蘇 潔，明紅霞，陳泉睿，張春鑫，關道明，樊景鳳

(1. 國家海洋環(huán)境監(jiān)測中心，大連 116023； 2. 國家海洋局近岸海域生態(tài)環(huán)境重點實驗室，大連 116023； 3. 大連海洋大學 水產(chǎn)與生命學院，大連 116023)

深海是全球最大的獨立系統(tǒng)，地球表面有超過50%的面積被深海大洋所覆蓋[1]。深海沉積物是集化學物質(zhì)和微生物于一體的特殊生態(tài)環(huán)境，同時海底沉積物還是營養(yǎng)元素進行生物地球化學循環(huán)的主要場所[2]。在深海沉積物中存在著活躍的微生物群落，負責介導有機碳的降解和轉(zhuǎn)化，在海洋和全球碳的生物地球化學循環(huán)中起著重要的作用[3]。深海沉積物中的微生物總量在全球生物量的比重已超過10%[4]。研究深海微生物多樣性不僅有利于開發(fā)利用新型微生物資源，也將為人類探索生命起源提供重要線索。隨著大洋鉆探計劃(ODP)多個航次的進行，太平洋邊緣海域沉積物中的細菌群落結(jié)構(gòu)及其優(yōu)勢類群已被逐步發(fā)現(xiàn)[5-8]。然而，由于深海獨特的環(huán)境特征如低溫、高壓、缺氧等，導致海底99%以上的微生物無法利用現(xiàn)有技術得到分離培養(yǎng)[9]，這使得基于16S rDNA的分子生物技術成為調(diào)查海底沉積物中微生物多樣性的一種重要手段。

目前，研究學者對南沙海區(qū)表層沉積物中細菌和古菌多樣性有了一些初步的了解，但研究對象主要為可培養(yǎng)細菌[10-11]。鑒于南沙海區(qū)廣闊的水域及其多變的生境，加之以往的研究還不能全面地反映南沙海區(qū)深海沉積物中細菌資源多樣性,為探討南沙海區(qū)深海沉積物中細菌多樣性，本研究運用16S rDNA克隆文庫的方法展開對南沙海區(qū)深海沉積物中細菌群落結(jié)構(gòu)的研究。

1 材料與方法

1.1 材料

2013年5月采集位于南沙群島東南海域的深海表層沉積物樣品(海水沉積物界面以下約5 cm)。采用箱式采泥器在南海3個不同站位分別采集樣品，樣品具體的信息描述如表1。

表1 南沙沉積物采樣站點及樣品描述

1.2 方法

1.2.1 沉積物細菌總DNA的提取與純化

沉積物細菌總DNA的提取參照本課題組前期建立的方法[12]。使用QIAquikPCR純化試劑盒對DNA進行純化。

1.2.2 細菌16S rDNA的PCR擴增

采用細菌16S rDNA的通用引物27 F和1492 R，反應條件參照前期研究[12]。擴增產(chǎn)物用1.0%(W/V)的瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.3 細菌16S rDNA克隆文庫的構(gòu)建及陽性克隆的篩選

采用藍白斑篩選方法篩選陽性克隆子并構(gòu)建16S rDNA克隆文庫[13]。

1.2.4 DNA序列系統(tǒng)進化分析

應用MEGA5.0軟件，采用鄰位相接法(Neighbour-Joining)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進化樹。

1.2.5 16S rDNA克隆文庫多樣性分析

采用克隆文庫的覆蓋度(Coverage)、Shannon-Wiener 指數(shù)及Simpson指數(shù)3個指標對構(gòu)建的細菌16S rDNA克隆文庫進行多樣性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 16S rDNA克隆文庫測序

對從3個深海站位沉積物樣品構(gòu)建的16S rDNA克隆文庫中共獲得的565個陽性克隆子，其中NSA站位為204個陽性克隆子，NSE站位為161個陽性克隆子，NSI站位為200個陽性克隆子。對上述3個站位獲得的陽性克隆子分別進行序列測定，將序列相同的克隆子定義為一個OTU，NSA、NSE和NSI 3個站位的OTU數(shù)目分別為25、18和22。

2.2 16S rDNA克隆文庫細菌多樣性指數(shù)

本實驗采集的3個樣品均來自深海，受陸源微生物的影響較小，因而可以較準確地反映出南沙海區(qū)微生物群落的多樣性。南沙海區(qū)沉積物樣品中細菌16S rDNA克隆文庫的覆蓋度都大于80%，部分接近90%，表明克隆文庫中所包含的細菌種類占沉積物樣品中全部細菌的比例已很高，庫容已經(jīng)足夠(表2)。細菌16S rDNA文庫的Shannon-Wiener指數(shù)值從高到低依次為NSI、NSA和NSE，說明3個站位中細菌多樣性程度最高的NSI站位，其次是NSA站位，較低的為NSE站位。

表2 16S rDNA克隆文庫細菌多樣性指數(shù)

2.3 16S rDNA克隆文庫系統(tǒng)發(fā)育分析

對南海NSA站位沉積物中測序得到的25個OTU用MEGA軟件進行系統(tǒng)發(fā)育分析，結(jié)果表明細菌克隆文庫中的大多數(shù)序列分屬于24個類群，9個門(圖1)。而群落優(yōu)勢菌依次為變形菌、浮霉菌和放線菌。其中，南海NSA站位共獲得55個變形菌序列(27%)，浮霉菌序列共獲得32個(15.6%)，放線菌序列共有28個(13.7%)。通過與GenBank文庫的比對發(fā)現(xiàn)，細菌16S rDNA克隆子的分布中變形菌門里α-Proteobacteria共有16條同源序列，3條序列是來自培養(yǎng)菌株，同源性都較高(89%～96%序列相似性)。分別是從鹽田中分離的玫瑰弧菌屬(Rhodovibrio)細菌、從土壤中分離的生絲微菌屬(Hyphomicrobium)細菌以及來自純培養(yǎng)的葉瘤桿菌科細菌Parvibaculumlavamentivorans，其余全部來自各種海洋環(huán)境中未培養(yǎng)的克隆子。γ-Proteobacteria有18條同源序列，其中有1條是來自土壤中分離的喜熱噬甲基菌屬(Methylocaldum)細菌，同源性一般(86%序列相似性)，其余17條序列全部來自各種海洋環(huán)境中未培養(yǎng)的克隆子。δ-Proteobacteria共有21條同源序列。其中2條同源序列來自可培養(yǎng)的菌株，其余的19條同源序列來自各種海洋環(huán)境中未培養(yǎng)的克隆子。放線菌類群共有28條同源序列，其中1條同源序列來自土壤中分離的鏈霉菌科細菌Streptacidiphilusthailandensis，同源性較低(82%序列相似性)，其余26條序列與來自卡斯卡底邊緣和Forearc海盆產(chǎn)甲烷水合物的深海沉積物中未培養(yǎng)的克隆子具有較高同源性(93%～99%序列相似性)。

NSE站位沉積物樣品中細菌克隆文庫中的大多數(shù)序列分屬于16個類群，8個門(圖2)。其中放線菌、變形菌和浮霉狀菌為優(yōu)勢菌。放線菌序列共獲得38個(23.6%)，變形細菌序列共獲得34個(20.4%)，浮霉菌序列共獲得27個(16.7%)。通過與GenBank文庫的序列比對發(fā)現(xiàn)，放線菌類群共有38條同源序列，其中有26條序列與來自卡斯卡底邊緣和Forearc海盆產(chǎn)甲烷水合物的深海沉積物中未培養(yǎng)的克隆子有較高的同源性 (91%～99%序列相似性)。其余全部來自各種海洋環(huán)境中未培養(yǎng)的克隆子。變形菌門中α-Proteobacteria共有10條同源序列，分別是從鹽湖中分離的硝化單胞菌屬(Nitrosomonas)細菌、從土壤中分離的根瘤菌屬(Rhizobium)細菌。γ-Proteobacteria有15條同源序列，其中有6條是來自土壤中分離的草螺菌屬(Herbaspirillum)細菌，同源性較高(93%序列相似性)。δ-Proteobacteria共有9條同源序列，其中5條同源序列來自可培養(yǎng)的菌株，其余的4條同源序列來自各種海洋環(huán)境中未培養(yǎng)的克隆子。浮霉菌類群共有27條同源序列，全部來自各種海洋環(huán)境中未培養(yǎng)的克隆子，其中15條同源序列分別來自日本海槽和地中海Kazan泥火山的深海冷泉沉積物，同源性較高(95%序列相似性)。

Phylogenetic tree and evolutionary distances are given by the neighbor-joining method. Numbers at each branch point indicate the percentage supported by bootstrap values based on 1000 replications. Bootstrap values>50% are shown at branching points. The same below

圖1NSA站位沉積物中細菌的16SrDNA基因序列系統(tǒng)進化分析

Figure 1 Phylogenetic analysis of the bacteria derived from sediments of NSA site according to 16S rDNA gene sequence

NSI站位站位沉積物樣品中細菌克隆文庫中的大多數(shù)序列分屬于21個類群，8個門(圖3)。其中變形菌、放線菌和浮霉狀菌為優(yōu)勢菌。變形細菌序列共獲得45個(22.5%)，放線菌序列共獲得36個(18%)，浮霉菌序列共有31個(15.5%)。通過與GenBank文庫的序列比對發(fā)現(xiàn)，變形菌門中α-Proteobacteria共有16條同源序列，全部來自各種海洋環(huán)境中未培養(yǎng)的克隆子。γ-Proteobacteria有21條同源序列，其中13條同源序列來自從海底淤泥中分離的脫硫桿菌屬細菌Desulfobacteriumindolicum，同源性較高(93%序列相似性)，其余8條序列全部來自巴倫支海HaakonMosby泥火山和墨西哥灣高鹽沉積物等，同源性較高(90%～97%序列相似性)。δ-Proteobacteria共有8條同源序列。其中4條同源序列來自可培養(yǎng)的菌株，其余的4條同源序列來自Forearc海盆產(chǎn)甲烷水合物的深海沉積物中未培養(yǎng)的克隆子。放線菌類群共有36條同源序列，其中有19條同源序列來自日本海槽和地中海Kazan泥火山的深海冷泉沉積物，同源性較高(96%序列相似性)，有6條同源序列來自卡斯卡底邊緣深海沉積物中未培養(yǎng)的克隆子。浮霉狀菌群共有31條同源序列，全部來自各種海洋環(huán)境中未培養(yǎng)的克隆子，其中15條同源序列分別來自卡斯卡底邊緣和Forearc海盆產(chǎn)甲烷水合物的深海沉積物中未培養(yǎng)的克隆子，同源性都極高(93%～96%序列相似性)。

圖2 NSE站位沉積物中細菌的16S rDNA基因序列系統(tǒng)進化分析

3 討論

在本實驗所選取的各站位深海沉積物中，廣泛存在的主要優(yōu)勢細菌類群均包括變形菌類群、浮霉菌類群和放線菌類群。其中，本研究中構(gòu)建的16S rDNA克隆文庫涵蓋了變形菌門中α-Proteobacteria(31.3%)、δ-Proteobacteria(40.3%)和γ-Proteobacteria (28.4%)3個亞門?？梢姡?Proteobacteria為優(yōu)勢亞群，這與南海西沙海槽沉積物中的結(jié)果一致[14]。然而在陸地土壤及海水環(huán)境中占優(yōu)勢的α-Proteobacteria在本研究中也占到了很高的比例，這與前期研究結(jié)果有較大差異[15]。但也有文獻報道，α-Proteobacteria被發(fā)現(xiàn)為日本深海沉積物中的第二大優(yōu)勢類群[16]。深海環(huán)境中的優(yōu)勢類群γ-Proteobacteria，在本研究中也被證實為南沙海區(qū)深海沉積物中的第三大優(yōu)勢類群。此外，本文從3個深海站位沉積物樣品中測序獲得的16S rDNA序列中變形菌的優(yōu)勢亞群也有所不同，這些研究結(jié)果的差異主要是由于地理環(huán)境或氣候環(huán)境不同所導致，而且即使在相近地點菌群也會有所差異。在本研究中，放線菌為另一優(yōu)勢類群，說明放線菌在深海沉積物中的豐度較高，這也與南海其他海區(qū)沉積物中的報道相一致[17-19]。除上述幾種優(yōu)勢類群外，浮霉菌在本研究的細菌類群中也占到很大比例，這與孫慧敏等[1]在南海北部巴士海峽深海沉積物研究中的結(jié)果相一致。研究顯示，該類群一般較多分布在淺海沉積物中，分析可能的原因為淺海來源的細菌由于物理遷移(風、潮汐等)等影響在深海海區(qū)沉積下來，并形成其優(yōu)勢菌。另外，我們從南沙海區(qū)獲得的少數(shù)16S rDNA序列與發(fā)表在基因庫中的16S rDNA序列表現(xiàn)出一定的差異，這一結(jié)果一方面說明細菌文庫的多樣性比較高；另一方面表明南沙海區(qū)仍存在一些未知種群。因此，研究中國南沙海區(qū)沉積物細菌的多樣性，將進一步豐富對海洋細菌多樣性的認識，為我們探究南海的細菌資源奠定基礎。

圖3 NSI站位沉積物中細菌的16S rDNA基因序列系統(tǒng)進化分析