付 新 ，張洪財(cái) ，張 賀 ，劉 陽 ，王 宇

（1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150040；2.哈爾濱師范大學(xué) 教育學(xué)院,黑龍江 哈爾濱 150025）

當(dāng)歸芍藥散為傳統(tǒng)經(jīng)典方劑，以往多應(yīng)用于治療婦科疾病。當(dāng)歸芍藥散為經(jīng)典古方，最早記載于《金匱要略》中，常用于治療婦科疾病。當(dāng)歸芍藥散以芍藥、川芎、當(dāng)歸三味血藥，補(bǔ)肝體助肝用；白術(shù)、澤瀉、茯苓三味水藥，健脾土防傳變，組方嚴(yán)謹(jǐn)，選藥精當(dāng)，仲景的肝脾同調(diào)思想在此方中展現(xiàn)得淋漓盡致，為其調(diào)和肝脾的代表方。當(dāng)歸芍藥散具有保護(hù)神經(jīng)損傷、增強(qiáng)免疫力、促進(jìn)神經(jīng)遞質(zhì)合成和釋放、調(diào)節(jié)激素、改善學(xué)習(xí)記憶功能等作用[1-3]。最新研究發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸芍藥散活性成分是通過多途徑、多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)，在神經(jīng)退行性這種多因素、多病理靶點(diǎn)的復(fù)雜性疾病治療中顯示了獨(dú)特療效[4]。

芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷是當(dāng)歸芍藥散的主要成分，具有抗炎、肌肉松弛、鎮(zhèn)痛和解痙等作用[5,6]。本研究以芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷為指標(biāo)成分，采用高效液相色譜法（HPLC）測定其中芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷的含量。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與試藥

Waters高效液相色譜系統(tǒng)，2695-2998型UV檢測器；AB145S型電子天平（上海精密儀器儀表有限公司）；KH3200DB型臺(tái)式數(shù)控超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）。

芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷對(duì)照品（批號(hào)分別為110736-201438和110715-201318，純度依次為98.4%，99.3%）購自中國食品藥品檢定研究院；芍藥、當(dāng)歸、川芎、白術(shù)、茯苓、澤瀉藥材購于哈爾濱同仁堂藥店（亳州張仲景中藥飲片有限責(zé)任公司）；甲醇（色譜純，迪馬科技有限公司）；H3PO4（秦皇島華瀛磷酸有限公司）；水為娃哈哈純凈水（杭州哇哈哈集團(tuán)有限公司）。

1.2 色譜條件

色譜柱為COSMOSIL 5C18-MS-Ⅱ柱（4.6×250mm，5μm）；流動(dòng)相：0.1%H3PO4溶液-甲醇（體積比 86∶14）；檢測波長為 230nm；柱溫為 30℃；流速為 1mL·min-1。

1.3 溶液的制備

1.3.1 對(duì)照品溶液制備 分別精密稱取的芍藥苷對(duì)照品，5.10mg芍藥內(nèi)酯苷對(duì)照品，置于容積為25mL容量瓶中，用甲醇進(jìn)行配置，采用超聲溶解，放冷后至室溫后，用甲醇定容，即得到單一成分對(duì)照品儲(chǔ)備液，保存于4℃冰箱。臨用時(shí)，分別精密量取兩種儲(chǔ)備液，量定5mL置50mL容量瓶中，得到芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷的對(duì)照品混合溶液，濃度分別為芍藥苷 36.2μg·mL-1，芍藥內(nèi)酯苷 20.4μg·mL-1。

1.3.2 供試品溶液 根據(jù)《金匱要略》的記載為參考，分別稱取當(dāng)白芍 30g、當(dāng)歸9g、茯苓 12g、澤瀉12g、川芎15g、白術(shù)15g，放入粉碎機(jī)中粉碎成細(xì)粉，再過80目篩，混勻，得到當(dāng)歸芍藥散。精密稱取當(dāng)歸芍藥散粉末0.2g，置于100mL容量瓶中，用甲醇定容，采用超聲溶解，濾過，再經(jīng)過0.22μm微孔濾膜過濾，得到供試品溶液。

1.3.3 陰性樣品溶液的配制 按處方制備不含芍藥的當(dāng)歸芍藥散浸膏粉各10g，取適量供試品并按“1.3.2”項(xiàng)下制備方法制備陰性對(duì)照溶液。

2 結(jié)果與討論

2.1 專屬性考察

參考相關(guān)文獻(xiàn)[7-11]，經(jīng)過色譜條件的摸索與優(yōu)化，采用 0.2%H3PO4溶液-甲醇（體積比 50∶50）等度洗脫的方法。按照1.2項(xiàng)下色譜條件，取供試品溶液和陰性樣品溶液進(jìn)樣分析，通過供試品溶液色譜圖分析發(fā)現(xiàn)，在230nm條件下，對(duì)照品溶液芍藥苷和對(duì)照品芍藥內(nèi)酯苷具有保留時(shí)間一致的特征峰，所測樣品的色譜峰之間以及和雜質(zhì)色譜峰分離良好，保留時(shí)間分別為13.37和10.86min，而陰性樣品無此特征峰，由此可見，供試品中其它藥物組分對(duì)所測組分并無干擾，如圖1所示。

圖1 HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram

2.2 線性關(guān)系考察

精密吸取 1.0、2.0、4.0、6.0 和 8.0mL 芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷對(duì)照品溶液，置于10mL容量瓶中，用甲醇定容。定容后制備溶液中含芍藥苷7.24、14.48、21.72、28.96、36.20μg·mL-1和含芍藥內(nèi)酯苷 4.08、8.16、12.24、16.32、20.40μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。以峰面積比值為Y，以濃度為X，得到芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷的回歸方程和相關(guān)系數(shù)，其回歸方程分別為Y=1.7826X-0.4794，相關(guān)系數(shù) r=0.9992。Y=1.2368X+0.0304，相關(guān)系數(shù) r=0.9998。

2.3 精密度考察

取相同的供試品溶液，按2.1項(xiàng)下色譜條件，連續(xù)重復(fù)進(jìn)樣5次，測得芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.63%，1.48%，表明儀器精密度良好。

2.4 穩(wěn)定性考察

取同一新鮮配制好的樣品溶液，在 0，2，4，6，8h各進(jìn)樣10μL，測得芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.43%，1.85%，表明芍藥苷、芍藥內(nèi)酯苷在8h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.5 重復(fù)性考察

取同一供試品6份，按1.3.2項(xiàng)下方法分別制備6份供試品，分別測得芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷為4.05，0.77mg·g-1，峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為 1.67%，1.74%，表明方法重復(fù)性良好。

2.6 加樣回收率試驗(yàn)

取同一批號(hào)當(dāng)歸芍藥散樣品6份，每份精密稱定0.5g，分別加入芍藥苷對(duì)照品儲(chǔ)備液（362.0μg·mL-1）1.5mL，芍藥內(nèi)酯苷對(duì)照品儲(chǔ)備液（204.0μg·mL-1）4mL，按1.3.2項(xiàng)下方法，分別制備樣品溶液。用0.45μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，按1.2項(xiàng)中色譜條件，測得各被測成分的平均回收率，見表1。

表1 當(dāng)歸芍藥散中芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷樣回收率（n=6）Tab.1 Recovery of Peoniflorin and Albiflorin in Dangguishaoyao-san（n=6）

2.7 樣品含量測定

平行不同批號(hào)的當(dāng)歸芍藥散樣品3份，分別按1.3.2項(xiàng)下方法分別制成供試品溶液。取20μL注入高效液相色譜儀測定含量，記錄峰面積，分別計(jì)算樣品中芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷的含量。見表2。

表2 當(dāng)歸芍藥散中芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷的含量測定結(jié)果Tab.2 Content of Peoniflorin and Albiflorin in Dangguishaoyao-san

3 結(jié)論

當(dāng)歸芍藥散化學(xué)成分復(fù)雜，本實(shí)驗(yàn)采用高效液相色譜法同時(shí)測定當(dāng)歸芍藥散中代表性成分芍藥苷和芍藥內(nèi)酯苷的含量，測定方法均比較成熟。并應(yīng)用該方法測定了3批當(dāng)歸芍藥散中上述2種活性成分的含量。結(jié)果表明，本法簡便，準(zhǔn)確可靠，專屬性強(qiáng)，穩(wěn)定性好，重復(fù)性好，可用于當(dāng)歸芍藥散質(zhì)量控制，從而保障了當(dāng)歸芍藥散的臨床療效。