2020年1月13日，Nature Biotechnology雜志在線發(fā)表了來自中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所高彩霞課題組和李家洋課題組合作題為“Targeted， random mutagenesis of plant genes with dual cytosine and adenine base editors”的研究論文。

該研究設計了可以從頭突變并促進植物基因的定向進化的基因編輯器STEME-1和第二代STEME-NG。該研究利用這兩個編輯器定向進化水稻OsACC基因并獲得除草劑抗性突變。因此，這兩個STEME將加快植物及作物的性狀發(fā)展與進化，為快速獲得有益農(nóng)藝性狀提供了可能，對農(nóng)作物分子設計育種具有重要意義。該研究得到中國科學院戰(zhàn)略性先導專項、國家自然基金委等項目的經(jīng)費資助。

構(gòu)建新型飽和靶向內(nèi)源基因突變堿基編輯器STEME，并在植物中實現(xiàn)了基因的定向進化和功能篩選

遺傳和變異是生物進化的基礎。長期以來，通過物理（例如紫外線）或化學（例如甲烷磺酸乙酯）方法進行隨機誘變可改善植物的性狀，但勞動強度大且耗時。定向進化（Directed Evolution）則通過創(chuàng)制目標基因的突變文庫，在施加一定選擇壓力下能夠快速獲得目的突變體。目前，植物基因的定向進化通常先通過易錯PCR、DNA合成或DNA重組等方法在體外產(chǎn)生目標基因的突變文庫，再轉(zhuǎn)化到大腸桿菌或酵母中進行功能篩選。然而，由于離開原始的基因組和細胞環(huán)境，篩選出來的基因突變可能并不能完全反映出它在植物中的真實功能。更重要的是，大多數(shù)重要農(nóng)藝性狀無法在大腸桿菌或酵母中進行篩選。因此，建立一種在植物原位進行基因飽和突變和功能篩選的定向進化新方法將有助于加快植物育種及重要功能基因研究的進程。

應用STEME-1和STEME-NG在水稻中定向進化OsACC基因獲得了除草劑抗性突變

研究者將胞嘧啶脫氨酶APOBEC3A和腺嘌呤脫氨酶ecTadA-ecTadA7.10同時融合在nCas9 （D10A）的N端，并將抑制體內(nèi)尿嘧啶糖基化酶UDG的活性的UGI以融合或自由表達的形式置于nCas9 （D10A）的C端，共構(gòu)建了4種形式的雙堿基編輯器STEME （STEME-1至STEME-4）。STEME雙堿基編輯器均可以只在一個sgRNA引導下就可以誘導靶位點C>T和A>G的同時突變，顯著增加了靶基因堿基突變的飽和度及產(chǎn)生突變類型的多樣性。STEME-1在水稻原生質(zhì)體中C>T誘導效率高達61.61%，C>T和A>G同時突變的效率也高達15.50%。為了提高靶基因的堿基覆蓋度，研究者進一步利用能夠識別NG PAM的變體Cas9-NG構(gòu)建了第5個雙堿基編輯器STEME-NG，發(fā)現(xiàn)只需要20個sgRNA就可以對OsACC上編碼56個氨基酸的序列實現(xiàn)近飽和的突變。

為了展示STEME在植物中的定向進化能力，研究者設計了靶向OsACC羧基轉(zhuǎn)移酶結(jié)構(gòu)域上400個氨基酸編碼序列的200個獨立的sgRNA，分別構(gòu)建到STEME-1或STEME-NG雙元載體上。將構(gòu)建好的雙元載體分為27個轉(zhuǎn)化組，每個組內(nèi)混合了等分子量的4至11個sgRNA載體，覆蓋80-142 bp的靶DNA區(qū)域，便于提高轉(zhuǎn)化效率和突變的高通量測序。經(jīng)農(nóng)桿菌介導法轉(zhuǎn)化水稻愈傷，共獲得約6000株水稻再生苗。水培法煉苗10天后，對再生苗噴灑高效氟吡甲禾靈（Haloxyfop）進行篩選，共發(fā)現(xiàn)四個除草劑抗性突變位點：P1927F、W2125C、S1866F和A1884P。除W2125C以外，其余三個抗性位點未曾在植物中有過報道。其中，P1927F與W2125C突變一樣表現(xiàn)出強除草劑抗性，具有較高的生產(chǎn)應用潛能。基于同源蛋白結(jié)構(gòu)模型分析發(fā)現(xiàn)，這些氨基酸突變直接或間接地影響了除草劑結(jié)合口袋的構(gòu)象，從而降低了其對除草劑分子的結(jié)合能力而獲得除草劑抗性。

此外，STEME系統(tǒng)還有望應用于不同細胞系、酵母或動物中的非編碼區(qū)的順式作用元件的調(diào)控、動物致病SNV的修正和抗藥位點的篩選等。

來源：中國科學院遺傳與發(fā)育生物學研究所、國科農(nóng)研院