唐敏敏 朱磊 欒楓婷 邵雪梅 趙航 魏瑞成 王冉
摘要:為掌握恩諾沙星在雪山雞不同組織中的殘留消除規(guī)律,合理確定該品種肉雞的休藥期,以雪山雞為研究對象,以臨床推薦劑量混飲恩諾沙星水溶液,連續(xù)飲用5 d。分別于停藥后0.16、1、3、5、7、9、12 d 7個時間點取雞的肌肉、腎臟、肝臟和皮脂組織進(jìn)行檢測。通過超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法(UPLC-MS/MS)對凈化處理過的組織進(jìn)行恩諾沙星及其代謝物環(huán)丙沙星測定,使用內(nèi)標(biāo)法定量。結(jié)果顯示,停藥后0.16 d恩諾沙星標(biāo)志殘留物以肝臟組織最高,肌肉組織最低。實測數(shù)據(jù)采用WT1.4計算軟件擬合,腎臟組織的休藥期為2.93 d,肌肉組織的休藥期為 6.25 d,肝臟組織的休藥期為7.77 d,皮脂的休藥期為14.46 d。雪山雞按照推薦劑量飲水給藥,建議休藥期為15 d。
關(guān)鍵詞:恩諾沙星;液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜;消除規(guī)律;休藥期
中圖分類號:S859.84?文獻(xiàn)標(biāo)志碼:A?文章編號:1002-1302(2020)21-0215-05
恩諾沙星為第三代喹諾酮類抗生素,具有抗菌譜廣、抗菌性強(qiáng)、生物利用度高、體內(nèi)不易被代謝等優(yōu)點,與其他抗生素聯(lián)用無交叉感染[1],在禽類養(yǎng)殖中是喹諾酮類最優(yōu)良的藥物之一。但喹諾酮類藥物的毒副作用也不容忽視,如會造成肝損傷、引發(fā)神經(jīng)系統(tǒng)的不良影響等[2]。人類長期食用含低劑量喹諾酮類藥物的動物性食品,容易誘導(dǎo)耐藥性傳遞,從而影響該類藥物的臨床療效。黃羽肉雞是指除了國外培育的白羽肉雞外的所有有色羽肉雞[3],是中國特色的肉雞產(chǎn)業(yè)。其中,雪山雞是利用我國優(yōu)質(zhì)地方良種藏雞和茶花雞雜交選育而成的品種[4],肉質(zhì)纖細(xì)順滑,味道鮮嫩可口,深受消費者的喜愛。目前,我國使用的肉雞抗菌藥物殘留限量是引用國際食品法典委員會(CAC)和部分發(fā)達(dá)國家的限量標(biāo)準(zhǔn),存在不完全適用于我國地方雞種生產(chǎn)的現(xiàn)象,給我國黃羽肉雞產(chǎn)品質(zhì)量安全帶來潛在風(fēng)險。
目前,報道大多集中在恩諾沙星在畜禽動物中的藥物動力學(xué)研究[5-6],也有學(xué)者研究了抗菌藥物在畜禽動物體內(nèi)的殘留消除規(guī)律[7-8],其中,禽類主要針對白羽雞,較少有對地方雞種的研究,基于此,本研究評估典型抗菌藥物(恩諾沙星、環(huán)丙沙星)在雪山雞不同組織中殘留消除規(guī)律,了解殘留消除時間,為制定黃羽肉雞中抗菌藥物的休藥期提供數(shù)據(jù)支撐,以期指導(dǎo)生產(chǎn)。
1 材料與方法
1.1 藥品與試劑
恩諾沙星可溶性粉,購自南京杰科生物技術(shù)有限公司;恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品(批號132847,純度99.00%),購自德國Dr.Ehrenstorfer公司;環(huán)丙沙星鹽酸鹽(批號132903,純度92.19%),購自德國Dr.Ehrenstorfer公司;恩諾沙星-D5內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品(批號272238,純度99.00%),購自Witega公司;環(huán)丙沙星-D8 內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)品(批號281436,純度99.80%),購自Witega公司;甲醇(色譜純)、乙腈(色譜純),購自美國霍尼韋爾公司。
1.2 儀器設(shè)備
SXIEX Triple Quad 4500 液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀(美國Sciex公司),分析天平(德國賽多利斯CPA225D),高速勻漿機(jī)(LAB PRECITION HM 6300),離心機(jī)(Eppendorf 5810R),氮吹儀,渦旋混合器。
1.3 試驗方法
1.3.1 試驗動物 試驗組選擇30日齡雪山雞品種64羽,大小一致,公母各半,期間不給任何抗菌藥物,于常州市立華牧業(yè)試驗場飼養(yǎng)至60~70日齡,隨后開始?xì)埩舸x試驗。給藥組56羽,公母各半,對照組8羽,公雞4羽,母雞4羽。試驗前后各組飼養(yǎng)條件相同。
1.3.2 給藥與樣本采集 按照恩諾沙星可溶性粉推薦的給藥途徑和給藥方式,具體按照恩諾沙星計算,混飲,每1 L水100 mg藥量,自由飲水,連用 5 d。2019年8月25日分別從停藥開始的0.16、1、3、5、7、9、12 d屠宰取樣8羽(給藥組、公母各半)和1羽(空白對照組),分別采集雞胸肌肉、全肝、雙腎和皮脂樣品,做好標(biāo)記,于-20 ℃保存。
1.3.3 測定方法 本研究采用國家推薦標(biāo)準(zhǔn) GB/T 20366—2006(動物源產(chǎn)品中喹諾酮類殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法)[9]進(jìn)行測定。
1.3.4 樣品前處理 稱取5 g試樣(精確至0.001 g),置50 mL離心管中,加入50 μL 1.0 μg/mL 混合內(nèi)標(biāo)工作溶液,加入20.0 mL 甲酸-乙腈[甲酸 ∶ 乙腈(體積比)=2 ∶ 98],渦旋混合 1 min,4 000 r/min離心5 min,提取液轉(zhuǎn)移至另一50 mL離心管中,殘渣采用10.0 mL 酸化乙腈重復(fù)提取1次,合并提取液,備用。
在提取液中加入10 mL乙腈飽和的正己烷,振搖10 min。4 000 r/min離心5 min棄去正己烷層。乙腈層在50 C下氮吹儀吹至近干。用甲酸-乙腈溶液1.0 mL溶解,經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后作為試樣溶液,供LC-MS/MS測定。
1.3.5 液相色譜參考條件 色譜柱:Waters Acquity UPLC@BEH C18色譜柱,粒徑1.7 μm,2.1 mm×100 mm。流動相(A):0.1%甲酸,流動相(B):0.1%甲酸-乙腈。梯度洗脫條件:0.0~1.0 min,3%B,1.1~6.0 min,B由20%升至45%,6.1~8.0 min,B保持95%,8.1 min B降為3%。
1.3.6 質(zhì)譜參考條件 離子源:電噴霧(ESI)離子源;掃描方式:正離子;檢測方式:多反應(yīng)離子監(jiān)測(MRM);離子化電壓(IS):5 500 V,溫度(TEM):500 ℃,噴霧器溫度(GS1):60 psi,輔助加熱器(GS2):60 psi;氣簾氣(CUR):35 psi。定性、定量離子對、去簇電壓和碰撞能量見表1。
1.3.7 方法回收率和精密度 對照組樣品(未檢出恩諾沙星標(biāo)志物殘留)的肌肉、肝、腎、皮脂樣品作為空白對照,分別做加標(biāo)回收和精密度試驗,每個濃度設(shè)置3個平行樣品。
2 結(jié)果與分析
2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和方法回收率
恩諾沙星、環(huán)丙沙星在1~50 ng/mL(內(nèi)標(biāo)濃度20 ng/mL)范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好線性關(guān)系,恩諾沙星線性方程為:y=0.176 87x-9.68×10-3,相關(guān)系數(shù)r為0.9 994,環(huán)丙沙星線性方程為y=0.04 9 24x-3.456×10-4,相關(guān)系數(shù)r為0.999 9。由恩諾沙星和環(huán)丙沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液色譜圖(圖1)可知,恩諾沙星在胸肉中回收率為81.4%~115%;在腎臟中回收率為99.4%~122.1%;在肝臟中回收率為89.4%~94.9%;在皮脂中回收率為78.4%~95.4%。環(huán)丙沙星在胸肉中回收率為83.0%~105.0%,腎臟中回收率為94.3%~101.0%,肝臟中回收率為83.6%~109.1%,皮脂中回收率為82.1%~96.9%。相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于15%。
2.2 雞肉各組織中藥物殘留及消除規(guī)律
恩諾沙星在動物組織中的殘留標(biāo)志物為恩諾沙星及其代謝物環(huán)丙沙星的總量,在動物體內(nèi)消除緩慢,半衰期長。采用內(nèi)標(biāo)法定量,對所采集的各組雞不同組織中(肌肉、腎臟、肝臟和皮脂)恩諾沙星(以恩諾沙星和環(huán)丙沙星之和計)進(jìn)行檢測。不同時間點各殘留量及藥物殘留量均值見表2。由消除曲線(圖2)可知,在停藥后0.16 d,肝臟、腎臟、肌肉中的恩諾沙星及環(huán)丙沙星總殘留量達(dá)最大值,按照“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”計算,肝臟、腎臟、肌肉中恩諾沙星殘留標(biāo)示物總量分別為(1 725±237.7)、(621.4±123.4)、(213.1±69.6) μg/kg,其殘留量隨著時間均呈下降趨勢,且前期以較快速率下降,腎臟和肌肉的殘留量在停藥1 d后已低于農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公布的最大殘留限量MRL,肝臟殘留量在停藥 3 d 時低于農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公布的最大殘留限量MRL。皮脂的代謝情況與上述3種組織略有區(qū)別?皮脂中恩諾沙星及環(huán)丙沙星之和在停藥1 d時達(dá)到最大值,殘留量為(956.1±108.0) μg/kg,隨后呈現(xiàn)緩慢下降的趨勢,這與張崇威等報道的結(jié)果[10]一致,直至停藥12 d才低于農(nóng)業(yè)農(nóng)村部公布的最大殘留限量MRL。各組織中殘留消除曲線表明,恩諾沙星及其代謝物在雪山雞的各組織中均有滯留,且主要代謝方式為肝臟和腎臟,1 d內(nèi)雪山雞各組織中恩諾沙星代謝速率由快到慢依次為肝臟、腎臟、肌肉、皮脂。
2.3 休藥期計算
根據(jù)《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)(GB 31650—2019) 食品中獸藥最大殘留限量》規(guī)定,恩諾沙星作為廣譜殺菌藥物,殘留標(biāo)志物為恩諾沙星和環(huán)丙沙星之和;其中,規(guī)定家禽肌肉、皮脂中最大殘留不超過100 μg/kg、家禽肝組織中最大殘留不超過 200 μg/kg,腎組織中不超過300 μg/kg,采用CVMP制定的統(tǒng)計方法(雙單側(cè)95%置信區(qū)間),對恩諾沙星可溶性粉在雞組織中休藥期進(jìn)行計算[11]。恩諾沙星在各組織中的殘留消除擬合情況見圖3。根據(jù)WT1.4軟件計算出恩諾沙星腎臟組織的休藥期為2.93 d,肌肉組織的休藥期為6.25 d,肝臟組織的休藥期為7.77 d,皮脂的休藥期為14.46 d。
3 討論
3.1 檢測方法
目前,恩諾沙星和環(huán)丙沙星的檢測方法主要有高效液相色譜法[12-13]、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法[14-15],另一些新型快檢技術(shù)也迅速發(fā)展,如膠體金免疫層析法[16]、微流控芯片-質(zhì)譜法[17]等。由于質(zhì)譜檢測器具有高靈敏度優(yōu)點,可對物質(zhì)的組成和結(jié)構(gòu)進(jìn)行定性檢測,將其與液相色譜聯(lián)用,不僅可對目標(biāo)物進(jìn)行良好分離,并且可以彌補(bǔ)液相色譜不能對物質(zhì)定性的缺點。因此,本研究采用國家標(biāo)準(zhǔn)推薦的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的檢測方法,同時考慮到樣品基質(zhì)對質(zhì)譜的離子抑制影響,采用內(nèi)標(biāo)法校正,從而提高準(zhǔn)確性,保證試驗數(shù)據(jù)的可靠性[18]。
3.2 休藥期
蔣志偉等通過推薦劑量飲水給藥,研究恩諾沙星可溶性粉在黃羽肉雞體內(nèi)的殘留消除規(guī)律發(fā)現(xiàn),乳酸恩諾沙星可溶性粉在肌肉、肝臟和腎臟的休藥期分別約為7.689、7.339、4.529 d[19]。吳波等研究了恩諾沙星在黃羽肉雞肌肉、肝、腎中殘留消除規(guī)律[20],但均缺少對皮脂消除規(guī)律的研究,因此對休藥期的建議不夠完善。本研究結(jié)合雪山雞不同組織中殘留消除數(shù)據(jù),通過休藥期軟件得到恩諾沙星在腎臟組織的休藥期為2.93 d,肌肉組織的休藥期為6.25 d,肝臟組織的休藥期為7.77 d,皮脂的休藥期為14.46 d,因此推薦休藥期為15 d。中華人民共和國農(nóng)業(yè)部公告第278號規(guī)定,恩諾沙星在肉雞中的休藥期為8 d。本研究試驗雞品種為雪山雞,一般90 d左右出欄,其生長周期相對較長,屬于慢速生長品種,與其他肉雞品種相比,藥物代謝速度較慢,而皮脂在規(guī)定8 d內(nèi)未達(dá)到安全標(biāo)準(zhǔn),因此,針對該品種,在獸醫(yī)臨床上使用恩諾沙星存在安全風(fēng)險,休藥期需要在15 d以上,以確保肉雞可食組織的恩諾沙星標(biāo)志殘留物低于國家最高限量標(biāo)準(zhǔn)。
參考文獻(xiàn):
[1]葉建美,吳 康,吳洪麗,等. 恩諾沙星抗菌效果及藥代動力學(xué)研究進(jìn)展[J]. 湖北農(nóng)業(yè)科學(xué),2015,54(23):5813-5816.
[2]王浴生,周黎明. 喹諾酮類抗菌藥毒理學(xué)與臨床不良反應(yīng)的幾個問題[J]. 四川生理科學(xué)雜志,2004,26(3):123-124.
[3]茍鐘勇,崔小燕,李 龍,等. 黃羽肉雞非常規(guī)飼料資源利用研究進(jìn)展[J]. 中國畜牧獸醫(yī),2019,46(6):1685-1694.
[4]馮永志. 雪山雞飼養(yǎng)技術(shù)[J]. 農(nóng)技服務(wù),2011,28(7):1016,1104.
[5]房文紅,于慧娟,蔡友瓊,等. 恩諾沙星及其代謝物環(huán)丙沙星在歐洲鰻鱺體內(nèi)的代謝動力學(xué)[J]. 中國水產(chǎn)科學(xué),2007,14(4):622-629.
[6]鄭育基,全家興,霍皓遠(yuǎn),等. 恩諾沙星及其代謝物在1日齡雞體內(nèi)的藥動學(xué)研究[J]. 動物醫(yī)學(xué)進(jìn)展,2019,40(11):59-62.
[7]宋志超,張崇威,陳 薔,等. 氟苯尼考注射液在雞體內(nèi)殘留消除研究[J]. 中國獸藥雜志,2018,52(12):35-43.
[8]王英俊,孫曉榮,馬豐英,等. 恩諾沙星固體分散劑在肉雞組織中殘留的研究[J]. 黑龍江畜牧獸醫(yī),2015(9):182-184,187.
[9]GB/T 20366—2006:動物源產(chǎn)品中喹諾酮類殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 [S].
[10]張崇威,李華岑,李 娜,等. 恩諾沙星注射液在豬體內(nèi)殘留消除規(guī)律研究[J]. 食品安全質(zhì)量檢測學(xué)報,2019,10(17):5674-5680.
[11]栗 柱,宗海兵. 休藥期計算軟件WT1.4的使用[J]. 飼料廣角,2003(18):40-41.
[12]胡永萍,徐克功,余舒寧,等. 高效液相色譜熒光法測定雞肉及雞蛋中4種喹諾酮類藥物殘留量的研究[J]. 畜牧與獸醫(yī),2017,49(11):47-51.
[13]張玉潔,李 倩,汪 霞,等. 高效液相色譜法檢測多種動物組織中氟喹諾酮類藥物殘留量的研究[J]. 中國獸藥雜志,2012,46(7):18-22.
[14]何艷花. 液相色譜-質(zhì)譜/質(zhì)譜法測定雞肉中恩諾沙星和沙拉沙星殘留的國標(biāo)方法優(yōu)化[J]. 食品安全導(dǎo)刊,2017(18):151-153.
[15]張 楠,范 賽,薛 穎,等. QuEChERS-超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法快速檢測雞肉中8種常見獸藥殘留[J]. 衛(wèi)生研究,2017,46(1):89-93.
[16]于 璐,劉衛(wèi)華,劉敏軒,等. 膠體金免疫層析法快速檢測牛奶中環(huán)丙沙星殘留[J]. 食品研究與開發(fā),2019,40(22):159-163.
[17]Zhao Y,Tang M M,Liu F,et al. Highly integrated microfluidic chip coupled to mass spectrometry for online analysis of residual quinolones in milk[J]. Analytical Chemistry,2019,91(21):13418-13426.
[18]Chen Q,Wu J,Zhang Y,et al. Qualitative and quantitative analysis of tumor cell metabolism via stable isotope labeling assisted microfluidic chip electrospray ionization mass spectrometry[J]. Analytical Chemistry,2012,84(3):1695-1701.
[19]蔣志偉. 乳酸恩諾沙星可溶性粉在雞的藥動學(xué)及不同恩諾沙星鹽制劑在雞的殘留消除規(guī)律研究[D]. 揚(yáng)州:揚(yáng)州大學(xué),2010:60-62.
[20]吳 波,段龍川,羅厚強(qiáng),等. 恩諾沙星在黃羽肉雞組織中殘留消除規(guī)律研究[J]. 上海畜牧獸醫(yī)通訊,2014(6):5-6,9.薛曉敏,韓雪平,王金政,等. 不同采收期李果實糖酸組分分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué),2020,48(21):220-224.