馬婷婷，左琳，陳嬌

(夸克俠醫(yī)藥科技<遼寧>有限公司生物分析中心，遼寧 本溪 117000)

帕金森病(PD)是最常見(jiàn)的神經(jīng)退行性疾病之一，僅次于阿爾茨海默病[1]。帕金森病的主要特征是一系列被稱為帕金森癥的運(yùn)動(dòng)癥狀，包括震顫、肌強(qiáng)直、運(yùn)動(dòng)遲緩以及姿勢(shì)平衡障礙[2]。研究發(fā)現(xiàn)，50%以上的PD患者會(huì)伴發(fā)錯(cuò)覺(jué)、幻覺(jué)、妄想等精神癥狀[3]。在疾病的初始階段，左旋多巴是改善PD運(yùn)動(dòng)癥狀最有效的療法，左旋多巴的治療重點(diǎn)是緩解癥狀，恢復(fù)多巴胺水平，改善運(yùn)動(dòng)癥狀[4-6],但長(zhǎng)期應(yīng)用多巴胺制劑，會(huì)引發(fā)躁狂、視幻覺(jué)、妄想癥和偏執(zhí)癥等精神病癥副作用[7]。實(shí)驗(yàn)證明多巴胺激動(dòng)劑的治療方式可延緩運(yùn)動(dòng)障礙的發(fā)生。PD首選治療方法為盡可能減少抗帕金森藥物多巴胺劑量，聯(lián)合抗精神病藥對(duì)于治療藥物誘發(fā)的精神精神障礙有效[8-10]。由于大多數(shù)抗精神病藥物在改善精神病方面具有相似的療效，臨床上在選用精神病藥時(shí)主要考慮其不良反應(yīng)。臨床常用氯氮平，喹硫平治療帕金森精神病，但是這兩種藥不良反應(yīng)較大，氯氮平對(duì)帕金森病最常見(jiàn)的副作用是過(guò)度鎮(zhèn)靜、直立性低血壓、流涎和粒細(xì)胞減少,并且證實(shí)氯氮平的使用與死亡率、癲癇發(fā)作、心肌炎和其他心血管和呼吸系統(tǒng)疾病的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)；喹硫平最常見(jiàn)的副作用為體位性低血壓、過(guò)度鎮(zhèn)靜，與氯氮平相比，不能改善震顫[11-12]。由Acadia制藥公司研發(fā)的治療帕金森精神病的新型藥物匹莫范色林，屬于有效的5-HT2A反向激動(dòng)劑,對(duì) 5- HT2A受體具有較高的親和力,而對(duì)5- HT2C受體親和力低，特別是對(duì)多巴胺D2受體或組胺受體幾乎無(wú)作用[13-14]，與非典型抗精神病藥物不同的是，匹莫范色林選擇性高、耐受性好，即使在高劑量下也不會(huì)誘發(fā)過(guò)氧化氫癥，或引起運(yùn)動(dòng)效應(yīng),無(wú)嚴(yán)重不良反應(yīng)[15]。2016 年 4 月 29 日，匹莫范色林成為美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局(FDA)批準(zhǔn)的首個(gè)用于治療伴有幻覺(jué)和妄想等精神癥狀的帕金森病患者的藥物[16]。

然而，匹莫范色林作為一種新藥，藥物動(dòng)力學(xué)信息有限。目前關(guān)于匹莫范色林藥物代謝動(dòng)力學(xué)的系統(tǒng)研究較少，因此，更有必要對(duì)體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)特征進(jìn)行更進(jìn)一步的研究。在本研究開(kāi)發(fā)并驗(yàn)證了一種專屬、靈敏、快速的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(LC-MS/MS)法，測(cè)定比格犬血漿中匹莫范色林的質(zhì)量濃度，并將所驗(yàn)證的方法應(yīng)用于匹莫范色林在比格犬體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究[7]，為匹莫范色林在人體內(nèi)的藥代動(dòng)力學(xué)研究提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 試劑與試藥 匹莫范色林對(duì)照品(純度為98.0%，中國(guó)食品藥品檢定研究院)；卡馬西平對(duì)照品(純度99.7%，中國(guó)食品藥品檢定研究院)；匹莫范色林片[17 mg/片，夸克俠醫(yī)藥(遼寧)有限公司]；乙腈(色譜純，Sigma-Aldrich公司)，異丙醇(色譜純，成都市科隆化學(xué)品有限公司)；甲酸(色譜純，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司)；甲基叔丁基醚(色譜純，成都市科龍化工試劑廠)；純凈水(廣州屈臣氏食品飲料有限公司)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性比格犬8只，體重9.5～12.3 kg，購(gòu)于北京瑪斯生物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0001；實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK(遼)2018-0009。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物房通風(fēng)良好，裝備空調(diào)，溫度保持在16～26 ℃，濕度保持在40%～70%，明暗照明各12 h，每只比格犬均用耳部文身標(biāo)記，并在籠具上標(biāo)注試藥編號(hào)與劑量。

2 方法與結(jié)果

2.1 給藥方案與血樣采集 健康比格犬8只，給藥前禁食12 h，自由飲水。灌胃給藥1片(劑量17 mg/片)。采用比格犬前肢隱靜脈取血方式，受試者于給藥前(0 h)及給藥后5 min、10 min、15 min、20 min、30 min、45 min、60 min、1.25 h、1.5 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h、24 h采血約0.5 mL，置于含肝素鋰的采血管中，立即于4 ℃離心機(jī)以4 000 rpm離心10 min，取血漿-20 ℃冷凍保存。

2.2 色譜條件和質(zhì)譜條件 色譜柱為Eclipse XDB-C18(4.6 mm×150 mm,3.5 μm)；流動(dòng)相A：水(含5%乙腈，0.1%甲酸)，流動(dòng)相B：乙腈(含0.1%甲酸)，流速1.2 mL·min-1，梯度洗脫程序?yàn)椋? min，30%B；1 min，95%B；3.6 min，95%B；3.61 min，30%B；4.5 min，30%B。柱溫40 ℃，自動(dòng)進(jìn)樣器溫度4 ℃，進(jìn)樣量為5 μL。

質(zhì)譜方法：AB4500三重四級(jí)桿串聯(lián)質(zhì)譜儀(AB Sciex,USA)，離子源為ESI源，檢測(cè)方式為正離子檢測(cè)，掃描方式為多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)方式，定量分析時(shí)的離子對(duì)分別為m/z： 428.4→223.2(匹莫范色林)、m/z：237.0→193.9(卡馬西平，內(nèi)標(biāo))，噴霧電壓(IS)：5 500 V，源溫度(TEM)：550 ℃，氣簾氣(CUR)：25 psi，霧化氣(GS1,GS2)為55 psi，碰撞氣(CAD)：8 V，質(zhì)譜入口電壓(EP)分別為10.00和8.83，去簇電壓(DP)分別為110.0和100.0，碰撞能(CE)分別為25.0和29.0，碰撞室出口電壓(CXP)分別為7.0和13.8。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備 取匹莫范色林對(duì)照品約10 mg，精密稱定，置于30 mL稱量瓶中，用80%乙腈(含0.1%甲酸)溶液稀釋至1.000 mg·mL-1。精密移取上述儲(chǔ)備液適量，用80%乙腈(含0.1%甲酸)溶液稀釋，獲得濃度為1、2、10、20、100、200、360和400 ng·mL-1的匹莫范色林標(biāo)準(zhǔn)工作溶液及濃度為3、40和320 ng·mL-1的質(zhì)控(QC)工作溶液。取卡馬西平對(duì)照品10 mg，精密稱定，置于30 mL稱量瓶中，用80%乙腈(含0.1%甲酸)溶液稀釋至1.000 mg·mL-1的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液。用純凈水將內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液逐級(jí)稀釋至5 ng·mL-1的內(nèi)標(biāo)工作溶液。

2.4 血漿樣品的制備 取待測(cè)血漿樣本100 μL，加入內(nèi)標(biāo)工作溶液(含卡馬西平：5 ng·mL-1)50 μL，渦旋1 min，加入1 mL甲基叔丁基醚，渦旋2 min，于10 ℃、10 000 rpm離心10 min。取上清液800 μL，于40 ℃真空離心濃縮至干燥。加入復(fù)溶劑(乙腈含1%甲酸)100 μL，渦旋2 min，取上清液5 μL進(jìn)樣分析。

2.5 方法學(xué)確證

2.5.1 選擇性 分別取6個(gè)不同來(lái)源的比格犬空白血漿，按照“2.4”項(xiàng)下(無(wú)內(nèi)標(biāo)無(wú)待測(cè)物)的方法進(jìn)行處理，進(jìn)樣分析。結(jié)果表明比格犬空白血漿樣品中干擾組分的響應(yīng)低于當(dāng)批次LLOQ待測(cè)物響應(yīng)均值的20%及內(nèi)標(biāo)響應(yīng)均值的5%，比格犬血漿中的內(nèi)源性物質(zhì)不干擾分析物和內(nèi)標(biāo)的定量分析，該方法具有良好的專屬性(見(jiàn)圖1)。

圖1 比格犬血漿中匹莫范色林(Ⅰ)和卡馬西平(Ⅱ)的典型MRM色譜圖

2.5.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線和定量下限 精密量取空白血漿190 μL，分別加入匹莫范色林標(biāo)準(zhǔn)工作溶液各10 μL，配制成含匹莫范色林分別為0.05、0.1、0.5、1、5、10、18、20 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)曲線血漿樣品，取出100 μL上述樣本，其余過(guò)程依照“2.4”項(xiàng)下操作，進(jìn)樣分析。以待測(cè)物濃度為橫坐標(biāo)(X)、待測(cè)物與內(nèi)標(biāo)物的峰而積比值為縱坐標(biāo)(Y)，采用加權(quán)最小二乘法(權(quán)重1/X2)進(jìn)行回歸運(yùn)算，求得標(biāo)準(zhǔn)曲線方程。試驗(yàn)結(jié)果表明，匹莫范色林在0.05～20 ng·mL-1濃度范圍內(nèi)r均大于0.99，線性關(guān)系良好，定量下限為0.05 ng·mL-1。

2.5.3 精密度和準(zhǔn)確度 精密量取空白血漿190 μL，分別加入匹莫范色林質(zhì)控工作溶液各10 μL，配制成血漿中匹莫范色林濃度分別為0.15、2、16 ng·mL-1的質(zhì)控樣品，取出100 μL上述樣本，其余過(guò)程參照“2.4”項(xiàng)下。取定量下限樣品及低、中、高濃度質(zhì)控樣品進(jìn)樣分析，進(jìn)行批內(nèi)與批間精密度準(zhǔn)確度和精密度考察。每個(gè)濃度6樣本，連續(xù)考察3個(gè)分析批?？疾旖Y(jié)果見(jiàn)表1，精密度和準(zhǔn)確度均滿足生物樣品定量測(cè)定的要求。

表1 批內(nèi)和批間精密度和準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果

2.5.4 提取回收率和基質(zhì)效應(yīng) 采用低、中、高3個(gè)濃度的質(zhì)控樣品評(píng)估匹莫范色林的提取回收率與基質(zhì)效應(yīng),正常處理的質(zhì)控樣品與來(lái)空白血漿(分別取6個(gè)不同個(gè)體的比格犬)提取后加入標(biāo)準(zhǔn)溶液的樣品響應(yīng)值的比值為提取回收率；空白血漿提取后加入標(biāo)準(zhǔn)溶液的樣品與相同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液響應(yīng)值的比值為基質(zhì)效應(yīng)。本試驗(yàn)所得基質(zhì)效應(yīng)值均經(jīng)內(nèi)標(biāo)歸一化校正。結(jié)果顯示，低、中、高3個(gè)濃度質(zhì)控樣品提取回收率的均值分別為61.2%、62.4%，63.2%，同法考察得內(nèi)標(biāo)的提取回收率66.7%。低、中、高3個(gè)濃度的質(zhì)控樣品基質(zhì)效應(yīng)均值分別為1.017、1.026、1.000，表明基質(zhì)效應(yīng)可忽略不計(jì)。

2.5.5 樣品穩(wěn)定性 采用低、高2個(gè)濃度的質(zhì)控樣品考察比格犬血漿中匹莫范色林的穩(wěn)定性，考察的條件分別為未處理血漿樣品室溫條件下放置20 h、處理后樣品室溫放置25 h、運(yùn)輸穩(wěn)定性、自動(dòng)進(jìn)樣器(4 ℃)放置48 h、凍融循環(huán)5次、-20 ℃長(zhǎng)期穩(wěn)定性(放置29 d)、-70 ℃長(zhǎng)期穩(wěn)定性(放置31 d)，依照“2.4”項(xiàng)下處理，各濃度水平進(jìn)行6樣本分析。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2，表明低、高2個(gè)濃度的質(zhì)控樣品在各條件下，匹莫范色林濃度無(wú)明顯變化，穩(wěn)定性良好。

表2 低、高2個(gè)濃度的質(zhì)控樣品在不同條件下的穩(wěn)定性

2.5.6 稀釋可靠性 配制高于定量上限的血漿樣本，加入空白血漿稀釋5倍后參照“2.4”項(xiàng)下處理樣品，進(jìn)行6樣本分析。試驗(yàn)結(jié)果表明，測(cè)得樣品濃度的RE和CV%均小于15%，表明高濃度樣本稀釋5倍后測(cè)得的準(zhǔn)確度良好。

2.5.7 殘留效應(yīng) 定量上限樣品后注射空白樣品來(lái)評(píng)估殘留。結(jié)果顯示，空白血漿樣品中匹莫范色林響應(yīng)值未超過(guò)當(dāng)日檢測(cè)定量下限最低響應(yīng)值的20%，內(nèi)標(biāo)干擾物的最大響應(yīng)值未超過(guò)當(dāng)日檢測(cè)內(nèi)標(biāo)平均響應(yīng)值的5%，表明殘留效應(yīng)考察符合要求。

2.6 比格犬體內(nèi)藥代動(dòng)力學(xué)研究 8只健康比格犬單劑量口服匹莫范色林片后平均血藥濃度-時(shí)間曲線見(jiàn)圖2。使用WinNonlin 6.1軟件的NCA模塊計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)，結(jié)果見(jiàn)表3。結(jié)果表明，平均Cmax為5.608 ng·mL-1，平均Tmax為0.83 h。AUC0～24 h和AUC0～∞個(gè)體差異較大，且與文獻(xiàn)報(bào)道的受試者AUC0～24 h和AUC0～∞差異很大[17]，造成這種差異的原因可能是人與比格犬對(duì)匹莫范色林的吸收機(jī)制不同。因此有必要進(jìn)一步研究匹莫范色林在不同物種間和同一物種不同劑量的藥代動(dòng)力學(xué)特征，進(jìn)而論證其劑量與藥代動(dòng)力學(xué)和藥效學(xué)的相關(guān)性。

圖2 比格犬單劑量給藥后匹莫范色林的平均血藥濃度-時(shí)間曲線圖

表3 單劑量口服給藥后測(cè)得的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)

3 討論

本文首次建立了測(cè)定比格犬血漿中匹莫范色林的液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法。本方法簡(jiǎn)單、靈敏及快速，成功應(yīng)用于比格犬血漿中匹莫范色林的測(cè)定及其藥代動(dòng)力學(xué)研究，為進(jìn)一步研究匹莫范色林的藥理藥效、劑型改良及其臨床研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

方法開(kāi)發(fā)過(guò)程中，發(fā)現(xiàn)該化合物在系統(tǒng)中的殘留行為較為嚴(yán)重，為了降低殘留效應(yīng)，將流動(dòng)相中甲醇更換為乙腈，增強(qiáng)洗脫能力；嘗試不同洗脫能力的洗針液，分別為95%乙醇、異丙醇、混合溶液1(甲醇∶乙腈∶異丙醇∶水=1∶1∶1∶1，V∶V∶V∶V)、混合溶液2(甲醇∶乙腈∶異丙醇=1∶1∶1，V∶V∶V)，結(jié)果表明混合溶液2的洗脫能力較強(qiáng)，同時(shí)增加洗針程序中外洗時(shí)長(zhǎng)，結(jié)果顯示，優(yōu)化后的方法能夠有效控制殘留效應(yīng)，確保了殘留不影響準(zhǔn)確度和精密度。

考察了兩種不同的生物樣品前處理方法，蛋白沉淀法(PPT)和液液萃取法(LLE)。PPT法簡(jiǎn)便、快速，但此方法獲得的生物樣品化合物響應(yīng)較低不能滿足定量下限要求；而LLE法處理樣品干凈基質(zhì)干擾少，且樣品經(jīng)過(guò)濃縮后化合物響應(yīng)較高，確保使用該方法測(cè)定血漿樣品時(shí)穩(wěn)定、可靠。