黃婷，周璐，梅嬋，徐慧

（江蘇省理化測(cè)試中心，江蘇南京 210042）

原花青素和黃酮是枸杞中最主要的兩類活性成分，二者最顯著的活性為抗氧化活性。目前常使用的抗氧化方法分為兩類：一類為基于H原子轉(zhuǎn)移的方法（HAT），包括ORAC法、TRAP法、脂質(zhì)過氧化法等；另一類為基于電子轉(zhuǎn)移的方法（SET），主要包括FRAP法、ABTS法、DPPH法等，這些方法多采用分光光度計(jì)測(cè)定顏色的變化，使用簡(jiǎn)單快速[1]。本實(shí)驗(yàn)中評(píng)價(jià)原花青素和黃酮的抗氧化活性采用FRAP法及DPPH法，以研究枸杞中原花青素和黃酮的抗氧化活性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

枸杞（特級(jí)黑枸杞，寧夏）；原花青素標(biāo)準(zhǔn)品（阿達(dá)瑪斯貝塔（上海）化學(xué)試劑有限公司）；蘆丁（總黃酮）標(biāo)準(zhǔn)品（阿達(dá)瑪斯貝塔（上海）化學(xué)試劑有限公司）；TPTZ（阿達(dá)瑪斯貝塔（上海）化學(xué)試劑有限公司）；DPPH（阿達(dá)瑪斯貝塔（上海）化學(xué)試劑有限公司）；ABTS（阿達(dá)瑪斯貝塔（上海）化學(xué)試劑有限公司）。

KQ-400KDE型高功率數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；TGL-16B高速臺(tái)式離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；A-1000S水流抽氣機(jī)（上海愛朗儀器有限公司）；OSB-2100油浴鍋（上海愛朗儀器有限公司）；UV-2102PC分光光度計(jì)（龍尼柯（上海）儀器有限公司）；HH-1系列數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海江星儀器有限公司）。

1.2 枸杞中生物活性物質(zhì)含量的測(cè)定

1.2.1 原花青素含量測(cè)定

稱取原花青素標(biāo)準(zhǔn)品10.00 mg，加入甲醇并用超聲溶解，定容至 10 mL，分別吸取 0 mL、0.10 mL、0.25 mL、0.50 mL、1.00 mL、1.50 mL，用甲醇定容至10 mL 容量瓶中，制得含量為 0.0～150.0 μg/mL 的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。將正丁醇與鹽酸按95∶5的體積比配制成300 mL混合溶液，儲(chǔ)存?zhèn)溆?。將枸杞樣品研成粉末，密封置于陰暗處?chǔ)存。稱取粉末樣品0.50 g，用30 mL乙醇溶解，并用超聲處理約20 min，用乙醇定容至50 mL，搖勻，必要時(shí)離心或放置澄清后取上清液。于10 mL具塞試管中分別加入6 mL正丁醇鹽酸溶液、1 mL系列標(biāo)準(zhǔn)管溶液和樣品溶液、2 mL硫酸鐵銨溶液（用2 mol/L鹽酸配成2%的溶液），混勻，同步做空白實(shí)驗(yàn)。將所有試管置于沸水中精確反應(yīng)40 min 后，立即放在冰水中 15 min。在 546 nm 處，用甲醇調(diào)零，測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)系列溶液和樣品的吸光度。

1.2.2 總黃酮含量測(cè)定

稱取總黃酮標(biāo)準(zhǔn)品20.00 mg，并用80%乙醇溶解定容至100 mL容量瓶中。分別吸取上述溶液2.5 mL、5.0 mL、7.5 mL、10.0 mL、12.5 mL、15.0 mL、17.5 mL、20.0 mL 于 25 mL 容量瓶，用 80% 乙醇準(zhǔn)確定容至刻度，搖勻，制得20.0～160.0 μg/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液。吸取0.5 mL上述系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，依次加入1.5 mL 95% 的乙醇溶液、0.1 mL 10% 的 AlCl3溶液、0.1 mL 1 mol/L 的乙酸鉀溶液以及 2.8 mL 蒸餾水，混勻。將所有標(biāo)準(zhǔn)系列溶液于室溫下靜置30 min。在415 nm處，用蒸餾水調(diào)零，測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度。根據(jù)測(cè)定結(jié)果繪制總黃酮吸光度曲線。稱取0.50 g枸杞粉末樣品于燒杯中，加入少量甲醇溶液并超聲后定容至50 mL容量瓶中，搖勻過濾，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器將上層清液于45 ℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至干后，加入20 mL 80%乙醇溶液溶解。按照上述方法測(cè)定樣品溶液吸光度。

1.3 生物活性物質(zhì)的抗氧化性研究

1.3.1 FRAP法評(píng)價(jià)抗氧化活性

FRAP 工作液的制備：稱取 5.1 g CH3COONa，加入20 mL乙酸溶解，并用蒸餾水準(zhǔn)確定容至250 mL，得到300 mmol/L的CH3COONa緩沖溶液備用；稱取0.270 5 g FeCl3·6H2O，用蒸餾水定容至 50 mL，得到20 mmol/L 的氯化鐵溶液備用；稱取 0.031 2 g TPTZ 用10 mL 40 mmol/L 的 HCl溶液溶解備用。將上述 3 種溶液按體積比10∶1∶1均勻混合，得到FRAP工作溶液。

抗氧化活性測(cè)定：吸取0.2 mL樣品提取液、6 mL FRAP工作液、0.6 mL蒸餾水，混合搖勻后于37 ℃水浴20 min；在593 nm處，用無水乙醇調(diào)零，測(cè)吸光度，VE溶液作陽性對(duì)照[2]。

FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線制作：用無水乙醇配制FeSO4溶液（濃度梯度為 200～6 000 μg/mL），按照上述方法測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的吸光度，得到曲線方程。FRAP值換算：在FeSO4標(biāo)準(zhǔn)曲線中，以樣品吸光度找到相對(duì)應(yīng)的FeSO4溶液的濃度，當(dāng)FeSO4溶液的濃度為1 000 μg/mL 時(shí)，F(xiàn)RAP 值為 1。

1.3.2 DPPH法評(píng)價(jià)抗氧化活性

DPPH 溶液的配制：稱取 0.019 7 g DPPH，用無水乙醇溶解（必要時(shí)超聲或加熱處理幫助溶解）并定容至250 mL，得到濃度為2×10-4mol/L的DPPH溶液[3]。

抗氧化活性測(cè)定：分別吸取2 mL樣品提取液和2 mLDPPH溶液、2 mL樣品的無水乙醇溶液和2 mL無水乙醇、2 mL無水乙醇和2 mLDPPH溶液于3只試管中，混合搖勻，在黑暗環(huán)境下放置30 min，在 517 nm波長(zhǎng)處，用無水乙醇調(diào)零后，測(cè)其吸光度。VE溶液作陽性對(duì)照。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物活性物質(zhì)的含量

如圖1所示，原花青素的標(biāo)準(zhǔn)曲線在10～150 μg/mL濃度范圍內(nèi)與吸光度有良好的線性關(guān)系，其回歸方程為：y=0.004 6x+0.010 6，R2=0.999 4。100 g 枸 杞 樣品中原花青素含量為4.26 g，實(shí)驗(yàn)的重現(xiàn)性較好。

圖1 原花青素的標(biāo)準(zhǔn)曲線

總黃酮的標(biāo)準(zhǔn)曲線在20～160 μg/mL濃度范圍內(nèi)與吸光度有良好的線性關(guān)系，其回歸方程為：y=0.006 4x-0.023 3，R2=0.999 1。100 g 枸杞樣品中總黃酮含量為0.68 g，實(shí)驗(yàn)的重現(xiàn)性較好，實(shí)驗(yàn)結(jié)果見圖2。

圖2 總黃酮的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.2 原花青素抗氧化活性測(cè)定

2.2.1 FRAP法對(duì)枸杞樣品中原花青素抗氧化活性測(cè)定結(jié)果

FRAP法測(cè)定原花青素抗氧化能力的結(jié)果如圖3所示。由圖可知，F(xiàn)RAP法測(cè)定抗氧化性時(shí)有劑量依賴關(guān)系，在測(cè)試的濃度范圍內(nèi)，F(xiàn)RAP值隨著原花青素濃度增加而增大，即原花青素濃度越高，F(xiàn)RAP值越大，反應(yīng)體系中被還原成Fe2+-TPTZ的含量越高，樣品濃度與FRAP值呈正相關(guān)關(guān)系。另外，在測(cè)試濃度范圍內(nèi)，樣品的FRAP值遠(yuǎn)高于陽性對(duì)照VE。因此，樣品有很強(qiáng)的Fe3+還原能力。

圖3 原花青素的Fe3+還原能力

2.2.2 DPPH法對(duì)樣品中原花青素抗氧化活性測(cè)定結(jié)果

DPPH法測(cè)定原花青素抗氧化能力的結(jié)果如圖4所示。隨著樣品量的逐漸增加，原花青素濃度增加，在測(cè)試濃度范圍內(nèi)，原花青素對(duì)DPPH自由基的清除能力逐漸增強(qiáng)，當(dāng)添加量在6～10 μg/mL濃度范圍內(nèi)時(shí)，清除率的增加趨勢(shì)變緩，當(dāng)濃度達(dá)到一定水平，清除率將不在增加，而趨于平穩(wěn)。另外，在測(cè)試濃度范圍內(nèi)，樣品的清除率遠(yuǎn)高于陽性對(duì)照VE。因此，樣品有很強(qiáng)的DPPH自由基消除活性。

圖4 原花青素的DPPH自由基清除率

2.3 總黃酮抗氧化活性測(cè)定

2.3.1 FRAP法對(duì)樣品中黃酮抗氧化活性評(píng)價(jià)結(jié)果

FRAP法測(cè)定總黃酮抗氧化能力的結(jié)果如圖5所示。由圖可知，在測(cè)試的濃度范圍內(nèi)，F(xiàn)RAP值隨著總黃酮濃度增加而增大，呈正相關(guān)關(guān)系。當(dāng)總黃酮濃度達(dá)到一定程度后，F(xiàn)RAP值增加緩慢。另外，樣品的FRAP值遠(yuǎn)高于陽性對(duì)照VE。因此，樣品有很強(qiáng)的Fe3+還原能力。

圖5 黃酮的Fe3+還原能力

2.3.2 DPPH法對(duì)樣品中黃酮抗氧化活性評(píng)價(jià)結(jié)果

DPPH法測(cè)定黃酮抗氧化能力的結(jié)果如圖6所示。由圖知，隨著樣品量的逐漸增加，黃酮濃度增加，黃酮含量與DPPH自由基的清除能力之間呈正相關(guān)關(guān)系，當(dāng)添加濃度達(dá)到16 μg/mL之后，清除率的增加趨勢(shì)變緩，清除率已經(jīng)接近100%。另外，在測(cè)試濃度范圍內(nèi)，樣品的自由基清除率高于陽性對(duì)照VE，而且清除率增加趨勢(shì)隨著陽性對(duì)照VE濃度升高而變緩。因此，樣品有很強(qiáng)的DPPH自由基消除活性。

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)對(duì)枸杞中原花青素和總黃酮的含量進(jìn)行了測(cè)定，同時(shí)采用了DPPH法和FRAP法對(duì)原花青素和黃酮的抗氧化活性進(jìn)行評(píng)價(jià)。實(shí)驗(yàn)表明，原花青素和黃酮的抗氧化性均高于陽性對(duì)照VE。隨著黃酮和原花青素濃度的增高，F(xiàn)RAP值和DPPH自由基的清除率增大，并且逐漸接近100%，可見總黃酮和原花青素的抗氧化性在這兩種方法評(píng)價(jià)中，存在劑量依賴關(guān)系。對(duì)比原花青素和總黃酮的抗氧化能力，可發(fā)現(xiàn)原花青素對(duì)DPPH自由基的清除能力以及Fe3+的還原能力均高于黃酮。

圖6 黃酮的DPPH自由基清除率