張武君 劉保財(cái) 趙云青 黃穎楨 陳菁瑛

(福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物資源研究所/福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院藥用植物研究中心,福建 福州 350003)

金花茶(Camellia nitidissimaChi)為山茶科山茶屬金花茶組灌木或小喬木[1],花色金黃,形美香雅,被譽(yù)為“植物界的大熊貓”、“茶族皇后”等,是世界珍稀瀕危植物,屬國(guó)家一級(jí)保護(hù)植物,不僅具有極高的觀賞價(jià)值,同時(shí)也是廣西壯族自治區(qū)的傳統(tǒng)藥用植物,具有清熱解毒、利尿消腫的作用[2]。2010 年,金花茶被國(guó)家衛(wèi)生部列入新資源食品,2015 年被國(guó)家林業(yè)局列入林藥植物進(jìn)行重點(diǎn)發(fā)展。金花茶主要分布于廣西西南部北回歸線以南的北熱帶雨林,廣西的防城、南寧、隆安、扶綏等縣(市)以及越南北部。金花茶喜暖畏寒,屬熱帶性樹種[3],其耐寒性不及茶梅、華東山茶[4],在原產(chǎn)地可忍耐-3℃的短暫低溫[5],最低溫為-4℃時(shí)未加任何措施雖未被凍死,但生長(zhǎng)發(fā)育受限制[6]。金花茶各生育期對(duì)溫度要求不同,植株萌動(dòng)要求溫度在10℃以上,營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)期適宜溫度18 ～23℃,開花期適宜溫度13～24℃[5]。目前,關(guān)于金花茶的研究主要集中在種苗繁育、栽培管理、化學(xué)成分、藥理作用等方面[7-8],而其耐寒性及生理特性的研究鮮見報(bào)道。李吉濤等[9-10]比較了8 種金花茶的耐寒性及部分生理指標(biāo),發(fā)現(xiàn)其耐寒性依次為金花茶＞龍州金花茶＞毛籽金花茶＞檸檬黃金花茶＞凹脈金花茶＞直脈金花茶＞東興金花茶＞平果金花茶。為進(jìn)一步了解金花茶的耐寒性及其在不同低溫脅迫的生理變化情況,本研究利用人工氣候箱模擬不同溫度低溫脅迫環(huán)境,探討金花茶幼苗響應(yīng)低溫脅迫的生理特性,以期為金花茶的引種栽培、抗寒育種提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料及儀器

供試材料:防城普通種金花茶(經(jīng)黃連冬高級(jí)工程師鑒定)2 a 生營(yíng)養(yǎng)袋苗,長(zhǎng)勢(shì)基本一致,由福建世紀(jì)金花科技有限公司提供。試驗(yàn)前置于室外樹陰下按常規(guī)管理,低溫脅迫處理于2018 年1 月在福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹所進(jìn)行。

GXZ-0288 光照培養(yǎng)箱,寧波江南儀器廠;UV-1780 紫外-可見分光光度計(jì),島津儀器(蘇州)有限公司;BS 110S 萬分之一天平,德國(guó)賽多利斯公司;2W 阿貝折射儀,上海光學(xué)儀器五廠;FE30 電導(dǎo)率儀,梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將營(yíng)養(yǎng)袋苗移入光照培養(yǎng)箱內(nèi)進(jìn)行低溫暗培養(yǎng)處理,設(shè)置6、3、0、-3、-6、-9℃6 個(gè)溫度梯度,每個(gè)溫度持續(xù)時(shí)間以每延長(zhǎng)3 h 為一個(gè)梯度,即設(shè)置3、6、9、12 h 4 個(gè)時(shí)間梯度,共計(jì)24 個(gè)處理,每個(gè)處理4 株植株,共計(jì)96 株金花茶苗。待培養(yǎng)箱達(dá)到設(shè)定溫度后,將金花茶苗放入培養(yǎng)箱中,到設(shè)定時(shí)間后取出,剪取當(dāng)年生秋梢上的成熟葉進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定。將葉片洗凈、擦干,除去主脈和葉緣后分為兩部份,一部份立即用于細(xì)胞傷害率(cell injury rate,CIR)和束縛水(bound water,BW)與自由水(free water,FW)含量的測(cè)定,其中CIR 測(cè)定樣品均勻剪成0.50 cm2,BW、FW 測(cè)定樣品均勻剪成0.20 cm2;另一部分剪成0.50 cm2后按每包0.50 g 用硫酸紙包好,液氮凍存后置于-80℃保存,用于丙二醛(malondialdehyde,MDA)、脯氨酸(proline,Pro)、可溶性糖(soluble sugar,SS)、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、過氧化物酶(peroxidase,POD)、過氧化氫酶(catalase,CAT)等指標(biāo)的測(cè)定。

1.3 試驗(yàn)項(xiàng)目與方法

CIR 測(cè)定參考陳愛葵等[11]、王學(xué)奎[12]的方法,并略做改進(jìn)。準(zhǔn)確稱取待測(cè)葉片0.50 g 于試管中,加入20 mL 去離子水,靜置21 h 后測(cè)定浸提液電導(dǎo)率(R,μs·cm-1),然后于沸水浴加熱30 min,冷卻至室溫后搖勻,再次測(cè)定浸提液電導(dǎo)率(R0,μs·cm-1),以未脅迫處理的金花茶葉片的電導(dǎo)率為對(duì)照(control,CK)。按照公式計(jì)算CIR:

每個(gè)溫度的處理均設(shè)置4 個(gè)重復(fù)。參照蓋鈞鎰[13]的方法計(jì)算半致死溫度(semi-cethal temperature,LT50),對(duì)同一脅迫持續(xù)時(shí)間下的不同處理溫度及對(duì)應(yīng)的平均CIR 進(jìn)行Logistic 回歸方程擬合。Logistic 方程為:

式中,y:CIR(%);x:處理溫度(℃);K:CIR 的最大飽和容量;a、b:方程的參數(shù)。因CIR 計(jì)算中扣除了本底值,故K 值取100。按照公式計(jì)算金花茶葉片的低溫LT50:

參照許允文[14]的方法測(cè)定BW/FW;參照王學(xué)奎[12]的方法測(cè)定MDA、Pro 和SS 含量;參照張志良[15]的方法測(cè)定POD 活性;采用試劑盒(南京建成生物研究所)測(cè)定SOD、CAT 活性。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Office Excel 2010 進(jìn)行整理數(shù)據(jù)和作圖;SPSS 19.0 軟件進(jìn)行多重比較和雙變量相關(guān)性分析,采用Duncan’s 法進(jìn)行差異顯著性檢驗(yàn),采用Person’s 相關(guān)系數(shù)表示相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫脅迫對(duì)細(xì)胞傷害率和半致死溫度的影響

由圖1 可知,隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng),各溫度下的CIR 呈上升趨勢(shì)。隨著處理溫度的降低,金花茶葉片CIR 呈慢-快-慢的增長(zhǎng)趨勢(shì),與處理溫度間呈“S”型曲線,表現(xiàn)為6～0℃時(shí),CIR 緩慢上升,0 ～-6℃時(shí),CIR急劇上升,-6～-9℃時(shí),CIR 上升減緩。處理溫度為3～-9℃時(shí)CIR 均呈上升趨勢(shì),利用Logistic 回歸方程對(duì)不同脅迫時(shí)間下處理溫度與金花茶葉片CIR 進(jìn)行擬合,得到低溫LT50為-6.62～-3.94℃(表1),低溫脅迫時(shí)間越長(zhǎng),LT50越高,表明細(xì)胞傷害程度受處理溫度和脅迫持續(xù)時(shí)間的共同影響。

圖1 低溫脅迫對(duì)金花茶葉細(xì)胞傷害率的影響Fig.1 Effect of low temperature stress on CIR of C.nitidissima leaives

表1 不同脅迫時(shí)間下處理溫度與細(xì)胞傷害率的Logistic 方程擬合Table 1 Logistic equation fitting of treatment temperatures and CIR under different stress time

2.2 低溫脅迫對(duì)金花茶葉片MDA 含量的影響

由圖2 可知,隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng),0℃下金花茶葉片MDA 含量明顯上升;-3℃下MDA 含量呈先上升后下降的趨勢(shì);-6℃下MDA 含量呈下降趨勢(shì);6℃、3℃、-9℃下MDA 含量變化不顯著。隨著處理溫度的降低,MDA 含量總體呈先上升后下降的趨勢(shì),變化較為平緩,表明低溫脅迫下,MDA 含量不能較好地反應(yīng)金花茶葉片細(xì)胞的傷害程度。

圖2 低溫脅迫對(duì)金花茶葉片MDA 含量的影響Fig.2 Effect of low temperature stress on MDA content of C.nitidissima leaives

2.3 低溫脅迫對(duì)金花茶葉片保護(hù)酶活性的影響

由圖3-A 可知,隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng),6℃下SOD活性呈先上升后下降的趨勢(shì),其他5 個(gè)溫度下SOD 活性均呈不斷下降趨勢(shì)。3℃處理3 h 時(shí)SOD 活性最高,為27.80 U·g-1;-9℃處理12 h 時(shí)SOD 活性最低,為7.91 U·g-1。隨著處理溫度的降低,脅迫時(shí)間為3 h時(shí),SOD 活性呈先上升后下降的趨勢(shì);脅迫時(shí)間為6、9、12 h 時(shí),SOD 活性呈下降趨勢(shì)。0℃為SOD 活性變化的轉(zhuǎn)折點(diǎn),0℃及以下低溫處理的SOD 活性均維持在較低水平。表明金花茶SOD 活性總體隨處理溫度的降低及脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)。

由圖3-B 可知,隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng),6℃下POD活性小幅波動(dòng),3℃下先下降后上升,其余4 個(gè)溫度下POD 活性均呈下降趨勢(shì)。-9℃處理3 h 的POD 活性最高,為930.00 U·g-1·min-1,0℃處理12 h 的POD 活性最低,為272.34 U·g-1·min-1。隨著處理溫度的降低,脅迫時(shí)間為3、6 h 時(shí),POD 活性均呈上升趨勢(shì);脅迫時(shí)間為9 h 時(shí),POD 活性先降低后升高;脅迫時(shí)間為12 h 時(shí),POD 活性呈先上升后下降再上升的趨勢(shì)。表明金花茶POD 活性總體隨處理溫度的降低呈上升趨勢(shì),隨脅迫時(shí)間延長(zhǎng)呈下降趨勢(shì)。

由圖3-C 可知,金花茶葉片CAT 活性較低,重復(fù)間誤差相對(duì)較大。隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng),各處理溫度下CAT 活性僅小幅波動(dòng)。-9℃處理3 h 時(shí)CAT 活性最高,為0.69 U·g-1;6℃處理6 h 時(shí)CAT 活性最低,為0.37 U·g-1。隨著處理溫度的降低,脅迫時(shí)間為3、12 h 時(shí),CAT 活性呈上升趨勢(shì);脅迫時(shí)間為6 h,CAT 活性呈先上升后下降再上升的趨勢(shì);脅迫時(shí)間為9 h,CAT活性變化不顯著。表明金花茶CAT 活性總體隨處理溫度的降低呈上升趨勢(shì),但隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)變化不明顯。

2.4 低溫脅迫對(duì)金花茶葉片束縛水與自由水比值的影響

由圖4 可知,隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng),處理溫度為6、3、0℃時(shí),BW/FW 呈小幅上升趨勢(shì);處理溫度為-3℃時(shí),BW/FW 呈先升后降趨勢(shì);處理溫度為-6、-9℃呈下降趨勢(shì)。-6℃處理3 h 時(shí)BW/FW 最高,為0.42,-9℃處理9 h 時(shí)BW/FW 最低,為0.25。隨著處理溫度的降低,BW/FW 在脅迫3、6、12 h 時(shí)均呈先上升后下降的趨勢(shì);在脅迫9 h 時(shí)呈先維持再下降的趨勢(shì)。表明金花茶BW/FW 隨著處理溫度的降低總體呈先上升后下降的趨勢(shì),不同溫度下隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)變化不同。

2.5 低溫脅迫對(duì)金花茶葉片細(xì)胞滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)含量的影響

由圖5-A 可知,隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng),處理溫度為6℃和3℃時(shí),Pro 含量呈上升趨勢(shì);處理溫度為0℃和-6℃時(shí)無顯著差異;處理溫度為-3℃和-9℃時(shí),Pro含量呈先升高后降低趨勢(shì)。0℃處理12 h 時(shí)Pro 含量最高,為13.74 μg·g-1,-9℃處理12 h 時(shí)Pro 含量最低,為3.13 μg·g-1。隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng),處理溫度為6～0℃時(shí)Pro 含量呈上升趨勢(shì),處理溫度為0℃和-3℃時(shí)Pro 含量較高,之后維持在較低水平。表明金花茶Pro 含量隨著處理溫度的降低總體呈先上升后下降的趨勢(shì),不同溫度下隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)變化不同。

圖3 低溫脅迫對(duì)金花茶葉片SOD、CAT、POD 活性的影響Fig.3 Effect of low temperature stress on SOD,POD,CAT activities of C.nitidissima leaives

圖4 低溫脅迫對(duì)金花茶葉片束縛水與自由水比值的影響Fig.4 Effect of low temperature stress on ratio of bound water to free water(BW/FW)of C.nitidissima leaives

由圖5-B 可知,隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng),處理溫度為6、0、-6℃時(shí),SS 含量無顯著變化;處理溫度為3、-3℃時(shí),SS 含量呈先上升后下降的趨勢(shì);處理溫度為-9℃時(shí)SS 含量呈下降趨勢(shì)。-9℃處理3 h 時(shí)SS 含量最高,為6.40%;6℃處理9 h 時(shí)SS 含量最低,為3.87%。隨著處理溫度的降低,SS 在6 ～-6℃不斷上升,-6 ～-9℃保持穩(wěn)定。表明金花茶SS 含量隨著處理溫度的降低總體呈先上升再穩(wěn)定的趨勢(shì),不同溫度下隨脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)變化不顯著或最終下降。

2.6 低溫脅迫中金花茶葉片各項(xiàng)抗寒生理指標(biāo)的相關(guān)性分析

由表2 可知,處理溫度與CIR 始終呈極顯著負(fù)相關(guān),表現(xiàn)為隨著處理溫度降低,CIR 顯著上升。CIR 與BW/FW 在低溫脅迫9、12 h 時(shí)分別呈極顯著和顯著負(fù)相關(guān);與SS 含量在脅迫3、9、12 h 呈顯著正相關(guān);與SOD 活性在脅迫9 h 呈顯著負(fù)相關(guān);與POD 活性在脅迫3、6 h 呈極顯著正相關(guān);與CAT 活性在脅迫3 h 和脅迫9 h 分別呈極顯著和顯著正相關(guān);與MDA 和Pro 含量無顯著相關(guān)性。表明BW、SS 含量,SOD、POD、CAT 活性在脅迫的不同階段對(duì)細(xì)胞的損傷進(jìn)行響應(yīng),而MDA含量與Pro 含量對(duì)低溫脅迫的響應(yīng)無明顯規(guī)律。

圖5 低溫脅迫對(duì)金花茶葉片脯氨酸和可溶性糖含量的影響Fig.5 Effect of low temperature stress on proline and soluble sugar content of C.nitidissima leaives

3 討論

LT50是判斷植物抗寒能力的重要生理指標(biāo)之一,以LT50確定生態(tài)分布的最低溫度,能快速鑒定植物的抗寒能力[16],可避免引種和推廣工作中的盲目性。目前,該方法已被用于廣西油茶[17]、香花油茶[18]、滇山茶[19]等山茶科植物抗寒能力的鑒定。本研究中,金花茶幼苗葉片在低溫脅迫3 h 的LT50為-6.62℃。這與郭亞男等[20]測(cè)得的-6.16℃ 相近,但高于李吉濤等[10]測(cè)得的-14.58℃。這可能與本試驗(yàn)浸提時(shí)間更長(zhǎng),電解質(zhì)外滲更充分等有關(guān)。

MDA 是細(xì)胞膜脂過氧化產(chǎn)物,其含量常作為膜系統(tǒng)損傷程度的指標(biāo)。研究表明,MDA 含量隨著脅迫溫度的降低均有不同程度的上升[21-22]。而本研究中,MDA 含量隨著處理溫度的降低及脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)呈先上升后下降的趨勢(shì)。這與李吉濤等[9]的研究結(jié)果相似,但其測(cè)得的MDA 含量達(dá)到峰值的溫度低于LT50,與本研究不同,推測(cè)可能是由于本試驗(yàn)降溫較快,導(dǎo)致細(xì)胞受低溫傷害在較短的時(shí)間內(nèi)死亡,MDA含量保持在一個(gè)較低水平,具體原因有待進(jìn)一步研究。

SOD、POD、CAT 是抗氧化酶系統(tǒng)清除活性氧的主要酶[23-24]。本試驗(yàn)中,金花茶葉片SOD 活性隨處理溫度的降低而降低,POD、CAT 活性雖有波動(dòng),但總體呈上升趨勢(shì)。前人研究表明,茶樹SOD 同工酶活性及譜帶數(shù)隨處理溫度的降低和脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)均呈不同程度的降低或減少[25],冬季低溫導(dǎo)致茶樹葉片的CAT、POD 活性提高,而POD 同工酶譜帶增加[26]。這與本研究結(jié)果類似。

植物體內(nèi)束縛水含量的增加有利于提高抗寒性。研究發(fā)現(xiàn)隨著脅迫溫度的降低,植物BW/FW 一般呈現(xiàn)持續(xù)上升[27]或先上升再下降[28-30]兩種變化趨勢(shì)。本研究中,金花茶葉片的BW/FW 總體呈先上升后下降的趨勢(shì),可能因?yàn)樵谝欢ǖ拿{迫溫度和時(shí)間內(nèi),金花茶植株能通過提高BW/FW 來降低代謝活性,減輕低溫傷害,但當(dāng)脅迫溫度和時(shí)間超過其忍受范圍后,細(xì)胞結(jié)構(gòu)和代謝受到嚴(yán)重破壞,BW/FW 反而下降。

Pro 和SS 是細(xì)胞內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì),其中Pro 具有增強(qiáng)細(xì)胞抗脫水能力、穩(wěn)定細(xì)胞蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用[31],SS 可以通過提高細(xì)胞液濃度來降低冰點(diǎn),其含量與植物的抗寒性相關(guān)[32-33]。田野等[34]研究發(fā)現(xiàn)SS、Pro 都是茶樹抗寒物質(zhì),且SS 含量與溫度的相關(guān)性大于Pro 含量與溫度的相關(guān)性。本研究中,金花茶葉片Pro 含量隨著處理溫度的下降呈先上升后下降的趨勢(shì)。這與李吉濤等[10]的研究結(jié)果相似,但Pro 含量達(dá)到最大值的溫度不同;SS 含量隨著處理溫度的降低呈上升趨勢(shì),但隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng)維持穩(wěn)定或最終下降,可能原因是細(xì)胞受到低溫脅迫后,水解能力增強(qiáng),淀粉等大分子化合物降解成SS 等物質(zhì),隨著脅迫時(shí)間的延長(zhǎng),糖類大分子化合物持續(xù)減少,使得產(chǎn)物SS 的含量保持穩(wěn)定或下降。

表2 不同低溫脅迫下金花茶葉片各項(xiàng)指標(biāo)的相關(guān)性分析Table 2 Correlations among the tested parameters of C.nitidissima leaives under low temperature stress

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明,金花茶幼苗引種地的極端低溫不宜低于-6℃,建議如果引種地最低氣溫低于-6℃,應(yīng)做好防寒保護(hù)措施或采用設(shè)施栽培。金花茶葉片的CIR 隨著處理溫度的降低呈顯著上升的趨勢(shì),相關(guān)性分析表明BW、SS、SOD、POD、CAT 在脅迫的不同階段與CIR 顯著相關(guān),因此可以將CIR 作為金花茶抗寒性鑒定的主要指標(biāo),將BW/FW、SS、SOD、POD、CAT 作為抗寒性鑒定的輔助指標(biāo)。本研究為進(jìn)一步探討金花茶品種抗寒性及栽培區(qū)域選擇提供了科學(xué)依據(jù)。

致謝:福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所為本研究提供了實(shí)驗(yàn)場(chǎng)地和實(shí)驗(yàn)儀器,謹(jǐn)此致謝!