王蔚芳, 向 玲, 王 琳, 黃 濱, 李會(huì)濤

適宜濃度的維生素E促進(jìn)半滑舌鰨生長(zhǎng)激素基因的表達(dá)

王蔚芳1, 向 玲2, 王 琳1, 黃 濱1, 李會(huì)濤3

(1. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué)研究院 黃海水產(chǎn)研究所, 青島海洋科學(xué)與技術(shù)試點(diǎn)國(guó)家實(shí)驗(yàn)室 海洋漁業(yè)科學(xué)與食物產(chǎn)出過(guò)程功能實(shí)驗(yàn)室, 山東 青島 266071; 2. 中國(guó)海洋大學(xué) 水產(chǎn)學(xué)院, 山東 青島 266003; 3. 山東百福生物科技有限公司, 山東 濟(jì)寧 273200)

本實(shí)驗(yàn)旨在探究維生素E對(duì)半滑舌鰨垂體組織中生長(zhǎng)激素基因表達(dá)的影響。作者在每千克等氮等能的基礎(chǔ)飼料中分別添加0、400和1 600 mg的DL-α-生育酚乙酸酯 (維生素E)投喂半滑舌鰨()成魚(yú)(464±2.6) g, 進(jìn)行為期8周的養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn); 另外, 在L-15培養(yǎng)基中添加0、18和54 μmol/L的維生素E, 對(duì)半滑舌鰨成魚(yú)(464±2.6) g的垂體細(xì)胞進(jìn)行為期3 d的體外原代培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)。分別取垂體組織和原代細(xì)胞, 通過(guò)熒光實(shí)時(shí)定量PCR分析其mRNA的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明: 垂體組織中mRNA的相對(duì)表達(dá)量隨著飼料中維生素E含量的增加而呈現(xiàn)先升高后下降的變化趨勢(shì), 在400 mg/kg組時(shí)顯著高于其他各組(<0.05); 隨著細(xì)胞培養(yǎng)液中維生素E濃度的升高,mRNA的相對(duì)表達(dá)量顯著增加(<0.05)。由此可見(jiàn), 適宜濃度的維生素E能夠促進(jìn)半滑舌鰨垂體組織中生長(zhǎng)激素基因的表達(dá)。

半滑舌鰨(); 維生素E; 生長(zhǎng)激素基因; 養(yǎng)殖; 垂體原代細(xì)胞

生長(zhǎng)激素是一種由垂體前葉合成和分泌的多肽類激素, 能夠不通過(guò)靶腺而刺激生長(zhǎng), 動(dòng)員脂肪分解, 促進(jìn)蛋白質(zhì)的合成, 抑制葡萄糖的氧化, 提高對(duì)鉀、鈣、磷、硫等元素的利用[1]。相關(guān)研究表明生長(zhǎng)激素能夠促進(jìn)魚(yú)類的骨骼生長(zhǎng)與肌肉蛋白質(zhì)的合成[2]。

維生素E又名生育酚, 最初發(fā)現(xiàn)時(shí)被認(rèn)為是維持動(dòng)物正常生殖所必需的一種脂溶性物質(zhì)[3]。維生素E在魚(yú)類生長(zhǎng)、免疫功能等方面的研究已逐漸成為熱點(diǎn)[4, 5]。攝食維生素E含量為150 mg/kg飼料的點(diǎn)帶石斑魚(yú)(), 其增質(zhì)量率顯著提高[6]。用添加維生素E的配合飼料投喂鯔魚(yú)()幼苗, 能夠有效地促進(jìn)其生長(zhǎng)[7]。關(guān)于維生素E如何調(diào)控魚(yú)類的生長(zhǎng), 是否與生長(zhǎng)激素有關(guān), 至今未見(jiàn)相關(guān)研究報(bào)道, 因此值得進(jìn)一步探討。盡管維生素E是重要的抗氧化劑[8, 9], 但它還被證明可作為基因的調(diào)節(jié)因子[10]。新近水生動(dòng)物研究表明適宜濃度的維生素E能夠促進(jìn)大菱鲆促性腺激素基因的表達(dá)[11]。在陸生動(dòng)物研究中指出, 飼料中添加15 IU/kg維生素E時(shí), 蛋雛鴨血清生長(zhǎng)激素含量顯著高于對(duì)照組[12]; 此外, 青大麥葉提取物(已鑒定為α-生育酚琥珀酸酯)可以促進(jìn)體外培養(yǎng)的大鼠垂體前葉細(xì)胞分泌GH[13]。因此作者假設(shè)維生素E通過(guò)基因調(diào)節(jié)的功能影響生長(zhǎng)激素基因的表達(dá)。

半滑舌鰨()屬鰈形目(Pleuronectiformes)、鰨亞目(Soleoidei)、舌鰨科(Cynoglossidae)、舌鰨屬(), 為中國(guó)的本地種, 主要分布在中國(guó)的黃渤海域[14]。其體型大、生長(zhǎng)快、味道鮮美、高蛋白、營(yíng)養(yǎng)豐富、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高, 在中國(guó)的養(yǎng)殖規(guī)模也逐漸擴(kuò)大[15]。半滑舌鰨與大菱鲆、牙鲆()同為中國(guó)最具發(fā)展?jié)摿Φ墓S化養(yǎng)殖和土池養(yǎng)殖的海水品種[16]。目前已經(jīng)開(kāi)展了關(guān)于半滑舌鰨生長(zhǎng)激素基因在大腸桿菌中原核表達(dá)的研究[17], 以及半滑舌鰨生長(zhǎng)激素基因的多態(tài)性與生長(zhǎng)激素及生長(zhǎng)性狀相關(guān)性的研究報(bào)道[2]; 此外, 在飼料中添加1 200 mg/kg的維生素E可以有效提升半滑舌鰨親魚(yú)的繁殖性能[18], 在飼料中添加1 084.58 mg/kg的維生素E飼喂半滑舌鰨幼魚(yú)84 d, 經(jīng)遲緩愛(ài)德華氏菌攻毒后, 能有效降低其紅細(xì)胞的過(guò)氧化損傷[19]。而關(guān)于半滑舌鰨維生素E和生長(zhǎng)激素關(guān)系的研究未見(jiàn)報(bào)道。因此, 參照半滑舌鰨垂體細(xì)胞體外原代培養(yǎng)方法[20],借助養(yǎng)殖和細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn), 探究不同含量的維生素E與垂體組織中(養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn))和垂體原代培養(yǎng)細(xì)胞中(細(xì)胞實(shí)驗(yàn))mRNA相對(duì)表達(dá)量之間的關(guān)系, 初步討論維生素E促生長(zhǎng)的分子機(jī)制, 并為半滑舌鰨人工配合飼料的研制提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)用魚(yú)

實(shí)驗(yàn)用120條體質(zhì)量為(464±2.6)g健康的1齡半滑舌鰨雌性成魚(yú), 購(gòu)自萊州明波水產(chǎn)有限公司(山東, 萊州), 為當(dāng)年孵化和培育的同一批魚(yú)。

1.2 飼料制備與養(yǎng)殖管理

養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)的飼料中維生素E添加量是參照肖登元等[18]在半滑舌鰨親魚(yú)飼料中的添加量(0、200和1 200 mg/kg)報(bào)道以及作者的預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行設(shè)置。本實(shí)驗(yàn)設(shè)3個(gè)組, 每組設(shè)3個(gè)重復(fù), 每組飼料中維生素E的添加量分別是0、400和1 600 mg/kg。維生素E以DL-α-生育酚乙酸酯(Sigma)的形式按照計(jì)算比例逐級(jí)混勻到次粉中。在基礎(chǔ)飼料中, 以魚(yú)粉、酪蛋白為主要蛋白源, 以魚(yú)油、豆油為主要脂肪源, 飼料配方及營(yíng)養(yǎng)組成如表1。固體原料均過(guò)60目篩, 所有原料充分混合均勻后, 通過(guò)機(jī)械擠壓形成顆粒飼料(4 mm), 并在60℃的烘箱中干燥至濕度為10%, 用密封塑料袋保存在–20℃的冰柜中以供使用[18]。

養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)在萊州明波水產(chǎn)有限公司養(yǎng)殖場(chǎng)進(jìn)行。正式實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前對(duì)所有的魚(yú)投喂7 d的基礎(chǔ)飼料(表1), 以適應(yīng)實(shí)驗(yàn)條件。在測(cè)量魚(yú)體長(zhǎng)和稱重后隨機(jī)分成九組到9個(gè)15 m3的圓形聚乙烯養(yǎng)殖桶中(直徑: 150 cm, 高度: 60 cm)進(jìn)行流水養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn), 每個(gè)桶里放養(yǎng)半滑舌鰨10尾, 養(yǎng)殖用水為過(guò)濾海水, 流速是50 L/min。每3個(gè)養(yǎng)殖桶隨機(jī)分成一組投喂相同的飼料, 每天早晚2次投喂, 投喂率為魚(yú)體質(zhì)量的2%, 進(jìn)行為期8周的養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)期間水溫范圍為24℃~27℃; 鹽度30~31, pH為7.8~8.1。溶解氧含量大于5.65 mg/L。每天早上清除糞便和多余的飼料以保持良好的水質(zhì)條件。

表1 實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)飼料配方組成及營(yíng)養(yǎng)組成

注:1維生素混合物(mg/kg或g/kg 飼料): 硫胺素, 25 mg; 核黃素, 45 mg; 鹽酸吡哆醇, 20mg; 維生素B12, 0.1 mg; 維生素K3, 10 mg; 肌醇, 800 mg; 泛酸, 60 mg; 煙酸, 200 mg; 葉酸, 20 mg; 生物素, 1.20 mg; 維生素A, 32 mg; 維生素D, 5 mg; 維生素E, 0mg; 次粉, 13.67 g;2礦物質(zhì)混合物(mg/kg或g/kg 飼料): 硫酸鎂, 1200 mg; 硫酸銅, 10 mg; 硫酸鋅, 50 mg; 硫酸鐵, 80 mg; 硫酸錳, 45 mg; 氟化鈉, 2 mg; 氯化鈷(1%), 50 mg; 硒代硫酸鈉(1%), 20 mg; 碘酸鈣(1%), 60 mg; 沸石, 13.485 g

1.3 垂體原代細(xì)胞培養(yǎng)

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)基配制

先取4.76 g Hepes和9.6 g L-15培養(yǎng)基, 充分混溶于水, 4 h后用NaOH將pH調(diào)至7.4, 抽濾(除菌), 分裝, 即制成L-15基礎(chǔ)培養(yǎng)基。在L-15基礎(chǔ)培養(yǎng)中加入胎牛血清(終體積為5%)、青霉素(終濃度為100 U/mL)、鏈霉素(終質(zhì)量濃度為100 μg/mL), 即制成完全培養(yǎng)基, 4℃下保存。所有操作在細(xì)胞培養(yǎng)室進(jìn)行, 有專用櫥柜和冰箱放置物品, 所有解剖工具、器皿等經(jīng)高壓消毒后使用, 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中用的水、磷酸緩沖液(PBS)等為無(wú)菌型商品。

1.3.2 細(xì)胞分離

在細(xì)胞培養(yǎng)室的準(zhǔn)備室內(nèi), 用75%酒精浸泡魚(yú)頭后, 無(wú)菌條件下取20條成魚(yú)垂體組織, 移入超凈工作臺(tái)內(nèi)后更換培養(yǎng)液和培養(yǎng)皿, 保證無(wú)菌操作。隨后垂體組織剪成1 mm3小塊, 用PBS沖洗, 加入0.25%的胰蛋白酶, 用量約為組織塊的10倍, 放入18℃水浴鍋中45 min。水浴后用2 mL PBS吹打組織塊, 倒入200目/70μm的尼龍網(wǎng)過(guò)濾, 取濾液以100/min的速度離心10 min, 除去上清液, 并重懸沉淀, 分裝至六孔板, 1 mL/孔, 置于24℃培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3.3 細(xì)胞培養(yǎng)

細(xì)胞培養(yǎng)液中維生素E濃度是參照大菱鲆的相關(guān)研究[11], 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分3組, 每組3個(gè)重復(fù), 維生素E的添加量分別為0、18和54 μmol/L。將維生素E預(yù)先溶解在無(wú)水乙醇中, 然后加入到L-15完全培養(yǎng)基中(無(wú)水乙醇的終濃度為0.1%,), 置于24℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d[20]。

1.4 RNA的提取與cDNA文庫(kù)的構(gòu)建

養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)結(jié)束后, 分別在每個(gè)養(yǎng)殖桶隨機(jī)取3尾魚(yú), 無(wú)菌取出垂體組織; 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)束后, 將每孔垂體細(xì)胞轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中, 以100 g/min的速度離心 10 min之后取細(xì)胞沉淀。加入1 mL TRIzol (Invitrogen, USA), 按照程序提取總RNA, 使用Nanodrop2000定量并調(diào)整至相同濃度備用, 并取適量RNA進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳, 檢測(cè)RNA完整度, 取質(zhì)量較好的RNA作為cDNA文庫(kù)構(gòu)建的模板。

以總RNA模板構(gòu)建cDNA文庫(kù), 選用Prime-Script RT regent Kit with gDNA Eraser試劑盒(Takara, Japan)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn), 操作流程參照該使用說(shuō)明書(shū)進(jìn)行, 制成的cDNA文庫(kù)保存于–20℃冰柜中。

1.5 定量PCR分析

在GeneBank中獲得半滑舌鰨生長(zhǎng)激素基因序列(HQ334196), 通過(guò)Primer Premier 5軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì), 由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行合成, 引物濃度為10 μmol/L。應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR(qPCR)分析不同水平維生素E條件處理下生長(zhǎng)激素基因的表達(dá)情況。以20×cDNA稀釋液為模板, 進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增, 參照TB GreenII(Tli RNaseH Plus)(Code No. RR820A)試劑盒說(shuō)明, 擴(kuò)增體系為20 μL(包括10 μL TB GreenII (Tli RNaseH Plus), 0.8 μL PCR Forward Primer, 0.8 μL PCR Reverse, 1 μL cDNA模板, 7.4 μL RNase-free dH2O)。為減小實(shí)驗(yàn)誤差, 每個(gè)樣品均設(shè)置3個(gè)重復(fù), 18S核糖體RNA基因作為內(nèi)參引物[21], 與目的基因在相同條件下進(jìn)行擴(kuò)增, 引物序列見(jiàn)表2。反應(yīng)按95℃ 10 min, 95℃ 10 s, 58.4℃ 15 s, 72℃ 20 s, 再依次按照95℃ 15 s, 60℃ 15 s, 95℃ 15 s繪制溶解曲線。實(shí)驗(yàn)中PCR產(chǎn)物通過(guò)溶解曲線確定擴(kuò)增準(zhǔn)確性及特異性, 使用2–??Ct法計(jì)算mRNA相對(duì)表達(dá)水平[22]。

表2 實(shí)時(shí)熒光定量PCR引物序列

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

研究中所有實(shí)驗(yàn)均設(shè)置3個(gè)平行處理, 所得數(shù)據(jù)均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差表示, 并通過(guò)SPSS 19軟件進(jìn)行one-way ANOVA分析及基于LSD最小顯著差異法的多重比較。當(dāng)值<0.05時(shí), 認(rèn)為具有顯著差異。

2 結(jié)果

從圖1中可知, 攝食維生素E含量為400 mg/kg飼料的實(shí)驗(yàn)組的魚(yú)的表達(dá)水平顯著高于其他各組(<0.05); 當(dāng)維生E添加量為1 600 mg/kg時(shí),表達(dá)量為1.91%, 顯著高于對(duì)照組的1.13%(<0.05)。在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中, 隨著維生E濃度的升高,mRNA表達(dá)量顯著上升(<0.05), 當(dāng)維生E濃度為54 μmol/L時(shí),mRNA表達(dá)量最大(圖2)。

圖1 飼料中維生素E含量對(duì)半滑舌鰨垂體組織中生長(zhǎng)激素mRNA表達(dá)的影響

圖2 維生素E濃度對(duì)半滑舌鰨垂體原代細(xì)胞中生長(zhǎng)激素mRNA表達(dá)的影響

3 討論

魚(yú)類生長(zhǎng)激素是由魚(yú)類腦垂體前葉合成分泌的由191個(gè)氨基酸組成的單鏈多肽, 為非糖蛋白激素, 且具有明顯的種族特異性[23]。其作為信號(hào)分子與遍布組織的生長(zhǎng)激素受體結(jié)合, 啟動(dòng)細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制, 活化一系列信號(hào)蛋白, 調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。生長(zhǎng)激素對(duì)機(jī)體的主要代謝功能表現(xiàn)為促進(jìn)體組織的生長(zhǎng)及細(xì)胞體積和數(shù)量的增加[24]。研究表明飼料中添加維生素E對(duì)羅非魚(yú)()[25]、鯉魚(yú)()[26]、云紋石斑魚(yú)()[27]的生長(zhǎng)有明顯的促進(jìn)作用。維生素E的促生長(zhǎng)作用是否與生長(zhǎng)激素有關(guān)？目前關(guān)于維生素E調(diào)控生長(zhǎng)激素水平的研究報(bào)道有限且集中在陸生動(dòng)物中, 但其體內(nèi)、體外研究結(jié)果相似, 即維生素E可以提高生長(zhǎng)激素水平[12, 13, 28]。在本養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)中, 飼料中添加維生素E顯著上調(diào)半滑舌鰨mRNA的表達(dá)量(<0.05), 這提示維生素E有可能參與并促進(jìn)了mRNA的表達(dá)。為了規(guī)避體內(nèi)眾多因素的干擾, 作者開(kāi)展了體外細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn), 進(jìn)一步驗(yàn)證維生素E和mRNA的表達(dá)的相關(guān)性。在體外垂體原代細(xì)胞培養(yǎng)中,mRNA表達(dá)量隨著細(xì)胞培養(yǎng)液中維生E濃度的升高而顯著增加(<0.05), 證實(shí)了維生素E確實(shí)參與并促進(jìn)了mRNA的表達(dá), 也進(jìn)一步為養(yǎng)殖實(shí)驗(yàn)的結(jié)論提供了依據(jù)。

雖然維生素E參與了mRNA的表達(dá), 但本實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)顯示維生素E的應(yīng)用劑量會(huì)影響mRNA的表達(dá)水平。在飼料中添加400 mg/kg維生素E時(shí),mRNA表達(dá)量最高, 而進(jìn)一步添加至1 600 mg/kg時(shí)其表達(dá)量顯著降低(<0.05), 這也與實(shí)驗(yàn)魚(yú)的生長(zhǎng)數(shù)據(jù)吻合, 即1 600 mg/kg時(shí)半滑舌鰨的增質(zhì)量率顯著低于400 mg/kg組(<0.05), 且對(duì)應(yīng)的半滑舌鰨的死亡率顯著高于400 mg/kg組(<0.05)(數(shù)據(jù)待發(fā)表)。這說(shuō)明mRNA表達(dá)量受維生素E劑量的影響。相關(guān)研究也指出, 維生素E缺乏或者過(guò)量都會(huì)影響魚(yú)的生長(zhǎng)[29]。然而本研究體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒(méi)有出現(xiàn)下調(diào)現(xiàn)象, 這可能與維生素E的濃度設(shè)置有關(guān), 因?yàn)槠錆舛忍荻鹊脑O(shè)置是參考相關(guān)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)而沒(méi)有進(jìn)一步增加其梯度, 在今后開(kāi)展相關(guān)研究實(shí)驗(yàn)時(shí)有必要考慮這一點(diǎn)。目前, 幾乎未見(jiàn)關(guān)于維生素E和mRNA表達(dá)的相關(guān)報(bào)道, 其相互關(guān)系和作用機(jī)制值得進(jìn)一步探討和研究。

關(guān)于維生素E調(diào)控基因表達(dá)的機(jī)制尚未十分明確。相關(guān)研究指出,mRNA的合成依靠Ca2+胞吐作用方式, 且環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白(CREB)的磷酸化在mRNA合成表達(dá)的信號(hào)通路中起著關(guān)鍵的作用[30]。Ca2+濃度的上調(diào)會(huì)抑制CREB磷酸化過(guò)程, 從而可能影響mRNA的轉(zhuǎn)錄過(guò)程[31]。據(jù)此分析, 維生素E作為抗氧化劑能與氧化型低密度脂蛋白進(jìn)行有效拮抗刺激Ca2+的攝入作用, 從而抑制細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度的升高[32], 引起下游信號(hào)調(diào)控基因的表達(dá)。另外一種可能則是維生素E通過(guò)與生育酚轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白或者ATP結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白結(jié)合的方式直接轉(zhuǎn)運(yùn)到垂體細(xì)胞內(nèi), 作為基因調(diào)節(jié)因子, 從而影響mRNA合成表達(dá)。也可能是維生素E通過(guò)改變相關(guān)代謝酶的活性(蛋白激酶C、磷酸酯酶A2等)[33, 34]引起下游信號(hào)蛋白CREB磷酸化從而調(diào)節(jié)mRNA的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明了維生素E對(duì)mRNA表達(dá)的促進(jìn)作用, 且為證明維生素E作為基因調(diào)節(jié)因子提供了依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究表明維生素E能夠上調(diào)mRNA的表達(dá), 但應(yīng)用劑量要適宜。在本實(shí)驗(yàn)條件下, 飼料中添加400 mg/kg維生素E時(shí),mRNA表達(dá)量最高, 而進(jìn)一步添加至1 600 mg/kg時(shí)會(huì)抑制其表達(dá)。

[1] 劉守仁. 生長(zhǎng)激素作用的分子機(jī)制[J]. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué), 2001, S1: 51-53. Liu Shouren. Molecular mechanism of growth hormone action[J]. Xinjiang Agricultural Science, 2001, S1: 51- 53.

[2] 趙君麗, 何峰, 溫海深, 等. 雄性半滑舌鰨GH基因多態(tài)性與激素水平及生長(zhǎng)性狀相關(guān)性分析[J]. 中國(guó)海洋大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2014, 44(12): 35-40. Zhao Junli, He Feng, Wen Haishen, et al. Correlation between the polymorphism of GH gene of male half- smooth tongue sole and their growth traits and hormone content[J]. Periodical of Ocean University of China, 2014, 44(12): 35-40.

[3] Bender D A. Nutritional biochemistry of the vitamins[M]. New York: Cambaridge University Press, 1995: 87-105.

[4] Alves Martins D, Afonso L O B, Hosoya S, et al. Effects of moderately oxidized dietary lipid and the role of vita-min E on the stress response in Atlantic halibut (L.)[J]. Aquaculture, 2007, 272(1-4): 573-580.

[5] Jobling M. Fish nutrition research: past, present and future[J]. Aquaculture International, 2016, 24(3): 767-786.

[6] 邢克智, 郭永軍, 陳成勛, 等. 維生素E對(duì)點(diǎn)帶石斑魚(yú)生長(zhǎng)及其組織抗氧化性能的影響[J]. 飼料研究, 2015, 14: 48-52, 60. Xing Kezhi, Guo Yongjun, Chen Chengxun, et al. Effects of vitamin E on growth and antioxidant properties of grouper[J]. Feed Research, 2015, 14: 48-52, 60.

[7] Wassef E A, Masry M H, Mikhail F R. Growth enhancement and muscle structure of striped mullet,L. fingerlings by feeding algal meal- based diets[J]. Aquaculture Research, 2001, 32(1): 315- 322.

[8] Packer J E, Slater T F, Willson R L. Direct observation of a free radical interaction between vitamin E and vitamin C[J]. Nature, 1979, 278: 737-738.

[9] 肖濤, 王維娜, 王安利, 等. 維生素E對(duì)水生動(dòng)物抗氧化作用的研究進(jìn)展[J]. 海洋科學(xué), 2007, 31(5): 76- 79. Xiao Tao, Wang Weina, Wang Anli, et al. Research progress on antioxidant effect of vitamin E on aquatic animals[J]. Marine Sciences, 2007, 31(5): 76-79.

[10] Galli F, Azzi A, Birringer M, et al. Vitamin E: emerging aspects and new directions[J]. Free Radical Biology and Medicine, 2017, 102: 16-36.

[11] Huang Bin, Wang Na, Shi Bao, et al. Vitamin E stimulates the expression of gonadotropin hormones in primary pituitary cells of turbot ()[J]. Aquaculture, 2019, 509: 47-51.

[12] 王思維, 王安. 維生素E對(duì)籠養(yǎng)蛋雛鴨免疫功能及血液中激素指標(biāo)的影響[J]. 中國(guó)飼料, 2013, 5: 26-29.Wang Siwei, Wang An. Effects of vitamin E on immune function and hormone index in caged duck[J]. China Feed, 2013, 5: 26-29.

[13] Badamchian M, Spangelo B L, Bao Y, et al. Isolation of a vitamin E analog from a green barley leaf extract that stimulates release of prolactin and growth hormone from rat anterior pituitary cells invitro[J]. Journal of Nutritional Biochemistry, 1994, 5(3): 145-150.

[14] 柳學(xué)周. 半滑舌鰨繁殖及養(yǎng)殖技術(shù)(上)[J]. 科學(xué)養(yǎng)魚(yú), 2006, 10: 16-17. Liu Xuezhou. Artificial propagation and culture technique of half-smooth tongue-sole (continued)[J]. Scientific Fish Farming, 2006, 10: 16-17.

[15] 柳學(xué)周, 莊志猛. 半滑舌鰨繁育理論與養(yǎng)殖技術(shù)[M]. 北京: 中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社, 2014: 428. Liu Xuezhou, Zhuang Zhimeng. Theory of artificial propagation[M]. Beijing: China Agriculture Press, 2014: 428.

[16] 宋文濤. 我國(guó)半滑舌鰨養(yǎng)殖及研究進(jìn)展[J]. 科技經(jīng)濟(jì)導(dǎo)刊, 2016, 20: 95. Song Wentao. Advances in the farming and the research of tongue sole in China[J]. Technology and Economic Guide, 2016, 20: 95.

[17] 馬騫, 柳淑芳, 莊志猛, 等. 半滑舌鰨生長(zhǎng)激素及其受體基因的原核表達(dá)[J]. 中國(guó)水產(chǎn)科學(xué), 2012, 19(6): 956-962.Ma Qian, Liu Shufang, Zhuang Zhimeng, et al. Prokar-yotic expression of growth hormone and its receptor genes in the tongue sole ()[J]. Journal of Fishery Sciences of China, 2012, 19(6): 956-962.

[18] 肖登元, 梁萌青, 王新星, 等. 飼料中添加不同水平的維生素E對(duì)半滑舌鰨()親魚(yú)繁殖性能及后代質(zhì)量的影響[J]. 漁業(yè)科學(xué)進(jìn)展, 2015, 36(2): 125-132. Xiao Dengyuan, Liang Mengqing, Wang Xinxing, et al. Effects of different levels of dietary vitamin E on the reproductive performance and offspring quality of tongue sole ()[J]. Progress in Fishery Sciences, 2015, 36(2): 125-132.

[19] 朱國(guó)霞, 黃亞冬, 程民杰, 等. 維生素E對(duì)半滑舌鰨抗遲緩愛(ài)德華氏菌感染的影響[J]. 飼料研究, 2013, 9: 1-4.Zhu Guoxia, Huang Yadong, Cheng Minjie, et al. Effects of vitamin E oninfection in half- smooth tongue-sole[J]. Feed Research, 2013, 9: 1-4.

[20] 黃濱, 王娜, 史寶, 等. 半滑舌鰨垂體細(xì)胞體外原代培養(yǎng)方法研究[J]. 水產(chǎn)研究, 2017, 4(3): 71-78. Huang Bin, Wang Na, Shi Bao, et al. The primary culture method on pituitary cellsof half-smooth tongue sole[J]. Open Journal of Fishe-ries Research, 2017, 4(3): 71-78.

[21] Shi Bao, Liu Xuezhou, Xu Yongjiang, et al. Molecular characterization of three gonadotropin subunits and their expression patterns during ovarian maturation in[J]. International Journal of Mole-cular Sciences, 2015, 16: 2767-2793.

[22] Livak K J, Schmittgen T D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2–ΔΔCtmethod[J]. Methods, 2001, 25: 402-408.

[23] 匡剛橋, 劉臻, 魯雙慶, 等. 魚(yú)類生長(zhǎng)激素基因的研究現(xiàn)狀及展望[J]. 水利漁業(yè), 2006, 26(6): 1-3. Kuang Gangqiao, Liu Zhen, Lu Shuangqing. Status and prospects about the research of growth hormone genes in fishes[J]. Journal of Water and Fishery, 2006, 26(6): 1-3.

[24] 李雨萌, 洪盼, 蘭海楠, 等. 生長(zhǎng)激素促進(jìn)細(xì)胞增殖機(jī)理的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)畜牧獸醫(yī), 2015, 42(1): 147-152.Li Yumeng, Hong Pan, Lan Hainan. Research progress on mechanism of growth hormone promoting cell gro-wth[J]. China Animal Husbandry & Veterinary Medicine, 2015, 42(1): 147-152.

[25] 佐藤秀一, 竹內(nèi)俊郎, 渡邊武. 羅非魚(yú)對(duì)VE的需求量及其與飼料脂質(zhì)含量的關(guān)系[J]. 水利漁業(yè), 1989, 6: 48-51, 54. Sato Syuuiti, Takeuti Tosirou, Watanabe Takesi. The demand of VE for tilapia and its relationship with feed lipid content[J]. Water Fisheries, 1989, 6: 48-51, 54.

[26] 蔡中華, 邢克智, 董雙林, 等.維生素E對(duì)鯉魚(yú)健康的影響[J]. 動(dòng)物學(xué)報(bào), 2001, 47(S1): 120-124. Cai Zhonghua, Xing Kezhi, Dong Shuanglin, et al. Effects of vitamin E on carp health[J]. Journal of Animal, 2001, 47(S1): 120-124.

[27] 張艷亮, 彭士明, 高權(quán)新, 等. 飼料維生素E水平對(duì)云紋石斑魚(yú)幼魚(yú)生長(zhǎng)、營(yíng)養(yǎng)及免疫指標(biāo)的影響[J]. 海洋漁業(yè), 2015, 37(2): 156-163.Zhang Yanliang, Peng Shiming, Gao Quanxin, et al. Effects of dietary vitamin E contents on growth, nutrition and immunity in juvenile[J]. Marine Fisheries, 2015, 37(2): 156-163.

[28] Chany W, Combs G, Scanes C J. The effects of dietary vitamin E and selenium deficiencies on plasma thyroid and thymic hormone concentrations in the chicken[J]. Developmental & Comparative Immunology, 2005, 29(3): 265-273.

[29] 張志強(qiáng), 蔣明, 文華, 等. 胭脂魚(yú)幼魚(yú)對(duì)飼料中維生素E需要量的研究[J].西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版), 2017, 45(2): 23- 30, 36. Zhang Zhiqiang, Jing Ming, Wen Hua, et al. Dietary vitamin E requirement of juvenile Chinese sucker (). Journal of Northwest A &F University (Nat. Sci. Ed.), 2017, 45(2): 23-30, 36.

[30] 丁曉聰. 喹賽多調(diào)控大鼠垂體腺瘤3細(xì)胞生長(zhǎng)激素表達(dá)的機(jī)理研究[D]. 武漢: 華中農(nóng)業(yè)大學(xué), 2016. Ding Xiaocong. Study on the mechanism of Cyadox regulating growth hormone expression in GH3 cells of pituitary adenoma in rats[D]. Wuhan: Huazhong Agricultural University, 2016.

[31] 宋楊, 張海燕, 孫雅萍, 等. 慢性鋁暴露對(duì)大鼠海馬鈣離子穩(wěn)態(tài)及CaMKⅡ和CREB活性的影響[J]. 中國(guó)老年學(xué)雜志, 2015, 35(21): 6001-6005. Song Yang, Zhang Haiyan, Sun Yaping, et al. Effect of chronic aluminum exposure on calcium homeostasis and activities of CaMKⅡ and CREB in hippocampus of rats[J]. Chinese Journal of Gerontology, 2015, 35(21): 6001-6005.

[32] 徐雅琴, 唐朝樞. 氧化型低密度脂蛋白和抗氧化劑對(duì)人血管內(nèi)皮細(xì)胞鈣轉(zhuǎn)運(yùn)的影響[J]. 中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志, 2000, 8(1): 32-34.Xu Yaqin, Tang Chaoshu. The Effect of oxidized low- density lipoprotein and antioxidant on calcium transportation of human vascular endothelial cells[J]. Chinese Journal of Arteriosclerosis, 2000, 8(1): 32-34.

[33] Mahoney C W, Azzi A. Vitamin E inhibits protein kinase c activity[J]. Biochemical and Biophysical Research Communications, 1988, 154: 694-697.

[34] 左兆云, 羅海玲. 維生素E的基因調(diào)控作用[J]. 中國(guó)草食動(dòng)物科學(xué), 2012, S1: 116-119. Zuo Zhaoyun, Luo Hailing. Gene regulation of vitamin E[J]. China Herbivore Science, 2012, S1: 116-119.

An appropriate concentration of vitamin E promotes gene expression of growth hormone in

WANG Wei-fang1, XIANG Ling2, WANG Lin1, HUANG Bin1, LI Hui-tao3

(1.Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Pilot National Laboratory for Marine Science and Technology of Qingdao, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Qingdao 266071, China; 2.College of Fisheries, Ocean University of China, Qingdao 266003, China; 3.Shandong Baifu Biotech Co., Ltd., Jining 273200, China)

This study aimed to investigate the effect of vitamin E on expression of the growth hormone genein pituitary tissues of half-smooth tongue sole (). DL-alpha-tocopherol acetate was added to the basic diet (vitamin E) at concentrations of 0, 400, and 1600 mg/kg diet to feed (464 ± 2.6) g semi-smooth tongue sole for 8 weeks. In addition, 0, 18, and 54 μmol/L vitamin E were added to L-15 medium for primary pituitary cell culture for 3 d. The expression ofin pituitary tissues and primary pituitary cells was analyzed by real-time quantitative PCR. The results showed that in theexperiment,mRNA expression significantly (0.05) increased when dietary vitamin E increased from 0 to 400 mg/kg and then significantly decreased in the group that

1600 mg/kg (0.05). In theexperiment, the expression level ofincreased significantly with increasing vitamin E concentration (0.05). Therefore, the proper concentration of vitamin E could promote the expression ofin the pituitary tissue of half-smooth tongue sole.

; vitamin E; growth hormone gene; aquaculture; primary pituitary cell

Aug. 2, 2019

[National Natural Science Foundation of China, No. 31872578, No.31502177]

S968.9

A

1000-3096(2020)02-0113-07

10.11759/hykx20190802001

2019-08-02;

2019-10-14

國(guó)家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(31872578); 國(guó)家自然科學(xué)基金青年項(xiàng)目(31502177)

王蔚芳(1980-), 女, 吉林通化人, 副研究員, 主要從事水產(chǎn)動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)相關(guān)研究, E-mail: wangwf@ysfri.ac.cn; 李會(huì)濤,通信作者, E-mail: yulees@163.com

(本文編輯: 譚雪靜)