丁原全，李瑞海，賈天柱

（1.聯(lián)勤保障部隊大連康復(fù)療養(yǎng)中心 付家莊醫(yī)院，遼寧 大連 116001；2.遼寧中醫(yī)藥大學 藥學院，遼寧 大連 116600）

2020版藥典關(guān)于白屈菜的記載，缺少白屈菜的飲片項目，這樣不利于在市場上應(yīng)用白屈菜這味具有良好療效的傳統(tǒng)中藥。本實驗室課題研究內(nèi)容主要是為增加2020版藥典白屈菜飲片的質(zhì)量標準。在研究中發(fā)現(xiàn)，白屈菜在臨床中其飲片除了凈制的簡單方法以外，別無其他炮制內(nèi)容。但臨床應(yīng)用的過程當中，發(fā)現(xiàn)白屈菜的炮制是有必要的。白屈菜具有止痛的作用，中醫(yī)理論認為醋制后能夠引藥歸肝經(jīng)，并增強止痛的作用。同時，現(xiàn)代研究表明，白屈菜當中含有大量的生物堿，那么是不是在經(jīng)過炮制以后，能夠更好的發(fā)揮白屈菜當中生物堿類成分的作用，有待于進一步的研究。本研究主要的內(nèi)容是利用不同的醋制方法，對白屈菜炮制條件進行初步研究，為白屈菜的飲片進一步炮制研究奠定基礎(chǔ)。

1 實驗部分

1.1 藥品與試劑

吉林產(chǎn)白屈菜，經(jīng)遼寧中醫(yī)藥大學藥學院王榮祥教授鑒定為罌粟科植物白屈菜（Chelidonium majus L.）的干燥全草；米醋（廚邦9度米醋，廣東美味調(diào)味食品有限公司）、Chelidonine（YZ180424）（南京源植物生物科技有限公司）、Chelerythrine（20170103）、Berberine（20160907、Sanguinarine（20140717）、）Coptisine hydrochloride（20170719）和 Protopine（201706 12）（由大連美侖生物技術(shù)有限公司提供）；鹽酸等試劑均為分析純（國藥集團公司）。

1.2 儀器

Agilent 1100 Series高效液相色譜儀（美國安捷倫科技公司）；安捷倫色譜工作站；SF-130B型高速粉碎機（上海冠聯(lián)制藥裝備有限公司）；AS3120型超聲提取器（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；十萬分之一電子天平（CP225D，SARTORIUS）；RE5ZCS型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）。

1.3 對照品溶液的制備

分別取 Protopine、Chelidonine、Coptisine hydrochloride、Sanguinarine、Berberine和 Chelerythrine等對照品加甲醇配制成 0.0160、0.0512、0.0431、0.0218、0.0113和0.0162mg·mL-1的對照品溶液備用。

1.4 供試品溶液的制備

取本品粉末（過三號篩）約2g，精密稱定，置圓底燒瓶中，精密加鹽酸-甲醇（0.5∶100）混合溶液40mL，稱定重量，加熱回流1.5h，放冷，再稱定重量，用鹽酸-甲醇（0.5∶100）混合溶液補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液20mL，蒸干，殘渣加50%甲醇使溶解，轉(zhuǎn)移至10mL量瓶中，加50%甲醇至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得[2]。

1.5 色譜條件[6]

色譜柱為中匯達Kromasil分析柱（4.6×250mm，5μm）；流動相：0.1%三乙胺（用H3PO4調(diào)節(jié)pH 值至3.0）-乙腈；梯度洗脫條件，0～18min24%，32min35%檢測波長為274nm；流速為 1mL·min-1；柱溫35℃；進樣量為20μL。

2 結(jié)果與討論

2.1 專屬性實驗[7]

精密吸取對照品溶液、供試品溶液各20μL，在上述選定的色譜條件下進行測定，結(jié)果對照品的分離度良好，且與供試品中的其它成分不干擾。

圖1 對照品（A）、白屈菜藥材（B）的HPLC圖Fig.1 HPLC of reference（A）and Chelidonium（B）

2.2 標準曲線的繪制

精密吸取 Protopine 0.80mg·mL-1、Chelidonine 1.28mg·mL-1、Coptisine hydrochloride 1.0775mg·mL-1、Sanguinarine 0.545mg·mL-1、Berberine 0.2825mg·mL-1和 Chelerythrine 0.405mg·mL-1的混合對照品 1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0、20.0mL，置于 25mL 量瓶中以甲醇定容，按“1.5項”下的色譜條件，注入液相色譜器儀中，測定色譜峰面積，以對照品進樣量X（μg）為橫坐標，峰面積值為縱坐標Y，繪制標準曲線，回歸方程及線性范圍見表1。

表1 對照品的進樣量和峰面積相關(guān)表Tab.1 Sample quantity and peak area of reference substan ce related list

結(jié)果表明 Protopine、Chelidonine、Coptisine hydrochloride、Sanguinarine、Berberine 和 Chelerythrine對照品，具有良好的線性關(guān)系。

2.3 精密度試驗

精密吸取6種對照品，測定，測得Protopine、Chelidonine、Coptisine hydrochloride、Sanguinarine、Berberine和Chelerythrine對照品的峰面積 RSD（n=6）分別是1.04%、1.02%、1.14%、0.66%、1.20%、0.55%，說明方法精密度良好。

2.4 重復(fù)性試驗

取樣品，按“1.4項”和“1.5項”下方法制備和HPLC 測定，結(jié)果 Protopine、Chelidonine、Coptisine hydrochloride、Sanguinarine、Berberine 和 Chelerythrine對照品的峰面積 RSD（n=6）分別為 0.51、4.77、4.71、1.30、0.35 和 1.01mg·g-1，說明方法重現(xiàn)性良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗

取供試品，按“1.5 項”下色譜條件，于 0，2，4，8，12，24h 進樣測定，結(jié)果 Protopine、Chelidonine、Coptisine hydrochloride、Sanguinarine、Berberine 和 Chelerythrine對照品的峰面積RSD（n=6）分別為1.59%、1.85%、0.63%、1.04%、0.80%、0.92%，表明樣品在24h內(nèi)穩(wěn)定。

2.6 加樣回收試驗

取樣品粉末6份，每份2g，精密稱定，置塞錐形瓶中，精密加入 Protopine 1.01mg·mL-1、Chelidonine 9.71mg·mL-1、Coptisine hydrochloride 9.51mg·mL-1、Sanguinarine 2.58mg·mL-1、Berberine 0.70mg·mL-1和Chelerythrine 2.04mg·mL-1混合對照品溶液 10mL，按“1.4項”和“1.5項”下方法制備和HPLC測定，計算回收率，結(jié)果 RSD（n=6）分別是 2.43%、2.36%、2.29%、2.30%、2.04%和1.82%，符舍相關(guān)規(guī)定。

2.7 樣品炮制和測定結(jié)果

2.7.1 分別取白屈菜500g，加入純米醋100g拌勻，分成5份，每份100g，按下述方法處理。炙法，用文火加熱炒干，備用。烘法，烘箱干燥，備用。蒸法，置于蒸籠中加熱蒸20min，取出，將白屈菜用鍋底蒸餾水拌均，烘箱干燥，備用。煮法，將白屈菜置鍋中加入適量清水200g，用文火煮20min，烘箱干燥，備用。燜法，將白屈菜置鍋中，燜20min，取出烘箱干燥，備用。

2.7.2 將生品和醋燜法的白屈菜，各100g，加水沒過藥（200mL），浸泡 20min，先武火后文火，煎煮兩次，合并藥液，濃縮至稠膏，烘至干，各精密稱取0.5g，備用。

2.7.3 取上述樣品，按“1.4項”和“1.5項”下方法制備和HPLC測定，結(jié)果見表2。

表 2 樣品測定結(jié)果（mg·g-1，n=3）Tab.2 Samples determination results（mg·g-1）

2.8 小結(jié)與討論

（1）各樣品原阿片堿、白屈菜堿、鹽酸黃連堿、血根堿、小檗堿和白屈菜紅堿含量測定結(jié)果見表2，從結(jié)果中看到，燜法相對于其它的炮制方法，所含總堿量最高。所有的醋制品的6種成分無論是單一的含量還是總量均低于生品，說明炮制過程對白屈菜的成分是有影響的。說明在炮制的過程當中，由于條件控制不好，會使得一些水溶性堿性成分損失，比如在炮制過程中在加醋潤濕的過程當中，水溶性的生物堿類的成分會粘在容器的表面而損失掉，這樣的損失由于量是固定的，因此，可以在工業(yè)生產(chǎn)的時候而相對減少。其中燜法和烘法結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無論是總成分還是各自的成分來說減少得不多，并都符合藥典的要求。

（2）不容忽視的是湯劑是中藥臨床使用非常廣泛和常見的劑型。因此，本實驗還進行了生品和醋制品湯劑提取效果差別的研究。結(jié)果見表2，實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，利用燜制法進行處置的白屈菜在進行湯劑煎煮的過程當中，其提取率是非常高的，而生品在湯劑煎煮的過程當中，提取率則非常低。從這一點可以看出，白屈菜的醋制還是非常必要的。因為其很多堿性成分是原小檗堿類的生物堿為叔胺型以游離的形式存在，是不溶于水的。因此，在經(jīng)過醋制以后，使得其轉(zhuǎn)變?yōu)榧景沸驮黾恿怂苄?，促進了其有效成分的溶出。因此，在飲片的過程當中，通過本研究結(jié)果表明，白屈菜的飲片炮制過程還是非常有必要的。為初步研究的過程，具體的關(guān)于醋的用量，燜煮時間等參數(shù)尚需進一步的研究。

3 結(jié)論

所建立的HPLC含量測定方法，簡單易行，可用于白屈菜樣品的含量測定，白屈菜燜法炮制方法所得總堿相對較高，白屈菜的飲片炮制是必要的，但尚需進一步的研究，如醋用量、醋的種類、炮制時長、溫度等工藝參數(shù)研究，為規(guī)范炮制，其效最大地發(fā)揮，保證白屈菜的臨床用藥療效。