康紅梅,李花花,徐當(dāng)會(huì),秦 鵬,劉美玲

1 甘肅省科學(xué)院生物研究所, 蘭州 730000 2 蘭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 蘭州 730000 3 中國科學(xué)院西北生態(tài)環(huán)境資源研究院,沙坡頭沙漠研究試驗(yàn)站, 蘭州 730000

由于化石燃料的大量應(yīng)用和森林面積的不斷減少,大氣中作為溫室氣體之一的CO2逐年增加,已從工業(yè)革命前的280 μmol/mol上升到現(xiàn)在的大約365 μmol/mol,預(yù)計(jì)到2100年將達(dá)到700 μmol/mol,由此導(dǎo)致的全球平均氣溫將升高2.0—4.5℃,極端氣候的頻率將增加[1]。CO2濃度和溫度是影響植物生長和發(fā)育的兩個(gè)重要生態(tài)因子,兩者在全球變化中的相互作用對木本植物生長和發(fā)育具有顯著影響[2]。

CO2濃度升高可提高植物的光合作用,增大氣孔阻力,減少蒸騰作用,抑制植物的呼吸作用,從而促進(jìn)植物的生長。但CO2濃度增加對植物的影響是復(fù)雜的,許多機(jī)制尚未了解[3]。對于多數(shù)陸生植物來說,CO2濃度增加可以促進(jìn)光合作用[4],但在干旱條件下CO2濃度倍增不能增加植物的生長[5- 8]。植物生長還取決于植物的種類、年齡、觀察的時(shí)期、生長的條件[9]以及土壤的營養(yǎng)狀況[8]等條件。不斷增加的大氣CO2濃度促進(jìn)根的生物量增加要大于對地上部分生物量的影響[10]。

環(huán)境溫度升高與CO2濃度富集相似,可以提高植物光合速率和生產(chǎn)力[11-12],尤其在寒冷的季節(jié)和水分充足條件下[13]。未來氣候變化(尤其是溫度升高),從短期看主要是影響光合作用,但這些影響又因物種不同而不同[14-16]。植物的光合作用和生長量在不同降水量和溫度條件下對CO2濃度倍增的響應(yīng)是不同的,陸地生態(tài)系統(tǒng)對環(huán)境變化的響應(yīng)必須考慮物種差異和多重因素[17]。闡明CO2濃度和溫度升高的相互影響對于預(yù)測生態(tài)系統(tǒng)功能和結(jié)構(gòu)對環(huán)境變化的響應(yīng)有重要意義[3]。

全球氣候變化對植物的抗氧化系統(tǒng)也會(huì)產(chǎn)生影響[18]。CO2具有保護(hù)作用,可以減輕活性氧(ROS)的產(chǎn)生并增加其抗氧化的能力,但CO2對抗氧化系統(tǒng)影響的分子機(jī)制還遠(yuǎn)未了解[19]。植物在無脅迫的情況下CO2濃度升高,植物的抗氧化的水平發(fā)生變化,暗示著未來氣候變化會(huì)影響細(xì)胞的氧化還原狀況[20-21]?？寡趸负涂寡趸锊粌H能夠控制植株的氧化傷害,還可作為氧化還原信號,是研究全球環(huán)境變化下脅迫對植株產(chǎn)生影響的首選對象[14]。

鬼箭錦雞兒(Caraganajubata)是西北高山區(qū)典型灌木,主要分布在青藏高原和喜馬拉雅地區(qū)的高山、中亞天山及西伯利亞山地的高山草甸草原[22]。在甘肅祁連山、馬銜山和甘南的瑪曲、卓尼也有分布,是高山草甸帶的重要組成物種。研究環(huán)境條件變化對鬼箭錦雞兒生長和抗氧化系統(tǒng)的影響,對于預(yù)測大氣環(huán)境變化對高寒區(qū)植物的影響是極其重要和必要的。本研究以鬼箭錦雞兒為實(shí)驗(yàn)對象,探討環(huán)境變化對其生長和抗氧化系統(tǒng)的影響,驗(yàn)證以下假設(shè)：

(1)CO2濃度升高和溫度升高有利于鬼箭錦雞兒幼苗的生長。

(2)環(huán)境條件變化將影響植物的抗氧化系統(tǒng),CO2濃度升高對其具有保護(hù)作用。

1 材料與方法

試驗(yàn)采用日本NK培養(yǎng)箱(NC- 241/411HC, Nippon Medical & Chemical Instruments CO., LTD)控制溫度、濕度及CO2濃度。鬼箭錦雞兒種子采自甘肅馬銜山。溫室進(jìn)行發(fā)芽及培養(yǎng)(20—22℃),出苗后選取長勢一致的幼苗移栽于育種缽(d=9.5 cm),基質(zhì)為混合土(營養(yǎng)土∶珍珠巖∶蛭石=3∶1∶1),培養(yǎng)1個(gè)月后進(jìn)行分組實(shí)驗(yàn)。

培養(yǎng)條件：光照600 μmol m-2s-1(12 h/d),相對濕度50%/70%(day/night)。兩種CO2濃度(C1: 400 μmol/mol, C2: 800 μmol/mol),兩種環(huán)境溫度(T1: 20℃/10℃,T2: 23℃/13℃ day/night)。每4天澆一次水,每缽70—80 mL。共4個(gè)處理(C1T1,C2T1,C1T2,C2T2),每個(gè)處理分為2組,每組8—10株,培養(yǎng)7周后,1組收獲,另1組進(jìn)行水分脅迫實(shí)驗(yàn)。在收獲前的2天,用保鮮膜將育種缽包裹完全后稱重,24 h后再次稱重,以計(jì)算蒸騰速率(E)。對培養(yǎng)前和培養(yǎng)后的幼苗根、莖、葉分別烘干后稱重,烘干前采用掃描法測量葉面積(ImageJ軟件)。通過停止?jié)菜畞磉M(jìn)行水分脅迫,分別在1 d、8 d、15 d和20 d采集葉片液氮保存用于抗氧化酶及抗氧化劑含量測定。

參數(shù)計(jì)算及統(tǒng)計(jì)方法：凈光合速率(NAR,Net assimilation rate)及相對生長速率(RGR,Relative growth rate)根據(jù)以下公式計(jì)算：

(1)

(2)

式中,w1和s1是實(shí)驗(yàn)開始時(shí)(t1)植株的干物質(zhì)量和總?cè)~面積,w2和s2是實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)(t2)收獲的總干物質(zhì)量和總?cè)~面積[23-24]。

從原始數(shù)據(jù)可以計(jì)算出其他參數(shù)：葉生物量比(LMR, Leaf mass ratio; 葉生物量/總生物量)、葉面積比(LAR, Leaf area ratio; 葉面積/總生物量)、比葉面積(SLA, Specific leaf area; 葉面積/葉生物量)、地下與地上生物量比(BAMR, Below ground to above ground biomass ratio; 地下生物量/地上生物量)、根生物量比(RMR, Root mass ratio; 根生物量/總生物量)、根莖比(RSR, Root to stem ratio; 根生物量/莖生物量)、水分利用效率(WUE, Water use efficiency; 生物量的增加/蒸騰量)。

粗酶提取及抗氧化酶活性和抗氧化劑含量測定：粗酶提取采用預(yù)冷的磷酸緩沖液[25],4℃保存,用于酶活性測試。采用分光光度法測定過氧化物酶(POD, Peroxidase)[26]、過氧化氫酶(CAT, Catalase)[27]、抗壞血酸過氧化物酶(APX, Ascorbate peroxidase)[28]、超氧化歧化酶(SOD, Superoxide dismutase)[29]、谷胱甘肽還原酶(GR, Reduced glutathione)[25]、單脫氫抗壞血酸還原酶(MDHAR, Monodehydroasorbate reductase)[30]活性?？扇苄缘鞍缀繙y定采用G-250染色法。

丙二醛(MDA, Malondialdehyde)、H2O2及抗氧化劑的測定。取0.3 g冷凍的樣品,加5 mL 5% 三氯乙酸冰浴研磨,高速冷凍離心后取上清液備用。采用分光光度法測定MDA,H2O2,還原型谷胱甘肽(GSH, Reduced glutathion),和抗壞血酸(ASA, Ascorbic acid)的含量[31]。

采用SPSS 15.0進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,用雙因素方差分析(two-way ANOVA)法,分析CO2濃度(C)和環(huán)境溫度(T)及其交互作用對鬼箭錦雞兒生長的影響。用Origin 6.1軟件做圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 CO2濃度增加(eCO2)和溫度增加(eT)對鬼箭錦雞兒幼苗生長的影響

CO2濃度和溫度增加對鬼箭錦雞兒幼苗生長有顯著影響,但對株高和E影響不顯著(表1)。CO2濃度對SLA和WUE的影響要高于溫度對其的影響,而LMR,LAR,BAMR,RMR,RSR對溫度更加敏感。CO2濃度和溫度對總生物量、根長和LAR有交互影響。溫度對植株生長的影響要大于CO2濃度對其的影響。

表1 鬼箭錦雞兒幼苗對不同CO2濃度和溫度響應(yīng)的雙因素方差分析結(jié)果(F)

顯著水平：***,P<0.001；**,P<0.01；*,P<0.05；ns代表差異不顯著,dF是自由度;LMR：葉生物量比Leaf mass ratio；LAR：葉面積Leaf area ratio；SLA：比葉面積Specific leaf area；BAMR：地下與地上生物量比Below ground to above ground biomass ratio；RMR：根生物量比Root mass ratio；WUE：水分利用效率Water use efficiency；E：蒸騰速率Evaporation

CO2濃度及溫度增加對植株幼苗生長的影響如圖1所示。溫度增加對正常CO2濃度下植株總生物量和根長有抑制作用,eCO2可以促進(jìn)生長,減輕抑制。eT使幼苗總生物量下降了53.1%(C1),根系長度降低30.1%(C1)；eCO2對總生物量和根長有促進(jìn)作用,C2T2條件下總生物量和根長與C1T1相同。eCO2對常溫下株高有促進(jìn)作用。

圖1 鬼箭錦雞兒幼苗在不同CO2濃度(C)和溫度(T)下生長49d后的總生物量、株高及根長Fig.1 Biomass, seeding height and root length of C. jubata seedlings under CO2 concentration and alternating temperatures in growth chamber 數(shù)值為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤；C1: 400 μmol/mol, C2: 800 μmol/mol; T1: 20℃/10℃, T2: 23℃/13℃

環(huán)境條件變化對幼苗NAR和RGR的影響如圖2所示。eT使得幼苗的NAR下降了41.8%(C2)—66.9%(C1),RGR降低了32.5%(C2)和59.7%(C1)；eCO2使得幼苗的NAR增加了29.5%(T1)—134.8%(T2)。C2T2比C1T1仍然低16.9%(NAR)和27.7%(RGR),說明eCO2可部分緩解eT對NAR和RGR的抑制。

圖2 鬼箭錦雞兒幼苗在不同CO2濃度(C)和溫度(T)下生長49 d的凈光合速率和相對生長速率Fig.2 Net assimilation rate and Relative growth rate of C. jubata under CO2 concentration and alternating temperatures in growth chamber

環(huán)境條件變化對植株幼苗生長參數(shù)的影響如圖3所示。eCO2和eT表現(xiàn)出相反的效應(yīng)。eCO2不同程度的降低了LMR和LAR,但BAMR、RMR和RSR有不同程度增加。LMR降低了26.6%(T2),LAR降低了33.0%(T1)和37.8%(T2)；BAMR增加28.8%(T1)和34.0%(T2),RMR增加了14.3%(T1)；RSR增加了21.0%(T1)。相反,eT不同程度的增加了LMR和LAR,但降低了BAMR、RMR和RSR。LMR增加89.8%(C2)和94.0%(C1)；LAR增加108.1%(C2)和123.8%(C1)；BAMR降低了59.8%(C2)和62.8%(C1)；RMR降低了39.0%(C2)和47.4%(C1)；RSR降低了46.3%(C1)和50.1%(C2)。所以,溫度增加有利于葉的生長,而CO2濃度倍增促進(jìn)根的發(fā)育。

圖3 鬼箭錦雞兒幼苗在不同CO2濃度(C)和溫度(T)條件下生長49 d后的生長參數(shù)Fig.3 Parameters of C. jubata seedlings under CO2 concentration and alternating temperatures in growth chamber

eCO2和eT對C.jubata幼苗E和WUE的影響如圖4所示。CO2濃度增加可以降低常溫下的蒸騰,增加水分利用效率。eCO2使得E降低了51.6%(T1),WUE增加了87.9%(T2)和178.8%(T1)。eT使得E降低33.9%(C1)或增加27.5%(C2),WUE降低了41.3%(C1)和60.2%(C2)。

圖4 鬼箭錦雞兒幼苗在不同CO2濃度(C)和溫度(T)條件下的蒸騰速率和水分利用效率Fig.4 Evaporation and Water use efficiency of C. jubata under CO2 concentration and alternating temperatures in growth chamber

2.2 eCO2和eT對鬼箭錦雞兒抗氧化系統(tǒng)的影響

停止?jié)菜?土壤含水量(SWC, Soil water content)、葉片MDA及H2O2含量的變化如圖 5所示。SWC下降了62.5%—78.0%,達(dá)到極度干旱程度。MDA在4種處理中均有不同程度的升高。T2條件下MDA升高了109.1%(C1)和129.5%(C2)；而T1條件下只升高了17.7%(C1)和42.0%(C2)。同樣,T2條件下H2O2增加了82.6%(C1)和186.7(C2)；而T1條件下只升高了39.6%(C1)和16.9%(C2)。eT 加劇了MDA和H2O2的增加,eCO2只減緩了T1條件下H2O2的增加。

圖5 停止?jié)菜蟛煌珻O2濃度(C)和溫度(T)條件下土壤含水量、葉片丙二醛和H2O2含量的變化Fig.5 Changes of soil water content, malondialdehyde and H2O2 contents in leaves of C. jubata seedlings grown under CO2 concentration and alternating temperatures subjected to drought stress

停止?jié)菜?各種抗氧化酶活性的變化情況如圖6所示。隨著土壤水分含量的降低,SOD酶表現(xiàn)出活性下降的趨勢,C1T1條件下SOD酶活性下降最多,達(dá)40.5%(20 d)。在控水期間,C2T1的SOD酶活性水平保持最高,C2T2的SOD水平持續(xù)最低。eCO2對常溫下的SOD酶活性有一定的促進(jìn)作用。隨干旱程度的增加,CAT酶在eT和eCO2條件下活性下降了36.9%(C1T2)—71.7%(C2T2),但在C1T1條件下升高。溫度增加3℃,POD酶及APX酶整體活性均明顯降低。GR酶在不同溫度下表現(xiàn)出不同的變化趨勢,T1條件下GR升高了57.2%(C2)—160.1%(C1)；T2條件下為先升再降,15 d時(shí)GR升高了24.6%(C2)—86.0%(C1),隨后下降,eT表現(xiàn)出對GR的抑制作用。eCO2使得MDHAR活性表現(xiàn)出不同的變化趨勢,C1條件下升高了44.5%(T1)和53.9%(T2)而C2條件下先升再降。因此,溫度升高對幼苗葉片抗氧化酶活性產(chǎn)生抑制作用,但eCO2未表現(xiàn)出明顯的保護(hù)作用。

圖6 停止?jié)菜蟛煌珻O2濃度(C)和溫度(T)條件下鬼箭錦雞兒葉片抗氧化酶活性的變化Fig.6 Changes of antioxidant enzymes′ activities in leaves of C. jubata grown under CO2 concentration and alternating temperatures subjected to drought stress

控水條件下,抗氧化劑含量的變化如圖7所示。GSH在控水15d后增加了17.6%(C1T1)—151.2%(C1T2),但隨后下降。AsA含量在C2T1條件下下降了41.0%(15d),在其他3種情況下升高了73.6%(C1T1)—227.8%(C1T2)。環(huán)境溫度增加3℃,葉片抗氧化劑GSH平均水平下降15.4%(C1)—31.1%(C2),ASA平均水平下降了27.2%(C2)—47.5%(C1)。CO2濃度倍增使兩種溫度條件下的ASA水平增加,但只對常溫條件下GSH水平有促進(jìn)作用。因此,溫度增加對抗氧化劑有抑制作用,eCO2有一定的保護(hù)作用。

圖7 停止?jié)菜蟛煌珻O2濃度(C)和溫度(T)條件下鬼箭錦雞兒葉片抗氧化劑含量的變化Fig.7 Changes of antioxidant content in leaves of C. jubata grown under CO2 concentration and alternating temperatures subjected to drought stress

3 討論

環(huán)境溫度和CO2濃度升高將對植物生長產(chǎn)生較大影響。溫度升高和CO2濃度升高可協(xié)同促進(jìn)植物生長和光合能力[32],高水平CO2對高溫下的光合器官有保護(hù)作用[33]。溫度增加促進(jìn)正常水分條件下小葉錦雞兒(C.microphylla)生長[17],增加中間錦雞兒(C.intermedia)及蒙古巖黃耆(Hedysarummongolicum)幼苗生物量和根莖比[34],但CO2濃度倍增沒有增加紫花苜蓿(MedicagasativaL.)的生物量,也并未對黑麥草(LoliumperenneL.)表現(xiàn)出保護(hù)作用[19]。Way和Oren[12]從63個(gè)研究中得出結(jié)論,生長在高海拔或高緯度的樹種可能是受溫度限制的,所以環(huán)境溫度升高將對其生物量、株高等產(chǎn)生有益的影響,至少在最初對溫度升高應(yīng)表現(xiàn)出正響應(yīng)。因此我們預(yù)測溫度升高和CO2濃度倍增有利于高寒區(qū)灌木的生長。然而,我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,溫度升高3℃顯著降低了幼苗的總生物量、凈光合速率和相對生長速率,雖然eCO2有一定的促進(jìn)生長作用,但eT對幼苗生長的影響要更大些(表1)。溫度升高和CO2濃度倍增并沒有協(xié)同促進(jìn)幼苗的生長和光合能力,可能因?yàn)橛酌绲纳L并非溫度限制,也可能是由于物種的特性。預(yù)示著溫度增加將對高寒區(qū)灌木幼苗生長產(chǎn)生不利影響,eCO2可緩解增溫的影響,兩者無協(xié)同促進(jìn)作用。

溫度和CO2濃度升高可能對植物的生長和生理過程有對抗性的作用[35]。空氣中CO2濃度增加一般會(huì)促進(jìn)樹木地上植株的生長和發(fā)育[36],增加植物的根系面積,促進(jìn)根系分泌物的釋放,改變根際微生物的多樣性,也可能會(huì)增加植物的呼吸作用和光合速率[37]。過高的溫度將會(huì)抑制植物的生長、光合和水分利用效率。我們的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,溫度升高和CO2富集對幼苗生長有對抗性作用,兩者無交互作用(表1)。溫度增加使得LMR、LAR增加,BAMR、RMR、RSR下降,說明溫度增加有利于葉生物量及葉面積增加,葉片變??；相反CO2濃度增加使LMR、LAR下降,BAMR、RMR、RSR升高,說明CO2濃度倍增促進(jìn)根系的生長,增加葉片厚度。因此,CO2濃度升高可以促進(jìn)幼苗根系發(fā)育,進(jìn)而增加對土壤養(yǎng)分和水分的利用；相反,溫度增加促進(jìn)更多碳同化物分配至地上部分。

SOD、POD、“抗壞血酸-谷胱甘肽循環(huán)” (ASA-GSH cycle)是旱生錦雞兒屬植物抵御干旱,保護(hù)細(xì)胞正常的生理活動(dòng),適應(yīng)干旱環(huán)境的物質(zhì)基礎(chǔ)。CAT在抵御干旱,保護(hù)細(xì)胞正常生理活動(dòng)中作用有限[38]。高的CO2濃度可以減輕由干旱和高溫對植株細(xì)胞膜產(chǎn)生的氧化傷害[17]。植物也可以通過吸收更多的碳來應(yīng)對未來升溫的影響[39]。鬼箭錦雞兒長期生活在高寒地區(qū),其抗氧化系統(tǒng)對干旱脅迫表現(xiàn)出不同的響應(yīng)。SOD酶活性隨SWC的下降而表現(xiàn)出下降的趨勢,CO2增施可以使SOD酶活性增加(T1)；但溫度增加后,CO2增施不能提高SOD活性。說明升溫條件下,eCO2不能增強(qiáng)其抗性,推測可能是高寒植物的SOD酶對溫度敏感。同樣,環(huán)境溫度增加使得POD、APX、GR酶活性降低,ASA和GSH含量降低,也說明溫度增加對抗氧化系統(tǒng)的影響較大。雖然eCO2可以增加抗氧化劑含量,但eCO2只減緩了T1條件下H2O2的增加,說明溫度增加加劇了干旱脅迫對植株的傷害,eCO2只能部分的緩解這種不利影響。已有研究表明高濃度CO2可促進(jìn)ASA合成或降低消耗[40],我們的研究中也發(fā)現(xiàn)CO2濃度倍增使GSH和ASA整體水平提高,暗示著環(huán)境變化對抗氧化劑水平的影響。研究推測高寒區(qū)灌木抗氧化系統(tǒng)對溫度敏感,eCO2可能會(huì)促進(jìn)抗氧化劑生成以減弱ROS對細(xì)胞膜的損害。

研究預(yù)測,未來氣候變化將會(huì)對高寒區(qū)灌木生長及生理產(chǎn)生重大影響。溫度增加可抑制植物的生長和光合能力,抑制抗氧化酶活性和抗氧化劑含量。CO2濃度增加可緩解增溫的影響,促進(jìn)根的發(fā)育。增溫對高寒區(qū)植物的影響要大于CO2濃度增加對植物的影響。

結(jié)論：(1)溫度升高和CO2濃度升高沒有協(xié)同促進(jìn)鬼箭錦雞兒幼苗的生長和光合能力。溫度升高將會(huì)對鬼箭錦雞兒幼苗生長產(chǎn)生不利影響,CO2濃度升高促進(jìn)地下部分的生長。(2)高寒植物的抗氧化系統(tǒng)對溫度敏感,CO2濃度升高可能通過抗氧化劑的增加來部分緩解不利影響(3)CO2濃度升高可緩解增溫對幼苗生長和抗氧化系統(tǒng)的影響。

致謝：種子采集得到甘肅省科學(xué)院生物研究所麻和平、張文奇老師的幫助,試驗(yàn)過程得到蘭州大學(xué)張仁懿老師的幫助,特此致謝。