陳源 潘鶴立 尤有利 吳玉華 潘東明 余文權(quán)

摘?要：探討金柑果實(shí)發(fā)育過(guò)程中總酚含量、總黃酮含量及總酚酸含量的動(dòng)態(tài)變化差異。以尤溪金柑品種金彈為試驗(yàn)材料，對(duì)不同生長(zhǎng)發(fā)育期金柑果實(shí)中總酚含量、總黃酮含量及總酚酸含量進(jìn)行檢測(cè)分析。結(jié)果表明：隨著成熟度的增加，花后55～65 d金柑果實(shí)中總黃酮含量和總酚酸含量隨著成熟度的增加而急劇減少，花后85 d左右變化平緩，到接近成熟的花后125 d左右，黃酮含量和酚酸含量小幅上升后下降;果皮中的黃酮含量和酚酸含量大于果肉。金柑果實(shí)含有豐富的酚類(lèi)物質(zhì)，隨著果實(shí)的生長(zhǎng)發(fā)育呈現(xiàn)逐漸降低的趨勢(shì);金柑果實(shí)總酚與類(lèi)黃酮含量呈顯著正相關(guān);金柑幼果比成熟果具有更高的酚類(lèi)物質(zhì)和更強(qiáng)的抗氧化能力。

關(guān)鍵詞：金柑;果實(shí);酚類(lèi)物質(zhì);不同成熟期

中圖分類(lèi)號(hào)：S666?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A?文章編號(hào)：0253-2301（2020）11-0007-05

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2020.11.002

Abstract： The dynamic changes of total phenol content， total flavonoid content and total phenolic acid content in Fortunella crassifolia during the fruit development were studied. The contents of total phenols， total flavonoids and total phenolic acids in Fortunella crassifolia fruit at different growth stages were determined and analyzed by using the variety of kumquat in Youxi as the experimental material. The results showed that： the contents of total flavonoids and total phenolic acids in the fruit of kumquat decreased sharply with the increase of maturity at 55-65 days after flowering， and changed gently at around 85 days after flowering， and then at about 125 days after flowering， the flavonoid content and phenolic acid content increased slightly and then decreased after 125 days after flowering; The flavonoid content and phenolic acid content in the pericarp was higher than that in the flesh. The fruit of kumquat was rich in phenolic substance and it tended to decrease with the growth and development of the fruit. The content of total phenols and flavonoids in the fruit of kumquat was positively correlated. The young fruit of kumquat had higher phenolic substance and stronger antioxidant ability than the ripe fruit.

Key words： Fortunella crassifolia; Fruit; Phenolic substance; Different mature period

柑橘原產(chǎn)于我國(guó)，有4000多年的栽培歷史。柑橘是世界第一大果樹(shù)品種，種植面積和產(chǎn)量在世界百果中均居首位[1]。我國(guó)柑橘資源豐富，優(yōu)良品種繁多，與其他水果相比，存在橘皮和種子等廢料多的問(wèn)題。柑橘加工業(yè)產(chǎn)生的大量皮渣如果僅作為動(dòng)物飼料或肥料是不能完全消耗掉，這對(duì)生態(tài)環(huán)境造成巨大的影響[2]。金柑Fortunella crassifolia Swingle屬蕓香科金柑屬植物，與柑橘屬、枳屬同為蕓香科植物，是我國(guó)特有的柑橘類(lèi)型。近年來(lái)，隨著避雨栽培技術(shù)的推廣，金柑產(chǎn)業(yè)發(fā)展迅速。尤溪金柑作為金柑中的一個(gè)優(yōu)良品種獲得良好的市場(chǎng)份額，但其在生產(chǎn)過(guò)程中疏除的落花落果常被作為廢棄物丟棄，未能被充分利用，造成資源的浪費(fèi)。金柑果肉和果皮中均含有多種黃酮類(lèi)等生物活性成分，金柑中黃酮有良好的抗氧化、促進(jìn)胃腸道功能、抗油脂化等作用[2-6]。近年來(lái)，已有研究人員對(duì)柑橘皮中的酚酸類(lèi)物質(zhì)進(jìn)行了深入研究，但大多數(shù)是對(duì)柑橘不同器官和不同品種的酚類(lèi)物質(zhì)研究[7-10]，尚未對(duì)不同發(fā)育期的金柑活性物質(zhì)進(jìn)行研究。本研究對(duì)金柑果實(shí)不同生長(zhǎng)發(fā)育期酚酸和黃酮的含量進(jìn)行分析，分析酚類(lèi)物質(zhì)果實(shí)成熟度之間的相互關(guān)系，同時(shí)對(duì)不同生長(zhǎng)發(fā)育期金柑果實(shí)各個(gè)組織部位的主要黃酮類(lèi)成分含量進(jìn)行測(cè)定，旨在為金柑果實(shí)的深加工及綜合利用提供理論依據(jù)。

1?材料與方法

1.1?供試樣品及制備

試驗(yàn)所用金柑果實(shí)采自福建省尤溪縣的金彈Fortunella crassifolia Swing品種鮮果。在金柑第1次開(kāi)花（6月15日）時(shí)，對(duì)其進(jìn)行標(biāo)記，分別在花后55、65、85、105、115、125、135 d采集，果實(shí)中等大小。采摘后立即于-40℃冷凍保存。

制備樣品時(shí)將冷凍果實(shí)解凍，用清水洗凈，手工剝皮將其分為果皮、果肉兩部分，然后分別打漿均勻，然后取50～100 g 于凍干機(jī)冷凍干燥48 h，凍干品經(jīng)粉碎過(guò)60 目篩，儲(chǔ)存于-40℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2?試劑和儀器

11種化合物標(biāo)準(zhǔn)品，包括沒(méi)食子酸Gallic acid綠原酸chlorogenic acid、咖啡酸caffeic acid、蘆丁rutin、香豆酸p-Coumaric acid、阿魏酸ferulic acid、芥子酸sinapic acid均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;乙腈、乙酸為色譜純（Merck德國(guó)公司）;超純水為自制;其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

L2000型高效液相色譜儀（日本日立公司），配有紫外檢測(cè)器、四元泵、柱溫箱、自動(dòng)進(jìn)樣器等;Sartorius BS224S分析天平（德國(guó)賽多利斯公司）;TU1810紫外分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司）;BPG9140A電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科技有限公司）; FW100高速萬(wàn)能粉碎機(jī)（天津泰斯特儀器有限公司）;ALLEGRATM64R高速冷凍離心機(jī)（美國(guó)BECKMAN公司）。

1.3?試驗(yàn)方法

1.3.1?樣品溶液的制備?先將金柑樣品果肉與果皮分離冷凍干燥過(guò)60目備用;0.1 g樣品用1 mL 70%甲醇混合10 min室溫，9000 r·min-1，15 min 4℃離心，重復(fù)3次，合并上清液于容量瓶中，用甲醇定容;用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾備用。

1.3.2?總黃酮含量的測(cè)定?稱取10 mg蘆丁，用70%甲醇溶解后定容至100 mL。之后將蘆丁溶液用70%乙醇稀釋成0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 μg·mL-1，各吸取1 mL于試管中，加70%乙醇1 mL，加入0.3 mL 5%亞硝酸鈉，6 min后加入0.3 mL 10%亞硝酸鋁，6 min后再加入2 mL 2 mol·L-1氫氧化鈉，10 min后于分光光度計(jì)波長(zhǎng)510 nm下測(cè)吸光值OD。以吸光值為縱坐標(biāo)，蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液的濃度為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

從提取液中吸取1 mL，加入1 mL 70%甲醇，加入0.3 mL 5%亞硝酸鈉，靜置6 min后，加入0.3 mL 10%亞硝酸鋁，再靜置6 min后，加入2mL 2 mol·L-1氫氧化鈉，放置10 min后在510 nm下測(cè)吸光值。

1.3.3?總酚含量的測(cè)定?稱取10 mg沒(méi)食子酸，用70%乙醇溶解后定容至100 mL。之后將沒(méi)食子酸溶液用70%乙醇稀釋成0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 μg·mL-1，在避光條件下，取200 μL過(guò)濾后的樣品提取液，加入2.5 mL 10%（v/v）福林酚溶液，充分搖勻，在室溫下培養(yǎng)2 min，加入質(zhì)量濃度為75 g·L-1的Na2CO3溶液2 mL，充分混勻后用蒸餾水定容至10 mL刻度線并振蕩混勻。50℃水浴20 min，快速冷卻至室溫，以相應(yīng)試劑作空白，在最大吸光值765 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值。用沒(méi)食子酸作標(biāo)樣制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果以每克干樣所含沒(méi)食子酸總量（mg·g-1）表示。

精確移取提取液1 mL，按照繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線的方法進(jìn)行顯色，于最大吸收波長(zhǎng)765 nm處測(cè)吸光度，計(jì)算金柑幼果總酚含量。金柑幼果總酚質(zhì)量濃度計(jì)算方法為：

A=0.6185C-0.1679

總酚得率（%）=（A+0.1697）×V/1.5 m

式中：A為試樣測(cè)定時(shí)所得的吸光度;

C為沒(méi)食子酸式樣的測(cè)定濃度（μg·mL-1）;

V為待測(cè)液體積（mL）;

m為試樣的質(zhì)量（g）。

1.3.4?總酚酸含量的測(cè)定?優(yōu)化后的色譜條件為色譜柱：MerckLiChrospher_100RP18e（250 mm×4.0 mm）;流動(dòng)相：2%乙酸水溶液和乙腈，流速：0.8 mL·min-1，進(jìn)樣量：10 μL，柱溫：30℃，檢測(cè)波長(zhǎng)：280 nm，同時(shí)檢測(cè)7種酚酸類(lèi)化合物。流動(dòng)相梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

1.4?統(tǒng)計(jì)分析方法

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 13.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。其中，主成分分析調(diào)用Factor 過(guò)程，以總酚酸含量的測(cè)定歐氏距離測(cè)距，用最長(zhǎng)距離法（Furthest neighbor）測(cè)量類(lèi)間距，進(jìn)行聚類(lèi)分析。

2?結(jié)果與分析

2.1?不同生長(zhǎng)發(fā)育期金柑果實(shí)中總黃酮含量變化

從圖1可以看出，金柑果皮和果肉中總黃酮含量隨著果實(shí)的成熟不斷下降，分別從花后55 d到花后135 d含量平穩(wěn)下降，其中果皮中總黃酮含量在花后115 d到花后125 d期間急速下降。果皮中總黃酮含量在花后45 d時(shí)最高，達(dá)到19.50 mg·g-1，果肉中總黃酮含量在花后55 d達(dá)到12.95 mg·g-1。金柑果實(shí)中總黃酮含量表現(xiàn)為果皮>果肉。

2.2?不同生長(zhǎng)發(fā)育期金柑果實(shí)中總酚酸含量變化

不同生長(zhǎng)發(fā)育期的金柑果皮中總酚酸含量變化趨勢(shì)如圖2。從圖2可以看出，金柑果肉和果皮總酚酸含量均呈現(xiàn)下降-上升-下降的趨勢(shì)，其中果皮總酚酸含量在花后125 d上升到最高后開(kāi)始下降，果肉總酚酸含量在花后115 d上升到最高后開(kāi)始下降。

2.3?不同生長(zhǎng)發(fā)育期金柑果實(shí)中總酚含量變化

從圖3可以看出，果皮和果肉中總酚含量隨著果實(shí)的成熟，不斷下降，分別從花后55 d到花后135 d含量平穩(wěn)下降，其中果皮中總酚含量在花后115 d到花后125 d期間急速下降。果皮中總酚含量在花后55 d時(shí)最高達(dá)到19.57 mg·g-1，果肉中總酚的含量在花后55 d達(dá)到13.36 mg·g-1。金柑果實(shí)中總酚含量表現(xiàn)為果皮>果肉。

2.4?聚類(lèi)分析

分別對(duì)金柑果皮和果實(shí)不同生長(zhǎng)發(fā)育期14個(gè)樣品的總酚、總黃酮和總酚酸含量進(jìn)行Q型和R型聚類(lèi)分析，以每個(gè)成分的含量作為變量，由SPSS 13.0軟件利用歐氏距離作為樣品的測(cè)定進(jìn)行聚類(lèi)分析，結(jié)果如圖4、5。Q型聚類(lèi)結(jié)果（圖4）顯示：不同生長(zhǎng)發(fā)育期的金柑果皮被分為3類(lèi)：第1類(lèi)是花后55 d、花后65 d、花后85 d和花后105 d，其中55 d的代謝物含量與其他3個(gè)時(shí)間點(diǎn)差異較大;第二類(lèi)是花后115 d、125 d和135 d的果肉。聚類(lèi)分析結(jié)果（圖5）表明，花后105 d到115 d是金柑果實(shí)總酚、總黃酮和總酚酸代謝變化的重要時(shí)期。果肉中黃酮和酚類(lèi)物質(zhì)在花后65～105 d變化不大，花后115～135 d變化對(duì)比花后105 d前的代謝物含量變化更大。R型聚類(lèi)是對(duì)黃酮和酚酸含量指標(biāo)進(jìn)行聚類(lèi)。從圖4可知，金柑果皮和果肉中的聚類(lèi)分析大體一致，果皮中各成分含量之間的差異較果肉的歐氏距離大。金柑果肉和果皮總黃酮和總酚的變化趨勢(shì)一致，總酚酸果皮和果肉的總酚酸含量變化不大。

3?結(jié)論與討論

黃酮和酚酸是植物自身的次生代謝物，盡管黃酮和酚酸的積累的主要因素是遺傳，然而外界環(huán)境如不同季節(jié)、植物的營(yíng)養(yǎng)、光照、微生物侵入等對(duì)黃酮的積累也產(chǎn)生一定影響[11]。有關(guān)黃酮在果實(shí)成熟過(guò)程中的積累規(guī)律已經(jīng)在一些物種上做了研究。植株的樹(shù)齡和成熟度是黃酮類(lèi)物質(zhì)變化的主要決定性因素，但是隨著遺傳和外界環(huán)境條件的影響，實(shí)際的含量是由黃酮生物合成和分解代謝反應(yīng)的平衡來(lái)決定的。王麗娟等對(duì)不同生長(zhǎng)發(fā)育期草莓果實(shí)研究表明，在綠熟期類(lèi)黃酮含量較高，隨著果實(shí)的成熟，含量逐漸下降，至紫紅期又有所升高[12]。查爾酮合成酶（CHS）是將苯丙烷代謝途徑引向黃酮類(lèi)化合物的合成.該酶催化4香豆酸CoA 和丙二酰CoA 反應(yīng)，合成查爾酮柚（苷）配基4，5，7三羥黃烷酮[13]。CHS 是苯丙烷系代謝途徑中含量最豐富的酶之一，但該酶的催化效率較低，植物體內(nèi)CHS的轉(zhuǎn)錄受到高濃度肉桂酸的抑制及高濃度的香豆酸促進(jìn)[14]。

對(duì)柑橘幼果活性成分的研究表明在幼果期黃酮和酚酸含量很高。黃仁華等以紐荷爾臍橙果實(shí)為材料，果皮中黃酮的含量在后期下降與果皮中黃酮含量的變化主要與其合成代謝有關(guān)，在果實(shí)成熟期，其代謝速率可能高于合成速率[15]。劉英對(duì)四季柚的黃酮和酚酸進(jìn)行研究表明：四季柚果皮中總酚酸含量數(shù)是隨成熟度上升而先下降后上升，主要是肉桂酸型酚酸含量上升[16]。徐貴華等研究不同成熟期椪柑、溫州蜜橘、胡柚果實(shí)中的主要酚類(lèi)物質(zhì)組成，結(jié)果表明柑橘果實(shí)中的酚類(lèi)物質(zhì)含量隨成熟度的提高而減少，其提取液的抗氧化能力也隨之減小。未成熟期的柑橘果實(shí)落果尤其適合于提取各種黃酮：椪柑果實(shí)可以用于提取橙皮苷、川陳皮素和橘皮素;溫州蜜橘果實(shí)可以用于提取橙皮苷;胡柚果實(shí)可以用于提取柚皮苷和新橙皮苷[17]。

本研究對(duì)不同生長(zhǎng)發(fā)育期金柑果皮黃酮和酚酸含量進(jìn)行測(cè)定分析，在金柑樣品中均檢測(cè)出6種黃酮和5種酚酸類(lèi)物質(zhì)。在幼果期（花后45 d），總黃酮和總酚酸含量都很高，其中花后45～85 d，酚酸下降時(shí)間比黃酮提早10 d左右。這可能是由于酚酸是黃酮類(lèi)物質(zhì)合成的底物。另外金柑果實(shí)在花后55～85 d水分含量不斷增加也是原因之一?；ê?5 d后，總黃酮和總酚酸含量變化趨于平穩(wěn)?；ê?05～125 d，果皮中香豆酸含量急劇上升，其他肉桂酸含量下降，促進(jìn)果皮中查爾酮合成酶的轉(zhuǎn)錄，將苯丙烷代謝途徑引向黃酮類(lèi)化合物的合成途徑，是花后125 d金柑果皮黃酮類(lèi)物質(zhì)含量有所上升的原因之一。

參考文獻(xiàn)：

[1]施維屬，王江波，李開(kāi)拓，等.24份甜橙種質(zhì)資源的ISSR分析[J].熱帶作物學(xué)報(bào)，2010，31（6）：902-907.

[2]鐘德勝，時(shí)粒笠，李湘瀲，等.金橘黃酮類(lèi)成分止咳化痰作用的研究[C]∥中國(guó)藥理學(xué)會(huì)抗炎免疫藥理專業(yè)委員會(huì)成立30周年紀(jì)念大會(huì)暨學(xué)術(shù)年會(huì)，2012.

[3]黎繼烈，崔培梧，吳耀輝，等.金橘黃酮對(duì)小鼠抗氧化作用的研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2009（5）：1031-1032.

[4]黎繼烈，李忠海，鐘海雁，等.金柑黃酮對(duì)小鼠血糖的影響[J].中藥藥理與臨床，2007，23（3）：42-44.

[5]黎繼烈，劉宗敏，鐘海雁，等.金柑總黃酮對(duì)小鼠胃腸吸收功能的影響[J].中南林業(yè)科技大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)版，2007，27（2）：79-82.

[6]周麗萍，馬科，馬治國(guó)，等.金橘開(kāi)胃顆粒劑治療小兒厭食脾失健運(yùn)證臨床研究[J].中國(guó)醫(yī)藥信息雜志，2003，10（7）：16-17，78.

[7]GERMAN M A，MINEO V，CHIANCONE B.Study on Flavonoid Contents in Fruits of Different of Citrus Genotypes[J].Acta Horticulturae，2004，632：355-361.

[8]張靜，朱麗莎，張耀海，等.不同晚熟柑橘中酚類(lèi)物質(zhì)的含量檢測(cè)及分析[J].食品與機(jī)械，2018，34（12）：27-33.

[9]黃勝佳，葉霜，熊博，等.柑橘果肉、果皮中酚類(lèi)物質(zhì)含量差異性研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2018，44（4）：241-247.

[10]陳源，姜翠翠，謝鴻根，等.超聲波和微波對(duì)柑橘雜交種果皮中酚類(lèi)物質(zhì)浸提及其抗氧化能力的影響[J].熱帶作物學(xué)報(bào)，2018，39（4）：797-801.

[11]王岳，錢(qián)井，曹錦萍，等.柑橘35個(gè)品種果實(shí)黃酮類(lèi)物質(zhì)組分和含量分析[C]//中國(guó)園藝學(xué)會(huì)2018年學(xué)術(shù)年會(huì)論文摘要集，2018.

[12]王麗娟，張學(xué)英，徐金娥，等.不同光質(zhì)對(duì)草莓果實(shí)花青苷、酚類(lèi)物質(zhì)及類(lèi)黃酮物質(zhì)的影響[J].河北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，2009，32（2）：54-57.

[13]DIXON?R A，PAIVA N L..Stress-Induced Phenylpropanoid Metabolism[J].The Plant Cell，1995，7（7）：1085-1097.

[14]LOAKE G J，CHOUDHARY A D，HARRISON M J，et al.Phenylpropanoid pathway intermediates regulate transient expression of a chalcone synthase gene promoter[J].Plant Cell，1991，3（8）：829-840.

[15]黃仁華， 陸云梅，夏仁學(xué).紐荷爾臍橙果實(shí)發(fā)育過(guò)程中類(lèi)黃酮變化與體外抗氧化活性的關(guān)系[J].食品科學(xué)，2009（1）：37-39.

[16]劉英.四季柚果實(shí)主要功能成分分析及抗氧化作用的研究[D].杭州：浙江大學(xué)，2007.

[17]徐貴華，胡玉霞，葉興乾，等.椪柑、溫州蜜桔果皮中酚類(lèi)物質(zhì)組成及抗氧化能力研究[J].食品科學(xué)，2007（11）：171-175.

（責(zé)任編輯：林玲娜）