宋僑，胡俊杰，白玉，鄭國華

(1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，中藥資源與中藥復(fù)方教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430065；2.馬應(yīng)龍藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司，湖北 武漢 430065)

馬應(yīng)龍麝香痔瘡膏是治療肛腸疾病的一種常用軟膏制劑[1]，具有活血消腫、清熱燥濕、去腐生肌[2]等功效。該處方主要由人工麝香、人工牛黃、珍珠、煅爐甘石、硼砂、冰片、琥珀等7味藥組成，7種藥材粉末組成的中間體的含量高低將直接影響最終制劑的含量，因此，控制中間體的質(zhì)量對于制劑質(zhì)量具有極其重要的意義?！吨袊幍洹?015年版中馬應(yīng)龍麝香痔瘡膏的含量測定是以煅爐甘石和冰片為檢測指標(biāo)，常規(guī)的分析方法采用配位滴定法和氣相色譜法。但該方法操作煩瑣、費(fèi)時費(fèi)力，無法實(shí)現(xiàn)在生產(chǎn)過程中大量樣品的含量檢測。因此，尋找出一種快速、高效的質(zhì)量分析方法具有重要意義。

近紅外光譜技術(shù)具有分析速度快、低成本、無樣品損耗[3-4]等優(yōu)點(diǎn)，在藥物分析及藥品監(jiān)督檢查領(lǐng)域[5]應(yīng)用越來越廣泛。近年來，近紅外光譜技術(shù)在中藥領(lǐng)域的研究已有多項(xiàng)報道[6-7]，本研究嘗試?yán)媒t外光譜技術(shù)建立馬應(yīng)龍麝香痔瘡膏中間體含量快速檢測模型。

1 儀器與材料

1.1 儀器 MPA傅立葉變換近紅外光譜儀(德國布魯克光學(xué)儀器公司)；萬分之一分析天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；GC-2010氣相色譜儀(日本島津公司)；超聲波清洗器(廣東固特超聲股份有限公司)。

1.2 材料 三氯甲烷(批號：20160206)、鹽酸(批號：2015010607)、鉻黑T均購自上海凌峰化學(xué)試劑有限公司)；水楊酸甲酯(天津博迪化工股份有限公司)；0.05 mol·L-1乙二胺四乙酸二鈉標(biāo)準(zhǔn)溶液(上海阿拉丁生化科技股份有限公司)；氨水(批號：20170605)、氯化銨(批號：20180505)、磷酸氫二鈉(批號：20180810)、三乙醇胺(批號：20140110)、環(huán)己烷(批號：20100105)、乙酸乙酯(批號：20140310)等均購自國藥集團(tuán)化學(xué)股份有限公司；龍腦對照品(批號：110881-201508，含量96.8%)、異龍腦對照品(批號：111512-201603，含量96.7%)均購自中國食品藥品檢定研究院；冰片、50 mL錐形瓶、50 mL容量瓶、50 mL分液漏斗、燒杯、漏斗、濾紙、去離子水、248批中間體粉末，中間體粉末由馬應(yīng)龍藥業(yè)股份有限公司提供。

2 試驗(yàn)方法

2.1 樣品制備 將總混合粉末按照馬應(yīng)龍麝香痔瘡膏配方進(jìn)行人為配比，只改變配方中煅爐甘石的配比比例，使其在配方中比例變化在常規(guī)比例的-15%、-14%、-13%……+13%、+14%、+15%，每個比例變化值用4個不同批次樣品配備，共配比124批粉末并混勻(150目)，編號a1～a124；按照相同步驟改變配方中冰片的配比比例，混勻，得到124批粉末編號b1～b124。

2.2 煅爐甘石含量測定 按照《中國藥典》2015年版馬應(yīng)龍麝香痔瘡膏項(xiàng)下煅爐甘石含量測定方法，采用配位滴定法測量124批樣品中ZnO的含量。結(jié)果顯示，ZnO含量在49.7%～68.8%內(nèi)與乙二胺四乙酸二鈉用量呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，回歸方程為Y=49.144X+0.006 2(R2=1.000 0)。每批樣品平行測量3次，取平均值作為ZnO含量參考值。

2.3 冰片含量測定

2.3.1 色譜條件與系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) 色譜柱型號為DB-WAXETR毛細(xì)管柱(0.32 mm×30 m，1 μm)。進(jìn)樣口溫度250 ℃，柱溫130 ℃，檢測器溫度250 ℃。分流比為10∶1。理論塔板數(shù)(以水楊酸甲酯峰計)為20 208，龍腦、異龍腦的分離度分別為12.828、15.788。對照品色譜圖見圖1。

2.3.2 內(nèi)標(biāo)溶液制備 取水楊酸甲酯適量，精密稱定，加環(huán)己烷-乙酸乙酯(1∶1)制成每1 mL含3 mg的溶液。

2.3.3 對照品溶液制備 分別稱取適量龍腦、異龍腦、冰片對照品，精密稱定，加入內(nèi)標(biāo)溶液制成每1 mL含2 mg的溶液。

2.3.4 供試品溶液制備 取已混合均勻的中間體粉末約1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入內(nèi)標(biāo)液10 mL，混勻，稱定重量，超聲處理15 min，放冷，在稱定重量，用環(huán)己烷-乙酸乙酯(1∶1)補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。

2.3.5 含量測定 分別吸取龍腦對照品溶液與供試品溶液1 μL注入氣相色譜儀。依據(jù)對照品中龍腦的含量計算出供試品溶液中龍腦的含量，作為中間體粉末中冰片的含量。

2.3.6 方法學(xué)考察

2.3.6.1 線性關(guān)系考察 精密稱取龍腦對照品150.13 mg，置于25 mL容量瓶中，加入內(nèi)標(biāo)溶液溶解并稀釋至刻度線，搖勻，得到對照品溶液。從對照品溶液中分別吸取1、2、3、4、5 mL至10 mL容量瓶中，加內(nèi)標(biāo)液稀釋至刻度。上述6個濃度點(diǎn)以濃度為橫坐標(biāo)，對照品峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積的比值為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果得龍腦回歸方程為Y=0.488 3X-0.015 5(R2=0.999 6)

說明龍腦在6.005 2～60.052 mg范圍內(nèi)進(jìn)樣量與對照品峰面積與內(nèi)標(biāo)物峰面積比值具有良好的線性關(guān)系。

2.3.6.2 精密度考察 精密稱取龍腦對照品2.06 mg加入10 mL容量瓶中稀釋至刻度，按照“2.3.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)測定6次并計算校正因子。結(jié)果6次校正因子平均值為0.677 95，RSD值為0.32%。試驗(yàn)結(jié)果表明本方法精密度較好。

A.冰片樣品;B.龍腦對照品;C.異龍腦對照品 1.龍腦;2.水楊酸甲酯;3.異龍腦

2.3.6.3 重復(fù)性考察 取其中一批配比的樣品(b64)，按照“2.3.4”項(xiàng)下平行制備6份樣品，按測定方法平行測定6份樣品中龍腦的含量，結(jié)果顯示龍腦的平均值為43.14 mg·g-1，RSD為0.71%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.3.6.4 穩(wěn)定性考察 在上述制備的6份樣品中隨機(jī)選取一份樣品，分別在0、2、4、6、12、24 h測定其含量，RSD為0.64%，表明所制樣品在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.6.5 加樣回收試驗(yàn) 精密稱取已知含量的中間體粉末(b2，龍腦含量35.12 mg·g-1)6份，每份0.5 g，分別加入17.5 mg龍腦對照品，按照制備供試品的方法制備樣品并測定回收率，結(jié)果見表1，結(jié)果表明本方法龍腦平均回收率為99.65%，RSD為0.58%，符合規(guī)定。

2.4 中間體粉末光譜采集 取以上所有中間體樣品約1 g，分別置于樣品測試杯中，在12 500～4 000 cm-1處掃描，分辨率為8 cm-1，掃描次數(shù)為32次，每個樣品重復(fù)測量3次，求得平均光譜用于分析。樣品光譜信息見圖2。

表1 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.5 樣本集的劃分 利用K-S方法[8]，將a樣品與b樣品分別劃分訓(xùn)練集a與測試集a、訓(xùn)練集b與測試集b。其中訓(xùn)練集a共87份樣品，測試集a共37份樣品、訓(xùn)練集b共86份樣品，測試集b共38份樣品。具體樣品信息見表2。

圖2 中間體近紅外光譜

表2 定量模型訓(xùn)練集與測試集樣品信息

3 試驗(yàn)結(jié)果

3.1 光譜預(yù)處理方法的選擇 近紅外光譜儀所采集的光譜除樣品的自身信息外，還包含了其他無關(guān)信息和噪聲，如電噪聲、樣品背景和雜散光等[9]。因此，需要對光譜進(jìn)行預(yù)處理。矢量歸一化法(vector normalization,VN)可以消除微小光程差帶來的圖譜變動；導(dǎo)數(shù)處理可以校正基線并分辨重疊峰，多元散射校正可消除固體顆粒大小帶來的影響[10]。本試驗(yàn)利用OPUS/QUANT-2定量分析軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理時，在全譜段范圍內(nèi)對光譜進(jìn)行矢量歸一化(VN)，一階導(dǎo)數(shù)(first derivative,FD)，二階導(dǎo)數(shù)(second derivative,SD),多元散射校正(multiple scatter correction,MSC)以及它們的組合[11]等對光譜進(jìn)行預(yù)處理，并分別建立定量分析模型a(a樣品)與模型b(b樣品)，結(jié)果見表3。試驗(yàn)過程中以模型的決定因子(R2)、內(nèi)部驗(yàn)證均方差(RMSECV)和相對分析誤差(RPD)綜合評價所建定量分析模型。其中R2越接近1，RMSECV 越小，說明建模性能越好。通常認(rèn)為RPD>3，模型的預(yù)測精度高，如果RPD<2.5，需重新建立模型。

表3 全譜段范圍內(nèi)用不同預(yù)處理方法建立的中間體粉末定量分析模型

由表3可知，對于中間體a(只改變配方中煅爐甘石比例樣品)，當(dāng)采用一階導(dǎo)數(shù)(21點(diǎn)平滑)為預(yù)處理方法時，所建立的ZnO定量分析模型RMSECV值最小，R2值最大且RPD值最大，故選用FD(21點(diǎn)平滑)作為預(yù)處理方法。對于中間體b(只改變配方中冰片比例樣品)，當(dāng)采用一階導(dǎo)數(shù)(25點(diǎn)平滑)與多元散射校正為預(yù)處理方法時，所建立的冰片定量分析模型效果最好，因此選用該方法作為預(yù)處理方法。

3.2 光譜特征譜段的選擇 在建PLSR定量分析模型時，為提高模型的預(yù)測能力和穩(wěn)健性，常對光譜進(jìn)行譜段篩選，區(qū)間偏最小二乘(iPLS)是將全譜等分成n個子區(qū)間，分別建立回歸模型，篩選出最佳譜段。本試驗(yàn)將全譜段分別劃分為5、6、7、8、9、10個區(qū)間,不同區(qū)間下所篩選的最優(yōu)譜段及模型的效果見表4。在“3.1”項(xiàng)下評價方法基礎(chǔ)上，同時利用測試集樣品進(jìn)行外部驗(yàn)證，以測試集驗(yàn)證均方差(RMSEP)評價模型效果，其中R2越接近1，RMSEP越小表示模型預(yù)測能力越強(qiáng)。綜合考慮內(nèi)部交叉驗(yàn)證結(jié)果和外部驗(yàn)證結(jié)果，確定最佳區(qū)間數(shù)和特征譜段。

由表4可知，對于a模型，當(dāng)全譜段被劃分為6個區(qū)間，在12 493.3～11 073.9、8 246.6～6 823.3、5 411.6～3 999.9 cm-1，所建立的定量模型最優(yōu)；對于b模型、全譜段劃分為10個區(qū)間，在9 947.6～8 246.6、7 398～5 697、4 852.3～3 999.9 cm-1，所建立的模型效果最好。因此選擇以上譜段作為相應(yīng)定量模型的建模譜段。

3.3 模型評價與預(yù)測 在建立PLS模型時，主成分?jǐn)?shù)對模型的預(yù)測能力有著極其重要的影響，主成分?jǐn)?shù)過多會使得模型“過擬合”，過少則會“欠擬合”[12]，都會降低模型的預(yù)測能力。本研究以RMSECV作為優(yōu)化參數(shù)來確定最佳主成分?jǐn)?shù)(Rank值)，RMSECV與Rank值關(guān)系見圖3。模型參數(shù)確定后，用此模型對測試集樣品進(jìn)行外部驗(yàn)證，其分析結(jié)果見圖4。以模型預(yù)測值與參考值的相對偏差來評價模型的預(yù)測能力，對于a、b模型，平均相對偏差分別為1.27%、1.4%，表明兩個模型預(yù)測能力良好。

表4 劃分不同區(qū)間所建立的中間體粉末定量分析模型

圖3 訓(xùn)練集樣品RMSECV與Rank值關(guān)系圖

圖4 外部驗(yàn)證結(jié)果圖

4 討論

本試驗(yàn)對中間體中煅爐甘石和冰片粉末的含量進(jìn)行分析，所建立的分析模型可以準(zhǔn)確快速地檢測未知含量的中間體中煅爐甘石與冰片的含量。在進(jìn)行冰片含量測定時，由于實(shí)驗(yàn)儀器原因并未采用藥典上的色譜條件，本試驗(yàn)采用的方法經(jīng)方法學(xué)考察表明該方法測定的冰片含量數(shù)據(jù)較為準(zhǔn)確。由于試驗(yàn)中所用的樣品數(shù)目有限，因此模型的適用性具有一定限制，日后隨著樣本數(shù)的增加，對模型不斷進(jìn)行優(yōu)化，模型的適應(yīng)性將更加廣泛。