黃薇 劉蘭英 羅土炎 劉洋 宋永康

摘要：腸道微生物是抗生素抗性基因（ARGs）的儲存庫，為明確ARGs在魚腸道微生物中的組成特征，本研究以養(yǎng)殖鰻鱺為研究對象，利用高通量測序技術(shù)及功能宏基因組學(xué)分析方法對鰻鱺腸道微生物ARGs的種類和豐度進(jìn)行了探究。研究結(jié)果顯示，養(yǎng)殖鰻鱺腸道微生物主要由厚壁菌門（Firmicutes）、梭桿菌門（Fusobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）組成，比對抗性基因數(shù)據(jù)庫共注釋得到254種ARGs基因，分別歸屬于24類抗性類型，其中高豐度的抗性類型為多肽類抗生素、多重耐藥、氟喹諾酮類、四環(huán)素類和β-內(nèi)酰胺類。以上結(jié)果表明，在鰻鱺養(yǎng)殖過程中，出現(xiàn)耐多肽類抗生素、氟喹諾酮類、四環(huán)素類、β-內(nèi)酰胺類以及多重耐藥病原菌的機(jī)會相對較高。本研究為抗生素在鰻鱺養(yǎng)殖過程中合理使用提供參考依據(jù)，同時(shí)也顯示宏基因組測序技術(shù)在檢測魚腸道ARGs的可行性和優(yōu)越性。

關(guān)鍵詞：鰻鱺;腸道微生物;抗生素抗性基因;宏基因組學(xué)

中圖分類號：S182?文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A?文章編號：1002-1302（2020）21-0057-05

中國是水產(chǎn)養(yǎng)殖大國，水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)量占世界養(yǎng)殖總產(chǎn)量的70%左右，位居世界第一[1]。近年來，隨著集約化水產(chǎn)養(yǎng)殖的迅速發(fā)展，水產(chǎn)養(yǎng)殖中的病害問題特別是細(xì)菌性病害在密集型的養(yǎng)殖體系中發(fā)病率極高，導(dǎo)致抗生素被大量過度使用。雖然抗生素具有殺菌、促進(jìn)生長等作用，但長期重復(fù)使用或過度使用不僅會降低抗生素的藥效，還有可能誘導(dǎo)產(chǎn)生一系列攜帶抗生素抗性基因（antibiotics resistance genes，ARGs）的耐藥性菌株[2]。ARGs作為一項(xiàng)新型環(huán)境污染物在2006年被明確提出[3]，成為一個(gè)全球性的環(huán)境熱點(diǎn)問題，由此而產(chǎn)生的潛在生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)也日益引起各國政府和研究者的廣泛關(guān)注。

水產(chǎn)養(yǎng)殖魚類腸道和糞便內(nèi)有耐藥菌和ARGs檢出的報(bào)道已屢見不鮮[4]。動(dòng)物腸道本身就是細(xì)菌生長繁殖的重要場所，腸道內(nèi)共生著大量的已知和未知的微生物，環(huán)境中抗生素的選擇壓力容易誘導(dǎo)其內(nèi)在或外源ARGs通過質(zhì)粒接合轉(zhuǎn)移等方式傳遞給腸道內(nèi)的大量敏感菌群變成新的耐藥菌，因此魚類腸道是ARGs定植和轉(zhuǎn)移的一個(gè)非常理想的微環(huán)境[5]。研究人員認(rèn)為，魚腸道為ARGs的轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散提供了安全而穩(wěn)定的場所可能是ARGs能夠在水環(huán)境中長期穩(wěn)定存在的重要原因[6]。因此，明確養(yǎng)殖魚體腸道菌群中ARGs的污染特征，對水產(chǎn)養(yǎng)殖環(huán)境ARGs的污染評價(jià)及生態(tài)安全管理具有重要的作用。

傳統(tǒng)研究環(huán)境ARGs的方法主要是通過耐藥菌的培養(yǎng)，以及ARGs的PCR和定量PCR篩選等，通過這些方法研究人員已經(jīng)從不同環(huán)境介質(zhì)中分離和鑒定了大量的ARGs，闡釋了不同ARGs的作用機(jī)制[7]。但傳統(tǒng)的研究分析方法具有一定的限制性，如大多的微生物不可培養(yǎng)、PCR結(jié)果的真實(shí)程度取決于設(shè)計(jì)引物的序列等，因此很難得到環(huán)境中微生物抗生素抗性基因組的全面和詳細(xì)的信息。近年來，基于功能的宏基因組篩選和基于高通量測序?yàn)榛A(chǔ)的宏基因組測序分析技術(shù)與方法的發(fā)展為研究環(huán)境抗生素抗性基因組的生態(tài)、起源、進(jìn)化和傳播機(jī)制提供了強(qiáng)有力的工具[8-9]。Looft等[10]和Xiong等[11]對豬和肉雞腸道微生物組的高通量宏基因組測序分析，使我們對豬和雞的腸道微生物組所蘊(yùn)藏ARGs的廣度和深度都有了更進(jìn)一步的理解，同時(shí)為微環(huán)境下ARGs的傳播和流動(dòng)提供了有力的證據(jù)。然而與陸生脊椎動(dòng)物相比，水生動(dòng)物所處生態(tài)環(huán)境更為復(fù)雜，其腸道微生物具有更豐富的多樣性和復(fù)雜性，受環(huán)境條件和隨機(jī)因子的影響，使得魚類腸道微生物比陸地動(dòng)物更具動(dòng)態(tài)性，直至目前魚類腸道微生物ARGs組的相關(guān)性研究也鮮見報(bào)道。

鰻鱺（Anguilla sp.）是中國出口創(chuàng)匯最多的水產(chǎn)養(yǎng)殖品種之一，年產(chǎn)值超百億元，是目前單項(xiàng)農(nóng)產(chǎn)品中創(chuàng)匯最多的品種之一。鰻鱺在人工養(yǎng)殖過程中疾病時(shí)有發(fā)生，其中細(xì)菌性疾病的危害最為嚴(yán)重，常造成重大的經(jīng)濟(jì)損失。明確ARGs在鰻鱺腸道微生物中的組成特征，可以為指導(dǎo)鰻鱺養(yǎng)殖抗菌藥物的合理使用提供必要的理論依據(jù)，對水產(chǎn)動(dòng)物源病害防控具有重要的應(yīng)用價(jià)值。本項(xiàng)目擬以養(yǎng)殖鰻鱺為研究對象，運(yùn)用高通量測序技術(shù)及功能宏基因組學(xué)分析方法，確定鰻鱺腸道微生物中ARGs的種類和豐度，為鰻鱺的健康養(yǎng)殖、病害防控以及水生態(tài)環(huán)境調(diào)控參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

2019年3月12日，選取福清鰻鱺養(yǎng)殖區(qū)的3個(gè)典型養(yǎng)鰻場作為采樣點(diǎn)，每個(gè)養(yǎng)鰻場隨機(jī)網(wǎng)捕3條鰻鱺，體質(zhì)量200～300 g，送回實(shí)驗(yàn)室。將采集的鰻鱺頭尾固定，表面采用75%乙醇消毒90 s，使用無菌去離子水沖洗3次，將每條鰻鱺用無菌刀解剖，取其腸道，立即放入含15 mL PBS緩沖液、1 mL茶樹油和20 g石榴石（0.7 mm）的無菌50 mL離心管中，用一次性無菌研杵壓碎腸道，在渦流振蕩器中以1 500 r/min的速度振蕩5 min使其均勻化。將勻漿混合物依次通過100、20、11和8 μm的濾膜過濾，去除宿主細(xì)胞，再經(jīng)過0.22 μm濾膜富集微生物，收集的腸道微生物濾膜儲存在-80 ℃下，以提取其總基因組DNA。

1.2 主要試劑

75%乙醇、PBS緩沖液、無菌研杵，購自生工生物工程（上海）股份有限公司;茶樹油、石榴石，購自德國Qiagen公司;100、20、11、8和0.22 μm的濾膜，購自美國Millipore公司;PowerWater DNA Isolation Kit試劑盒，購自美國MOBIO公司。

1.3 DNA提取與純化

取收集好的鰻鱺腸道微生物濾膜，采用PowerWater DNA Isolation Kit 試劑盒提取總基因組DNA，具體提取方法參考試劑盒說明書。提取的基因組DNA樣品用Qubit 2.0核酸蛋白定量儀進(jìn)行定量，然后放置在-80 ℃下保存直至使用。

1.4 Illumina測序及高通量數(shù)據(jù)處理

為達(dá)到測序要求的DNA閾含量，將9個(gè)DNA樣品混合，由上海美吉生物公司采用Illumina Hiseq 2500測序平臺進(jìn)行宏基因組測序。高通量測序原始數(shù)據(jù)先采用fastp軟件進(jìn)行質(zhì)控去除接頭序列、低質(zhì)量堿基、N堿基及長度過短序列，利用Megahit與Newbler軟件對質(zhì)控?cái)?shù)據(jù)進(jìn)行多重混合拼接組裝，使用MetaGene軟件對拼接結(jié)果中的Contigs進(jìn)行ORF預(yù)測，采用CD-HIT軟件進(jìn)行聚類（默認(rèn)參數(shù)為：95% identity、90% coverage），每個(gè)類取最長的基因作為代表序列，構(gòu)建非冗余基因集，使用BLASTP軟件將非冗余基因集與NR數(shù)據(jù)庫進(jìn)行比對（比對參數(shù)設(shè)置期望值e-value為1e-5），并通過NR庫對應(yīng)的分類學(xué)信息數(shù)據(jù)庫獲得物種注釋結(jié)果，然后使用物種對應(yīng)的基因豐度總和計(jì)算該物種的豐度，從而構(gòu)建相應(yīng)分類學(xué)水平上的豐度表，將數(shù)據(jù)上傳ARDB數(shù)據(jù)庫（http：//ardb.cbcb.umd.edu/）進(jìn)行比對（比對參數(shù)設(shè)置期望值e-value為1e-5），獲得基因?qū)?yīng)的抗生素抗性功能注釋信息;將數(shù)據(jù)上傳CARD數(shù)據(jù)庫（http：//arpcard.mcmaster.ca/）進(jìn)行比對（比對參數(shù)設(shè)置期望值e-value為1e-5），獲得基因?qū)?yīng)的抗生素抗性功能注釋信息，綜合CARD和ARDB的注釋結(jié)果，繪制鰻鱺腸道微生物基因組抗性基因圖譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 高通量測序序列數(shù)據(jù)分析

鰻鱺腸道微生物基因組DNA樣品經(jīng)宏基因組測序共得到原始序列（Raw reads）50 839 026條，質(zhì)控后的有效序列（cean reads）50 355 024條，占原始序列的99.45%。混合拼接后得到Contigs 65 048條序列，N50為404 bp;經(jīng)過基因預(yù)測得到ORFs的序列條數(shù)為406 331，通過聚類構(gòu)建了200 260個(gè)基因的非冗余基因集。

2.2 鰻鱺腸道菌群結(jié)構(gòu)和多樣性分析

利用BLASTP將非冗余基因集與NR數(shù)據(jù)庫比對進(jìn)行物種分類注釋，共得到71個(gè)門水平、147個(gè)綱水平、373個(gè)目水平、686個(gè)科水平和1 473個(gè)屬水平和4 094個(gè)種水平的物種，其中注釋為真細(xì)菌、病毒、古細(xì)菌、真核生物以及未分類物種的序列數(shù)分別占總注釋序列數(shù)的96.13%、0.17%、0.04%、3.64%和0.02%。從注釋結(jié)果中可知真核生物的序列數(shù)比例僅為3.64%，說明本研究提取的鰻鱺腸道微生物基因組DNA樣品基本清除了宿主DNA。

從門水平上看，鰻鱺腸道微生物的優(yōu)勢菌群主要由厚壁菌門（Firmicutes）、梭桿菌門（Fusobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）組成，其豐度分別占物種注釋序列總數(shù)的50.61%、29.31%、14.48%和1.23%，除此之外的其他門類的細(xì)菌在鰻鱺腸道樣品中的豐度均較低（圖1）。從屬水平上看，鰻鱺腸道微生物中相對豐度在1%以上的細(xì)菌屬主要有乳球菌屬Lactococcus（46.49%）、鯨桿菌屬Cetobacterium（28.27%）、鄰單胞菌屬Plesiomonas（11.59%）、氣單胞菌屬Aeromonas（1.11%）（圖2）。上述結(jié)果使我們對鰻鱺腸道菌群多樣性以及優(yōu)勢菌群結(jié)構(gòu)組成有了更全面的認(rèn)識。

2.3 鰻鱺腸道微生物基因組抗性基因分析結(jié)果

將鰻鱺腸道微生物基因組數(shù)據(jù)上傳CARD數(shù)據(jù)庫進(jìn)行ARGs的預(yù)測和注釋。結(jié)果顯示，鰻鱺腸道微生物基因組在CARD抗性基因數(shù)據(jù)庫中共預(yù)測得到669 852條ARGs序列，分別屬于235個(gè)不同的ARGs。不同抗性數(shù)據(jù)庫的側(cè)重點(diǎn)不同，所收錄的ARGs序列數(shù)目、標(biāo)準(zhǔn)以及注釋結(jié)果的篩選標(biāo)準(zhǔn)也不相同，導(dǎo)致不同數(shù)據(jù)比對和注釋結(jié)果也不盡相同[12]。基因組數(shù)據(jù)上傳ARDB抗性基因數(shù)據(jù)庫，共注釋得到27 736條ARGs序列，得到40種ARGs。本研究綜合CARD和ARDB的注釋結(jié)果，對鰻鱺腸道微生物的抗性基因類型進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)分析，結(jié)果見表1。

由表1可知，鰻鱺腸道微生物中共存在ARGs基因254種，歸屬于24類抗性類型。具體包括61種多重耐藥基因、46種多肽類抗生素ARGs、31種氟喹諾酮類ARGs、23種四環(huán)素類ARGs、25種β-內(nèi)酰胺類ARGs、6種大環(huán)內(nèi)酯類ARGs、9種林可酰胺類ARGs、4種利福平類ARGs、1種Microcin J25 ARGs、5種磷霉素類ARGs、5種Elfamycin ARGs、3種異煙肼類ARGs、4種鏈陽霉素A ARGs、1種螺旋霉素類ARGs、8種氯霉素類ARGs、9種氨基糖苷類抗生素ARGs、3種磺胺類ARGs、1種羰基氰化物間氯苯腙（CCCP）ARGs、1種夫西地酸類抗生素ARGs、1種阿霉素ARGs、4種甲氧芐啶類ARGs、1種硝基呋喃類ARGs、1種莫匹羅星類ARGs和1種春雷霉素類ARGs。統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明，鰻鱺腸道微生物中存在種類多樣且豐富的ARGs庫。

在CARD的注釋結(jié)果中，豐度最高的ARG為氟喹諾酮類抗性基因mfd，豐度最高的抗性類型為多肽類抗生素;在ARDB注釋結(jié)果中，豐度最高的ARG為四環(huán)素類抗性基因tetS，豐度最高的抗性類型為四環(huán)素類。綜合CARD和ARDB的注釋結(jié)果，鰻鱺腸道微生物ARGs中較高豐度的抗性類型為多肽類抗生素、多重耐藥、氟喹諾酮類、四環(huán)素類和β-內(nèi)酰胺類。表明在鰻鱺養(yǎng)殖過程中，出現(xiàn)耐多肽類抗生素、氟喹諾酮類、四環(huán)素類、β-內(nèi)酰胺類以及多重耐藥病原菌的機(jī)會相對較高。

3 討論

環(huán)境ARGs的種類和豐度與細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)組成密切相關(guān)[13]。研究表明，不同菌種攜帶ARGs的偏好性不同，優(yōu)勢菌群對環(huán)境ARGs的組成特征扮演著重要角色[14]。宏基因組測序方法不僅可以檢測ARGs的廣譜特征，同時(shí)還能檢測出環(huán)境微生物群落結(jié)構(gòu)組成。測序分析結(jié)果顯示，鰻鱺腸道微生物中的優(yōu)勢菌群由厚壁菌門（Firmicutes）、梭桿菌門（Fusobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）和擬桿菌門（Bacteroidetes）組成，這個(gè)結(jié)果與之前筆者所在課題組采用16S rRNA基因高通量測序分析得到的優(yōu)勢菌群[15]是一致的，說明本研究的宏基因組測序結(jié)果可靠性較高。但2種研究方法得到的優(yōu)勢菌群的分布比例有較大差異，分析原因可能是不同的鰻鱺腸道樣本的微生物菌群豐度本身就存在較大差異，同時(shí)也可能與不同基因組16S rRNA基因的PCR擴(kuò)增的特異性有關(guān)。此外，鰻鱺腸道的優(yōu)勢菌門和優(yōu)勢菌屬與已知斑馬魚[16]、草魚[17]和虹鱒魚[18]的腸道優(yōu)勢菌群結(jié)果相似，說明魚類腸道微生物的種類結(jié)構(gòu)相似。

從ARGs注釋結(jié)果可知，本研究共在鰻鱺腸道中檢測出254種ARGs，發(fā)現(xiàn)了許多在魚類腸道未曾報(bào)道過的ARGs，如tlrC、YojI、emrB等。導(dǎo)致這些基因未曾報(bào)道的原因可能是由于這些基因的宿主（耐藥菌）難以培養(yǎng)或是用于擴(kuò)增這些基因的引物難以設(shè)計(jì)，這也進(jìn)一步說明宏基因組測序分析方法比傳統(tǒng)方法更能全面的檢測出樣品中的ARGs[19]。Tamminen等在6年未使用過抗生素的水產(chǎn)養(yǎng)殖場中仍檢測到3種編碼四環(huán)素的ARGs[20]。本研究在鰻鱺腸道中，同樣檢測出了氯霉素類、硝基呋喃類、磺胺類、β-內(nèi)酰胺類以及人用抗生素等多種禁用漁藥的ARGs，由此可以說明水產(chǎn)養(yǎng)殖場已經(jīng)成為環(huán)境中ARGs的儲存庫。某些ARGs一旦轉(zhuǎn)移到病原菌中，將使魚病治療面臨更多的新挑戰(zhàn)，同時(shí)腸道中的細(xì)菌密度極高又極大地增加了基因橫向轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)，這些ARGs可能通過多種途徑（如食物鏈）最終傳遞到人體中。

鰻鱺腸道微生物中豐度最高的抗性類型為多肽類抗生素、多重耐藥、氟喹諾酮類、四環(huán)素類和β-內(nèi)酰胺類。多肽類抗生素、氟喹諾酮類、四環(huán)素類和β-內(nèi)酰胺類均為水產(chǎn)養(yǎng)殖中常用的動(dòng)保產(chǎn)品，尤其是多肽類抗生素，由于其添加在飼料中不影響適口性，對水產(chǎn)動(dòng)物具有促生長、提高飼料轉(zhuǎn)化率的效果，常常作為飼料添加劑廣泛使用，大多數(shù)的種類都沒有殘留限量要求[21]。在鰻鱺腸道中，檢測出多重耐藥基因61種，在CARD數(shù)據(jù)庫比對結(jié)果中，這些多重耐藥基因占ARGs基因總數(shù)的12.95%，基因的多重耐藥性已經(jīng)在許多研究中被證實(shí)[19]?？股氐氖褂眉皻埩舻沫h(huán)境選擇壓力與抗生素抗性的產(chǎn)生密切相關(guān)[3]。鰻鱺腸道中檢測出豐度較高種類繁多的多重耐藥基因可能與鰻鱺環(huán)境中使用的多種抗生素造成的微生物選擇壓力或者細(xì)菌之間ARGs的交換有關(guān)[22]。由此可知，水產(chǎn)養(yǎng)殖中抗生素的濫用和過度使用狀況不容樂觀。本研究采用宏基因組測序分析技術(shù)明確了鰻鱺腸道中ARGs的污染特征，可以為指導(dǎo)鰻鱺養(yǎng)殖抗菌藥物的監(jiān)管提供必要的參考依據(jù)，對水產(chǎn)動(dòng)物源病害防控具有重要的應(yīng)用價(jià)值，同時(shí)也表明宏基因組測序技術(shù)檢測ARGs具有的可行性和優(yōu)越性。

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