2018年3月選取大小一致、無病，根部粗細(xì)均勻、健壯的幼苗移栽于塑料桶中，每桶3株，共40桶。采用環(huán)刀法測(cè)定此盆栽土田間最大持水量(θf)為27%。盆栽桶放置于寧夏農(nóng)業(yè)學(xué)校大棚內(nèi)。緩苗生長1個(gè)月，待幼苗長勢(shì)穩(wěn)定后，選取大小、長勢(shì)相近的幼苗30桶，設(shè)35%θf、55%θf、75%θf3個(gè)土壤水分梯度，每個(gè)處理重復(fù)10桶。不澆水，讓其自然耗至設(shè)定水分后，通過電子秤(皇鷹，HY-998)每天稱重澆水，控制土壤水分持續(xù)保持在設(shè)定梯度水平。

1.2.1丹參生長指標(biāo)的觀察測(cè)定 于5月15日—6月15日，每5 d測(cè)量株高、葉長一次，利用毫米刻度尺測(cè)量基部到主莖頂部之間的距離作為株高，用毫米刻度尺測(cè)量幼苗葉基到葉尖的長度作為葉長。

1.2.2丹參水溶性有效成分含量測(cè)定 于5月—10月每隔20 d進(jìn)行間隔性采樣，挖取丹參地下根部分，60 ℃烘干粉碎過40目篩。保存于陰涼通風(fēng)處，備用。準(zhǔn)確稱取丹參地下部樣品粉末每份0.050 g，每個(gè)處理3個(gè)重復(fù)，加入5 mL 70%甲醇搖勻，室溫下浸泡7 h，100%功率超聲45 min，常溫10 000 r·min-1離心5 min ，取上清液經(jīng)0.45 μm 濾膜過濾得供試品溶液。

分別精密稱取干燥的水溶性對(duì)照品丹參素鈉1.18 mg、咖啡酸1 mg、迷迭香酸0.30 mg、丹酚酸B 5.98 mg，置于10 mL棕色量瓶中，75%甲醇溶解后定容，質(zhì)量濃度分別為118、100、30、598 μg·mL-1，分別吸取不同體積的丹參素鈉、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B標(biāo)準(zhǔn)品溶液，以75%甲醇稀釋為10個(gè)不同質(zhì)量濃度的系列溶液。按下述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以標(biāo)準(zhǔn)品的質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)，峰面積(y)為縱坐標(biāo)，進(jìn)行回歸分析，所得標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程如下：丹參素鈉的回歸方程為y=2 198 091.829 3x-23 594.047 5,R2=0.999 9；咖啡酸的回歸方程為y=5 403 851.047 6x-42 127.033 2，R2=0.999 0；迷迭香酸的回歸方程為y=3 492 217.069 4x-134 249.412 9，R2=0.998 9；丹酚酸B的回歸方程為y=1 200 681.000 9x-81 160.019 4，R2=0.999 3。

色譜柱：Waters Sunfire-C18(5 μm，4.6 μm×250 mm)；柱溫：30 ℃。流動(dòng)相：乙腈(B)-0.02%磷酸水溶液(A)；檢測(cè)波長：全波長掃描，丹參素鈉、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B的檢測(cè)波長依次為281、325、331、288 nm。水-乙腈梯度洗脫系統(tǒng)見表1。

表1 指紋圖譜的流動(dòng)相梯度Table 1 Linearity of mobile system of fingerprints

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Microsoft Excel 2010、SPSS 16.0軟件對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，采用LSD法進(jìn)行差異顯著性多重比較檢驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同土壤水分含量對(duì)丹參株高和葉長的影響

土壤水分不足時(shí)，植株各莖節(jié)間活動(dòng)受抑，伸長遲緩，株高降低，葉的長度減小以減弱蒸騰失水[19]。從不同水分處理的丹參生長狀況(圖1)可以看出，隨著時(shí)間的延長，丹參的株高和葉長均表現(xiàn)出逐漸上升趨勢(shì)，符合植物生長的一般規(guī)律。3種水分處理下，株高和葉長均呈現(xiàn)75%θf>55%θf>35%θf的趨勢(shì)，這與賀少軒等[20]在2種酸棗中的研究結(jié)果一致。說明在5—6月期間，丹參地上部分的生長與土壤水分成正比，土壤水分充盈利于地上部分生長。

圖1 不同水分處理對(duì)丹參株高和葉長的影響Fig.1 Effects of different treatments on stem height and leaves length of S. miltiorrhiza

2.2 不同土壤水分含量對(duì)丹參根部丹參素含量的影響

5—10月整個(gè)測(cè)定期內(nèi)3種土壤水分處理的丹參根系中水溶性丹參素積累的動(dòng)態(tài)結(jié)果(圖2)表明，3種水分梯度下，丹參素在整個(gè)測(cè)定期內(nèi)均在6月28日丹參素含量最高，隨后含量逐漸下降；9月18日出現(xiàn)第二峰點(diǎn)，但丹參素含量低于6月28日的值。從5月到8月中旬，丹參素含量一直表現(xiàn)為55%θf處理的最高，且與另2個(gè)處理差異極顯著(P<0.01)，總體表現(xiàn)為55%θf>35%θf>75%θf；從8月28日開始，其含量與土壤水分成反比，35%θf處理最高，且與另2個(gè)處理差異極顯著(P<0.01)，表現(xiàn)為35%θf>55%θf>75%θf。綜上說明，6月下旬是丹參素積累量最高的時(shí)期，其次是9月中旬。同時(shí)，丹參素積累的土壤適宜水分隨丹參生長時(shí)期而變，9月之前，土壤水分控制在55%θf較適宜丹參素的積累，而進(jìn)入9月后，土壤水分應(yīng)控制在35%θf。

圖2 不同水分處理對(duì)丹參素含量的影響Fig.2 Effects of different treatments on Danshensu content in roots of S. miltiorrhiza

2.3 不同土壤水分對(duì)丹參根部咖啡酸含量的影響

3種土壤水分處理下丹參根系中咖啡酸積累的動(dòng)態(tài)過程(圖3)顯示，隨著水分處理時(shí)間的延長，咖啡酸一直表現(xiàn)為在55%θf處理含量最高，35%θf次之，75%θf的最低。除10月3日55%θf處理的結(jié)果與另2個(gè)處理顯著差異外(P<0.05)，其他檢測(cè)時(shí)期均表現(xiàn)為極顯著差異(P<0.01)。在整個(gè)測(cè)定期內(nèi)，3個(gè)水分處理的咖啡酸含量走勢(shì)均呈“雙峰型”曲線，最高點(diǎn)出現(xiàn)在6月28日，第二峰點(diǎn)出現(xiàn)在9月18日，之后3個(gè)處理的咖啡酸含量均逐漸下降。由此可知，丹參有效成分咖啡酸含量積累較高的時(shí)期為6月下旬和9月中旬，土壤水分控制在55%θf左右有利于咖啡酸的積累。

圖3 不同水分處理對(duì)咖啡酸含量的影響Fig.3 Effects of different treatments on caffeic acid content in roots of S. miltiorrhiza

2.4 不同土壤水分含量對(duì)丹參根部迷迭香酸含量的影響

3種土壤水分處理下丹參根系中迷迭香酸積累的動(dòng)態(tài)過程見圖4，可見，在整個(gè)測(cè)定期內(nèi)，3種水分梯度下，迷迭香酸含量整體呈急劇升高又緩慢降低的趨勢(shì)。隨著水分處理時(shí)間的延長，迷迭香酸始終顯現(xiàn)為75%θf處理的含量最高，且與另2個(gè)處理差異極顯著(P<0.01)。3個(gè)水分處理均在6月28日達(dá)到迷迭香酸含量最高點(diǎn)，隨后逐漸降低，75%θf處理下含量在8月28日出現(xiàn)短暫上升后繼續(xù)下降。由此可知，迷迭香酸含量積累較高的時(shí)期為6月底，土壤水分適度升高促使根部迷迭香酸在體內(nèi)合成，土壤含水量為75%θf最佳。

圖4 不同水分處理對(duì)迷迭香酸含量的影響Fig.4 Effects of different treatments on rosmarinci acid content in roots of S. miltiorrhiza

2.5 不同土壤水分對(duì)丹參根部丹酚酸B含量的影響

丹酚酸B具有保護(hù)心腦血管、抗肝損傷等作用[21]。3種土壤水分處理下丹參根系中丹酚酸B積累的動(dòng)態(tài)過程見圖5，可見， 3個(gè)水分處理下，丹酚酸B在整個(gè)測(cè)定期內(nèi)呈“雙峰型”曲線，6月28日丹酚酸B含量最高，隨后逐漸下降，75%θf和55%θf處理在8月28日出現(xiàn)第2峰點(diǎn)，35%θf處理的第2峰點(diǎn)出現(xiàn)在9月18日；之后，3種水分控制下的丹酚酸B含量均逐漸降低。5月底到8月底期間，75%θf處理的丹酚酸B含量最高，與另2個(gè)處理差異極顯著(P<0.01)；8月28日55%θf處理含量最高，與另2個(gè)處理差異極顯著(P<0.01)；9月18日后35%θf處理最高，且與另2個(gè)處理差異極顯著(P<0.01)。整體而言，6月下旬是丹酚酸B累積最高的時(shí)期。建議大田種植時(shí)，應(yīng)根據(jù)不同生長時(shí)期來人工控制適合丹酚酸B積累的土壤水分供給，以達(dá)到適合丹酚酸B積累的最佳種植條件。

圖5 不同水分處理對(duì)丹酚酸B含量的影響Fig.5 Effects of different treatments on salvianolic acid B content in roots of S. miltiorrhiza

從圖2～5可知，在同一時(shí)間、同一土壤水分條件下，丹參根部的4種有效成分含量表現(xiàn)為：丹酚酸B>迷迭香酸>丹參素>咖啡酸。

3 討論

整個(gè)試驗(yàn)期內(nèi)3種水分處理下丹參根部4種水溶性有效成分的積累基本都呈“雙峰型”曲線，且均在6月28日達(dá)到最大值，由此說明，6月下旬是丹參根部水溶性有效成分積累的關(guān)鍵時(shí)期，這與秦海燕等[21]的研究結(jié)果一致。9月中旬是4種有效成分積累的第2高峰期，隨后逐漸降低，這與劉靈娣等[16]對(duì)不同時(shí)期丹酚酸B的變化趨勢(shì)研究結(jié)果相同。

本研究表明，不同生長時(shí)期，丹參根部不同有效成分對(duì)水分的需求量有所不同。丹參素在9月份之前，55%θf條件下含量最高，而進(jìn)入9月份之后，土壤水分應(yīng)控制在35%θf左右。咖啡酸的積累在整個(gè)測(cè)定期內(nèi)均為55%θf處理最佳。迷迭香酸積累在整個(gè)測(cè)定期內(nèi)，均表現(xiàn)為75%θf水分條件最佳，說明土壤含水量適度升高利于迷迭香酸的積累。丹酚酸B在9月之前，75%θf水分條件最佳；進(jìn)入9月后，35%θf水分處理最好。劉大會(huì)等[22]認(rèn)為土壤水分在55%θf～60%θf條件下促進(jìn)丹參苗期的丹酚酸B積累，與本研究結(jié)果有所差別，可能因?yàn)槠溥x用丹參種子栽種，而本研究選用180 d的丹參幼苗栽種，從而導(dǎo)致不同生育期植株對(duì)需水量存在差異所致。

丹參素和丹酚酸B的需水規(guī)律具有相似性，均為在9月之前需水相對(duì)較多，且土壤含水量分別在55%θf和75%θf時(shí)有效成分含量最大，9月之后土壤需要保持干旱，水分含量降至35%θf最佳。可能是因?yàn)?～8月是全年高溫時(shí)期，蒸騰旺盛，同時(shí)也是丹參生長的旺盛時(shí)期，植株維持代謝活動(dòng)需水量相對(duì)較大；進(jìn)入9月，氣溫下降，空氣濕度逐漸增大，植物蒸騰作用減弱，35%θf的水分含量已能夠滿足丹參生長代謝需要，控制土壤水分保持相對(duì)干旱，能使其與外界的濕潤氣候產(chǎn)生綜合效應(yīng)，從而達(dá)到積累有效成分的目的，而9月之后，兩個(gè)土壤水分含量較高的處理可能對(duì)植物造成了澇害脅迫，影響其正常生長生理代謝，次生代謝物積累緩慢。

綜上所述，土壤水分虧缺抑制丹參生長，丹參素、咖啡酸、迷迭香酸、丹酚酸B含量均在6月下旬達(dá)到最大值，9月中旬進(jìn)入第二積累峰值，在大田種植時(shí)，可根據(jù)這2個(gè)時(shí)期靈活采收。不同土壤水分水平能夠影響丹參水溶性有效成分的積累，土壤濕潤利于丹酚酸B和迷迭香酸合成，土壤適度干旱促使咖啡酸和丹參素合成。但在丹參的不同生長時(shí)期、不同有效成分對(duì)水分的需求量又有差異。4種有效成分對(duì)水分的需求量表現(xiàn)為：丹參素<咖啡酸<丹酚酸B<迷迭香酸。在對(duì)干旱地區(qū)丹參規(guī)范化種植管理時(shí)，應(yīng)根據(jù)栽培的目標(biāo)成分不同，結(jié)合生長期，制定合理的水分管理措施，保證藥材質(zhì)量穩(wěn)定、可控。