王 艷, 張士春, 周 進(jìn)

(1. 深圳職業(yè)技術(shù)學(xué)院，深圳 518055; 2. 深圳市水產(chǎn)行業(yè)協(xié)會(huì)，深圳 518055; 3. 清華大學(xué) 深圳研究生院, 深圳 518055)

群體感應(yīng)(Quorum sensing，QS)是細(xì)菌間的密度調(diào)節(jié)信號，被視為細(xì)菌的通訊語言。根據(jù)細(xì)菌分類、信號分子和感應(yīng)機(jī)制的不同，QS系統(tǒng)主要分為3類：LuxR/AI-I系統(tǒng)(主要是革蘭氏陰性菌)，LuxS/AI-2寡肽類系統(tǒng)(革蘭氏陽性菌為主、陰性菌為輔)，以及適應(yīng)于種間交流的AI-3系統(tǒng)[1]。至今已確認(rèn)多種AI-1和AI-2信號，如?；呓z氨酸內(nèi)酯(N-acyl homoserine lactones，AHLs)，寡肽類化合物、芳香醇類化合物、二酮哌嗪類化合物(Di-keto-piperazines, DKP)，2-庚基-3-羥基-4-喹啉 (2-Heptyl-3-hydroxy-4-quinolone)以及呋喃硼酸二酯(Furanosyl borate diester)等[2]。這些信號的存在可調(diào)節(jié)細(xì)菌的群體行為以應(yīng)對環(huán)境的變化，包括生物熒光的產(chǎn)生、生物被膜(biofilm)的形成、毒力基因的表達(dá)以及環(huán)境條件的適應(yīng)等[3]。

目前，以AHL分子為代表的AI-1類信號物是研究最為廣泛的一種，大量應(yīng)用于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，如開發(fā)抗生素替代藥品，合成AHL降解酶或阻斷劑降低細(xì)菌的感染能力以及封閉有害菌的毒素分泌開關(guān)等[4]。此外，在醫(yī)藥中應(yīng)用AHL系統(tǒng)的另一個(gè)典型例子是抑制微生物被膜的產(chǎn)生。微生物被膜的形成與病原菌的耐藥性息息相關(guān)[5]，而AHL對細(xì)菌膜的形成、發(fā)展與成熟具有直接的調(diào)節(jié)作用[5]。因此，通過調(diào)控AHL系統(tǒng)來干擾病原菌生物被膜的形成是控制細(xì)菌性疾病的有效手段。近10年來，隨著AHL認(rèn)識(shí)的深入和學(xué)科交叉的發(fā)展，AHL的應(yīng)用領(lǐng)域得到進(jìn)一步延伸，已擴(kuò)展到污水治理、海洋防污、生態(tài)修復(fù)以及健康養(yǎng)殖等領(lǐng)域[6]。

為了在微生物領(lǐng)域更多地挖掘和開發(fā)AHL菌株或AHL產(chǎn)物，針對AHL分子的有效檢測成為人們關(guān)心的議題。目前用于檢測AHL信號的方法主要包括生物檢測和理化檢測。前者主要是利用報(bào)告基因(如luxAB、lacZ及gfp等)構(gòu)建生物感應(yīng)器或報(bào)告菌株，如紫色色桿菌(Chromobacteriumviolaceum) CV026、根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens) A136和KYC55等，通過顯色反應(yīng)來判斷信號的存在[7]。后者一般使用色譜技術(shù)，如液相色譜(HPLC)，該方法不僅能定量、定性分析信號分子的性質(zhì)，同時(shí)還可以連接質(zhì)譜、核磁共振來鑒定化合物的結(jié)構(gòu)[8]。然而，HPLC操作復(fù)雜、費(fèi)用昂貴、人員專業(yè)背景要求高，限制了其推廣的步伐；另一種相對簡單的色譜技術(shù)為薄層色譜(Thin Layer chromatograph，TLC)，它在精確性上雖不如HPLC靈敏，但是操作簡單、使用靈活、無需昂貴儀器，在成本上具有顯著優(yōu)勢，因而備受定性檢測的青睞[9]。傳統(tǒng)的TLC檢測法，即采用報(bào)告菌株、水解顯色劑X-gal以及半固體培養(yǎng)基三者混合后平鋪于TLC板上，通過生物顯色反應(yīng)來進(jìn)行AHL物質(zhì)的判斷。但該檢測方法存在一些不足，包括顯色不均勻、藍(lán)色斑點(diǎn)有浸潤、顯色圈過大及視覺效果有偏差等問題。因此有必要進(jìn)行優(yōu)化與改進(jìn)，建立一種更為有效、分辨率更高的檢測技術(shù)。因此我們開發(fā)了一種基于制膠板的TLC方法，以期改觀傳統(tǒng)方法在操作程序和檢測結(jié)果上的不足。

1 研究方法

1.1 菌株及試劑

實(shí)驗(yàn)中所用AHL檢測菌株為根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens) A136 (pCF218)，培養(yǎng)條件為LB培養(yǎng)基(包含壯觀霉素Sp 50 μg/mL 和四環(huán)素Tc 4.5 μg/mL)。另一種菌株為銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa) PAO1，它具有產(chǎn)C4-AHL和3-oxo-C12-AHL的能力，在本次實(shí)驗(yàn)中作為AHL模式菌株。

壯觀霉素Sp、四環(huán)素Tc、X-gal(5-溴4-氯3-吲哚β-半乳糖苷)、AHL標(biāo)準(zhǔn)品C6-(貨號10940-25MG)，3-O-C8-(貨號17247-25MG)，C9-(貨號17650-25MG)，C11-(貨號10937-25MG)和C14-AHL(貨號09139-25MG)購自Sigma公司，RP-C18 F254s 反相薄層板(TLC板)購自德國Merck公司。

LB(Luria-Bertani)液體培養(yǎng)基的制備，準(zhǔn)確稱取蛋白胨(Typtone) 1.0 g，酵母提取物(Yeast Extract) 0.5 g，氯化鈉(NaCl) 1.0 g，加雙蒸水(ddH2O) 至100 mL，充分混勻溶解，高壓蒸汽滅菌(121℃)15 min。LB半固體培養(yǎng)基(軟培養(yǎng)基)的制備采用在上述LB液體成分中加入1%的瓊脂粉后滅菌制得。

其他化學(xué)試劑包括二甲基亞楓DMSO、乙酸乙酯、甲醇、乙醇以及醋酸等，均為分析純，購置于上海國藥試劑公司。

1.2 銅綠假單胞菌(P. aeruginosa)PAO1 AHL化合物的抽提

將單克隆PAO1菌株接種于10 mL液體LB培養(yǎng)基中，過夜培養(yǎng)得到一級種子，將一級種子加入到含有500 mL LB液體培養(yǎng)基于30 ℃、220 r/min條件下擴(kuò)大培養(yǎng)24 h。收集發(fā)酵液，4 ℃離心20 min(6000 r/min)，用0.22 μm的濾膜對離心的上清進(jìn)行過濾除雜。收集到的上清液與乙酸乙酯1∶1混合，裝于1L分液漏斗中充分混合，萃取30 min。獲得有機(jī)相在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上進(jìn)行蒸餾(45 ℃)，風(fēng)干的抽提物用1 mL甲醇溶解，用1.0 μm的有機(jī)相濾膜進(jìn)行過濾，得到AHL分子提取物。

1.3 制膠板的設(shè)計(jì)

根據(jù)待鋪TLC薄層板的大小(20.0 cm×20.0 cm)，設(shè)計(jì)了一個(gè)外部尺寸為20.5 cm×20.5 cm的制膠板，其中內(nèi)部使用面積20.2 cm×20.2 cm，四周帶有凹槽(配有4根插條，插條高度0.5 cm)，用于制作半固體培養(yǎng)基的基座，具體如圖1所示。制膠板的制作材料為有機(jī)玻璃(亞克力，型號PMMV-0A1，深圳)。

A：顯示主板平面圖和4根插條，主板四周設(shè)計(jì)有凹槽；B：顯示安裝好插條的平面圖；C：示裝好插條的側(cè)方圖

圖1用于制備半固體培養(yǎng)基的制膠板

Figure 1 The preparing-gel plate for making the semi-solid medium

1.4 改良型TLC法的操作步驟

傳統(tǒng)TLC法：將AHL標(biāo)準(zhǔn)品2～3 μL點(diǎn)樣于C18反相薄層板上，以甲醇/水(60∶40，V/V)作為流動(dòng)相充分展開后，揮干溶劑，按文獻(xiàn)[7]的方法制備上層半固體培養(yǎng)基鋪于TLC板上。簡要操作方法如下：配置50 mL半固體LB培養(yǎng)基，滅菌后待冷卻到45 ℃左右(避免瓊脂凝結(jié)成塊)，無菌操作將過夜培養(yǎng)的3 mL 根癌農(nóng)桿菌A136菌液接入半固體培養(yǎng)基搖勻，再添加50 μL(60 μg/μL)的X-gal，輕搖后鋪于TLC板上，置于28 ℃培養(yǎng)箱48 h后觀察結(jié)果。此過程中根癌農(nóng)桿菌A136作為報(bào)告菌株檢測AHL信號，陽性為藍(lán)色，陰性為無色。

改良型TLC法：按上述同樣的方法點(diǎn)樣、跑板、揮干后，將后續(xù)的程序分解成兩步。操作方法如圖2所示。首先，用冷卻到45 ℃左右的100 mL半固體培養(yǎng)基與6 mL 根癌農(nóng)桿菌A136菌株混合，輕輕搖勻后鋪板，制備成厚度約為3～4 mm的薄層培養(yǎng)基，于室溫冷卻凝固。隨后，用除菌硬質(zhì)膠板托起整張凝固好的薄層培養(yǎng)基，一端輕輕接觸TLC板，緩慢覆蓋，以類似手機(jī)貼膜的方式向前平鋪，直至整張培養(yǎng)基完好貼合于TLC板上方，操作過程注意排除氣泡。最后，待貼合過程完成后，使用微生物涂布棒將100 μL濃度為20 μg/μL的X-gal均勻涂步于培養(yǎng)基上方，待X-gal液體吸收后，置于28 ℃培養(yǎng)箱，24～48 h后觀察結(jié)果。

不同碳鏈長度的AHLs經(jīng)薄層層析展開后，在有AHLs存在的區(qū)域會(huì)被報(bào)告菌株感應(yīng)，并在X-gal存在的情況下呈現(xiàn)藍(lán)色斑點(diǎn)。根據(jù)斑點(diǎn)的大小、位置、遷移率和顏色深淺可以定性AHLs的相對含量及其類別。

2 結(jié)果與分析

2.1 改良型TLC法顯色斑點(diǎn)質(zhì)量評價(jià)

以5種AHL標(biāo)準(zhǔn)品(C6-，3-o-C8-，C9-，C11-和C14-AHL)為材料，于薄層板上點(diǎn)樣，對比傳統(tǒng)方法和改良方法的差異。從對比結(jié)果(如圖3)可以看出，方法優(yōu)化后的斑點(diǎn)強(qiáng)度明顯提高，斑點(diǎn)直徑濃縮了1.4～1.9倍，薄層板遷移速率Rf的線性程度提高了30.5%。

A：準(zhǔn)備45 ℃的水域環(huán)境;B: 準(zhǔn)備100 mL 半固體LB培養(yǎng)基和5 mL過夜培養(yǎng)的A136菌株;C: 點(diǎn)好樣的TLC板(20.0 cm×20.0 cm，流動(dòng)相為甲醇∶水=6∶4);D: 插好叉條，制備半固體培養(yǎng)基膠片;E: 待培養(yǎng)基凝固后形成3～4 mm的薄片;F: 拆下插條;G：使用一張硬質(zhì)塑料片貼于膠面，手托薄片將制膠板反扣，分離出完成的凝固培養(yǎng)基;H：將固體培養(yǎng)基薄片輕輕貼于TLC板上;I: 涂布X-gal

圖2改良型TLC檢測方法

Figure 2 The modified TLC method

A：傳統(tǒng)型顯色斑點(diǎn)，“1、2、3、4和5”為標(biāo)準(zhǔn)品(C6-，C9-，C11-和3-o-C8-，C14-AHL);B：改良型TLC法的顯色斑點(diǎn)，1′、2′、3′、4′和5′所檢測樣品與A圖對應(yīng)。比較A、B 兩圖斑點(diǎn)直徑，B圖直徑比A圖縮小了1.4～1.9倍，灰度值提高；且線性遷移值Rf更好

圖3改良型TLC法顯色效果與傳統(tǒng)型方法的比較

Figure 3 Comparison of the results between the modified TLC method and the traditional method

2.2 傳統(tǒng)方法與改良方法的顯色效果

比較了3種碳鏈長度(C6-，C9-，C11-)的AHL標(biāo)準(zhǔn)品和5種碳鏈長度的混合物(C6-，3-O-C8-，C9-，C11-和C14-)在兩種方法下的顯色效果。由對比結(jié)果(如圖4)可知，單獨(dú)點(diǎn)樣時(shí)，改良型方法斑點(diǎn)擴(kuò)散程度小，顯色更清晰(圖4-A)；混合樣品下，改良方法顯色分辨率更高，視覺反襯效果更明顯(圖4-B)。

2.3 以銅綠假單胞菌為例比較傳統(tǒng)型和改良型TLC方法的效果

將銅綠假單胞菌的發(fā)酵液進(jìn)行抽提，獲得AHL粗提物，將改良型方法和傳統(tǒng)型方法進(jìn)行了對比，結(jié)果顯示改良型方法顯色視覺更美觀，效果更清晰(圖5)。該結(jié)果表明改良型方法不僅僅適用于標(biāo)準(zhǔn)品，也適用于天然來源的AHL提取物。

A:單獨(dú)點(diǎn)樣下兩種方法的比較;B:混合點(diǎn)樣下兩種方法的比較。箭頭所示為不同C鏈長度的標(biāo)準(zhǔn)物

圖4兩種方法的顯色效果比較

Figure 4 Comparison of the difference of between using the two methods

左邊示傳統(tǒng)方法，右邊是改良型方法。數(shù)字1～4為PAO1潛在的AHL分泌物，包括C4和3-O-C12

圖5以PAO1抽提物為材料的兩種方法比較

Figure 5 Comparison of the effects with the two methods taken PAO1 extract as the material

2.4 X-gal的用量對比

選用根癌農(nóng)桿菌A136作為報(bào)告菌株進(jìn)行X-gal用量的對比實(shí)驗(yàn)。傳統(tǒng)的方法是將X-gal添加到半固體培養(yǎng)基中，使用劑量為：在50 mL軟培養(yǎng)基中加入50 μL濃度為60 μg/μL的X-gal,按此劑量需要使用X-gal為3 mg(50 μL×60 μg/μL=3000 μg，即3 mg)。改良的方法是待培養(yǎng)基凝固后涂布，使用100 μL 濃度為20 μg/mL的X-gal，最終用量為2 mg。相比之下用量節(jié)省了三分之一，成本節(jié)省了33.3%(圖6)。

圖6 傳統(tǒng)方法和改良型方法在X-gal用量消耗和薄層板上的遷移效果的比較

3 討論

N-?；呓z氨酸內(nèi)酯類(AHL)化合物是革蘭氏陰性菌中最重要的一類群體感應(yīng)信號分子，調(diào)控多種生理基因的表達(dá)，參與菌群的多種生態(tài)功能?？焖佟⒑啽?、有效地檢測AHL信號分子成為深入研究和了解細(xì)菌通訊機(jī)制的重要手段[10]。一些新的檢測方法逐步開發(fā)，包括AI-1型和AI-2型[13-16]。目前利用報(bào)告菌株[如紫色色桿菌(Chromobacteriumviolaceum) CVO26、根癌農(nóng)桿菌(Agrobacteriumtumefaciens) A136]和TLC方法進(jìn)行偶聯(lián)是檢測 AHL 的有效手段，這主要得益于該方法簡單、快捷和易得，不需要昂貴的設(shè)備[11]。然而傳統(tǒng)的TLC方法在檢測限和視覺分辨率上仍存在些許不足，未能充分發(fā)揮其作用，限制了檢測范圍的延生。前期的使用中也有作者指出分辨率有進(jìn)一步提升的可能[12]。本實(shí)驗(yàn)在前人研究的基礎(chǔ)上，改進(jìn)了TLC方法的操作程序，通過設(shè)計(jì)制膠板將軟培養(yǎng)基的制作與顯色劑X-gal的涂布分成兩步進(jìn)行，有效避免了瓊脂培養(yǎng)基在凝固的過程中對薄層板表面的浸潤，使得藍(lán)色斑點(diǎn)更為集中，減少了顯色區(qū)域的彌散和拖尾，視覺分辨率更高。以AHL標(biāo)準(zhǔn)品為材料，將傳統(tǒng)方法與改良方法進(jìn)行Rf值和斑點(diǎn)形狀的比較，發(fā)現(xiàn)斑點(diǎn)直徑縮小了1.4～1.9倍，遷移率相關(guān)系數(shù)更接近于1。在實(shí)際的生物樣品中(銅綠假單胞菌AHL產(chǎn)物)，進(jìn)一步驗(yàn)證了改良法的敏感性和可行性，且證實(shí)該方法在檢測混合樣品中同樣具有適應(yīng)性。此外，對X-gal的用量減少了33.3%，有效地節(jié)省了實(shí)驗(yàn)成本。

本次優(yōu)化的步驟中，體現(xiàn)了以下幾點(diǎn)優(yōu)勢：首先，制膠板的設(shè)計(jì)保證了膠的質(zhì)量，能輕松做到培養(yǎng)基無滲漏、無破損、無氣泡，而且厚度均一，膠面平整；其次，待培養(yǎng)基凝固后再進(jìn)行鋪板，能有效減少凝固過程中水分在TLC薄層板上產(chǎn)生的張力，減少對待檢AHL信號的稀釋和擴(kuò)散，保證局部的AHL物質(zhì)維持原有濃度，致使顯色點(diǎn)不分散，檢測分辨率提高，視覺效果更好；最后，顯色劑X-gal沒有與待檢的AHL物質(zhì)直接接觸，減少了假陽性結(jié)果的發(fā)生概率，使得檢測的效果更能保真。綜合來看，該方法在AHL標(biāo)準(zhǔn)品和銅綠假單胞菌PAO1抽提物中均得到了較好的驗(yàn)證，證實(shí)改良型TLC方法除了適用于單一樣品，也適用于天然的混合物樣品，提升了檢測方法的有效性和普適性，具有廣闊的應(yīng)用前景。