馮雪貞，肖轉(zhuǎn)泉，陳尚钘，范國榮，廖圣良，王宗德*

(1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，國家林業(yè)和草原局木本香料(華東)工程技術(shù)研究中心，江西 南昌 330045； 2.江西師范大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，江西 南昌 330027)

植物病原真菌不僅危害農(nóng)作物正常生長，給農(nóng)林牧生產(chǎn)造成重大損失，而且會引發(fā)一系列食源性疾病，嚴重威脅人和動物的生命健康。多年以來，人們一直使用的傳統(tǒng)化學(xué)抗菌劑在保護人類健康、農(nóng)作物增產(chǎn)及食品保鮮等方面起到了巨大的作用，但長期使用或使用不當，很容易導(dǎo)致抗藥性和生態(tài)污染等問題，并且有些抑菌劑存在難以降解、毒副作用大等缺點[1-3]。因此，開發(fā)綠色高效的新型植物源抑菌劑極其重要。以天然產(chǎn)物為先導(dǎo)物，通過分子修飾、改性可以合成出具有活性的酯類、醚類、萜類、酰胺類和季銨鹽類等衍生物，其在抗菌、除草方面具有較好的生物活性[4-6]。研究發(fā)現(xiàn)，肟類化合物及其烴基醚衍生物具有良好的抑菌、殺蟲、除草和抗病毒[7-9]等生物活性，由于具有低毒、低殘留等優(yōu)點，近年來逐漸受到研究者們的關(guān)注。植物源肟類化合物及其烴基醚衍生物對植物病原真菌同樣具有較好的抑制作用，黃晶等[10]研究了檸檬醛肟、香茅醛肟及其烴基醚類衍生物對油茶炭疽病菌等真菌的抑制作用，研究表明香茅醛肟對所試植物病原真菌的抑制活性優(yōu)良。但迄今為止，相關(guān)報道還比較少，開發(fā)新型植物源肟類化合物及其烴基醚衍生物，對于新型綠色高效植物源抑菌劑的開發(fā)和應(yīng)用都具有十分重要的意義。本研究選擇價格低廉、綠色可再生的松節(jié)油為初始原料,將松節(jié)油在合成樟腦過程中的主要中間產(chǎn)物莰烯[11]與氧氯化磷和N,N-二甲基甲酰胺進行Vilsmeier-Haack甲酰化反應(yīng)，制得莰烯醛(ω-甲?；ㄏ?[12-13]，然后經(jīng)過肟化反應(yīng)合成得到莰烯醛肟并進行相轉(zhuǎn)移催化醚化反應(yīng)合成莰烯醛肟烴基醚，測試目標產(chǎn)物對植物病原真菌的抑菌活性，以期所合成的莰烯衍生物用作新農(nóng)藥開發(fā)的前體分子。

1 實 驗

1.1 試劑、儀器及菌種

莰烯醛(純度98%)，自制。羥胺鹽酸鹽、溴乙烷、溴代正丙烷、溴代正丁烷、溴代正戊烷、溴化芐等試劑均為市售化學(xué)純。

LDZX-50 KBS立式壓力蒸汽滅菌鍋；SW-CJ-ID型無菌超凈工作臺；GHP-250型智能培養(yǎng)箱；Agilent 5977 A型質(zhì)譜儀、Agilent 7980 B型氣相色譜儀(EI源，70 eV)；Nicolet IR 6700紅外光譜儀(KBr壓片法)；Bruker AVANCE 400型核磁共振儀(TMS為內(nèi)標，CDCl3為溶劑)。

植物病原真菌：水稻紋枯病菌(Thanatephoruscucumeris)，辣椒疫霉病菌(Phytophthoracapsici)，辣椒菌核病菌(Sclerotiniasclerotiorum)，獼猴桃果實擬莖點霉(Phomopsissp.)，玉米赤霉病菌(Fusariumavenaceum)，梨鏈格孢菌(Alternariakikuchiana)，油茶炭疽病菌(Colletotrichumgloeosporioides)，葡萄炭疽病菌(Glomerellacingulata)，毛竹枯梢病菌(Ceratosphaeriaphyllostachydissp.nov.)，松枯梢病病原菌(Sphaeropsissapinea)，七葉樹殼孢菌(Fusicoccumaesuli)，枇杷炭疽病菌(Colletotrichumacutatum)。菌種均由江西農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院森林保護教研室提供。

1.2 莰烯醛肟及其烴基醚的合成

1.2.1合成路線 莰烯醛肟及其烴基醚衍生物的合成路線見圖1。

1.2.2莰烯醛肟(2)的合成 參照文獻[14]，在250 mL磨口錐形瓶中，加入6.4 g碳酸鈉，30 mL水，0.1 mol莰烯醛，攪拌，溶解；8.34 g (0.12 mol)羥胺鹽酸鹽溶于20 mL水中，所成溶液在90 min內(nèi)緩慢滴加至錐形瓶中，加熱升溫至不超過65 ℃。4 h后取樣約1 mL，加入石油醚2～3 mL，振搖，分層后取上層經(jīng)干燥后進行氣相色譜分析，以跟蹤反應(yīng)完成情況。若分析表明反應(yīng)液樣品中莰烯醛含量很少則反應(yīng)完成，冷卻后分出油層，水層用石油醚萃取2次，每次30 mL。萃取液與油層合并，用飽和食鹽水洗去堿性，無水硫酸鈉干燥后，蒸餾回收溶劑，真空蒸餾蒸出產(chǎn)品。

1.2.3莰烯醛肟烴基醚(3a～3e)的合成 參照文獻[15]，將0.02 mol莰烯醛肟(2)、0.05 mol鹵代烴、25 g甲苯加入至150 mL磨口錐形瓶內(nèi)，再加入0.2 g溴化四丁基銨和3 g 40%氫氧化鈉水溶液，攪拌并加熱回流。反應(yīng)24 h后取上層反應(yīng)液少許進行氣相色譜分析，若反應(yīng)液樣品中莰烯醛肟含量很少則反應(yīng)完成。反應(yīng)完成后，冷卻，加20 mL水，分出下層，上層用飽和食鹽水洗滌，干燥后回收甲苯，真空蒸餾得目標化合物3a～3e。

圖1 莰烯醛肟及其烴基醚的合成路線

1.3 抑菌活性測試

采用菌絲生長速率法[16]測定莰烯醛肟及其烴基醚對12種植物病原真菌的抑制作用。以無任何化合物的馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基平板作為空白對照組，百菌清為陽性對照。將莰烯醛肟及其用無菌水配制成質(zhì)量濃度為5 g/L 的溶液，在無菌條件下進行二倍稀釋法得到5個濃度梯度的溶液，分別按一定的比例加入到經(jīng)滅菌處理的馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基中，配制最終質(zhì)量濃度為500、250、125、62.5和31.25 mg/L的含藥培養(yǎng)基平板，每種處理重復(fù)3次。接菌后置于25 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)數(shù)天[17-18]，當對照組的培養(yǎng)基中的菌落直徑長到6.0 cm左右(培養(yǎng)皿直徑為9 cm)，用十字交叉法測量其直徑，取平均值并計算抑制率。公式如下[19]：

菌落直徑=菌落實際生長直徑-菌餅直徑

1.4 毒力回歸方程

莰烯醛肟對12種植物病原真菌進行濃度梯度抑菌試驗，利用DPS 7.0建立毒力回歸方程，以化合物濃度的對數(shù)值為橫坐標(x)，抑制率轉(zhuǎn)換的機率值為縱坐標(y)，毒力回歸方程為：y=a+bx，當y=50%時，求出其EC50。

2 結(jié)果與討論

2.1 莰烯醛肟及其烴基醚的結(jié)構(gòu)分析

2.2 莰烯醛肟及其烴基醚的抑菌活性

2.2.1抑制率 莰烯醛肟及其烴基醚對植物病原真菌的抑制率數(shù)據(jù)可見表1。從表中數(shù)據(jù)可以看出，莰烯醛肟在藥液質(zhì)量濃度為500 mg/L時，對9種植物病原真菌的抑制率高達100%，對2種菌抑制率達到97%以上，遠遠超過百菌清；在質(zhì)量濃度250 mg/L下，對7種菌抑制率達到95%以上；在125 mg/L時，對玉米赤霉病菌的抑制率為96.4%，對油茶炭疽病菌的抑制率為94.3%，對毛竹枯梢病菌的抑制率為97.7%。

表1 莰烯醛肟及其烴基醚的抑菌活性1)

1) A. 水稻紋枯病菌Thanatephoruscucumeris; B. 辣椒疫霉病菌Phytophthoracapsici; C. 辣椒菌核病菌Sclerotiniasclerotiorum; D. 獼猴桃果實擬莖點霉Phomopsis; E. 玉米赤霉病菌Fusariumavenaceum; F. 梨鏈格孢菌Alternariakikuchiana; G. 油茶炭疽病菌Colletotrichumgloeosporioides; H. 葡萄炭疽病菌Glomerellacingulata; J. 毛竹枯梢病菌Ceratosphaeriaphyllostachydis; K. 松枯梢病病原菌Sphaeropsissapinea; L. 七葉樹殼孢菌Fusicoccumaesuli; M. 枇杷炭疽病菌Colletotrichumacutatum;下表同same as in following table

在藥液質(zhì)量濃度為500 mg/L時，莰烯醛肟的烴基醚對12種植物病原真菌的抑制活性低于莰烯醛肟，但對毛竹枯梢病菌、梨鏈格孢菌和玉米赤霉病菌的抑制率均高于(或等于)百菌清。

2.2.2毒力回歸方程及EC50莰烯醛肟對12種植物病原真菌的毒力回歸方程及EC50可見表2。從表2可以看出，莰烯醛肟對油茶炭疽病的抑制效果最好，EC50為39.25 mg/L。莰烯醛肟對水稻紋枯病菌、獼猴桃果實擬莖點霉、玉米赤霉病菌、毛竹枯梢病病原菌的抑制效果也較好，EC50分別為49.21、40.59、45.10和44.99 mg/L。

表2 莰烯醛肟對12種植物病原真菌的毒力回歸方程及EC50

3 結(jié) 論

3.1由莰烯醛與羥胺鹽酸鹽反應(yīng)制得莰烯醛肟，并分別與5種鹵代烴反應(yīng)制得了莰烯醛肟乙基醚(3a)、莰烯醛肟正丙基醚(3b)、莰烯醛肟正丁基醚(3c)、莰烯醛肟正戊基醚(3d)、莰烯醛肟芐基醚(3e)。通過FT-IR、MS和NMR對產(chǎn)物結(jié)構(gòu)進行了確認和表征。

3.2莰烯醛肟及其烴基醚衍生物對上述植物病原真菌皆有一定的抑制作用。莰烯醛肟在藥液質(zhì)量濃度為500 mg/L時，對水稻紋枯病菌等9種植物病原真菌完全抑制；建立的毒力回歸方程相關(guān)系數(shù)基本達0.9，相關(guān)性較好，并且對油茶炭疽病的抑制效果最好，EC50為39.25 mg/L。5種烴基醚在藥液濃度為500 mg/L時，對毛竹枯梢病菌、梨鏈格孢菌和玉米赤霉病菌的抑制率均高于(或等于)百菌清。