魏琦超，王亞麗，張琛，趙加迪

（河南科技學院生命科技學院，河南新鄉(xiāng) 453003）

木質纖維素（lignocellulose）主要包括纖維素（cellulose）、半纖維素（hemicellulose）和木質素（lignin），是自然界含量最豐富的生物質原料。其中，纖維素的豐度最高，約占其總量的30%～50%；半纖維素的豐度次之，約占其總量的15%～35%[1-2]。半纖維素的主鏈由葡萄糖（glucose）、甘露糖（mannose）和木糖（xylose）等β-D-吡喃糖（pyranose）殘基通過β-1,4-糖苷鍵連接，可分為甘露聚糖（mannan）、木聚糖（xylan）和木葡聚糖（xyloglucans）3大類[3]。木聚糖由β-D-吡喃木糖通過β-1,4-糖苷鍵連接形成主鏈，是植物半纖維素的主要組分，約占植物干重的1/3[4]。

木聚糖酶（xylanase，EC.3.2.1.8）是一類能夠將木聚糖降解成低聚木糖和少量木糖、阿拉伯糖（arabinose）的一組酶系的總稱，在飼料、食品、化工等領域的用途非常廣泛[5]。王佳玉等[6]的研究表明，在全麥粉中木聚糖酶的添加量達到0.03%，經過90min酶解反應，面筋結構可得到明顯改善。班志彬等[7]在肉雞的不同類型飼料中添加木聚糖酶，研究了對其生長性能的影響，發(fā)現(xiàn)木聚糖酶可提高平均日增重并降低料重比。王陽等[8]研究了木聚糖酶預處理對檀皮纖維漂白的影響，認為預處理可有效疏松纖維結構，提高后期處理過程中漂白劑的可及性，進而提高檀皮纖維白度。

雖已在真菌、細菌、酵母菌、海藻和植物種子、甲殼類動物、蝸牛等物種中發(fā)現(xiàn)了木聚糖酶[9-10]，但普遍認為，真菌和細菌是該酶的主要來源[11]。利用基因工程異源表達木聚糖酶，可在一定程度上解決木聚糖酶原始來源微生物目標酶表達量低、純化困難等酶生產和應用領域的限制性因素。木聚糖酶基因傳統(tǒng)發(fā)掘方式為分離自然環(huán)境中的產酶微生物，經純培養(yǎng)后克隆目標基因。然而，就土壤微生物而言，其可培養(yǎng)微生物僅占1%～10%[12-13]，因此通過傳統(tǒng)方式分離木聚糖酶產酶菌株、發(fā)掘新穎木聚糖酶基因較為困難。

宏基因組最初是指土壤細菌混合基因組[14]。Rondon 等[15]以 細菌人工染色體（bacterial artificial chromosome，BAC）載體構建了土壤宏基因組DNA文庫，文庫克隆的表型包括脂肪酶、淀粉酶、核酸酶等，該研究為基于土壤宏基因組發(fā)掘新穎工業(yè)、醫(yī)藥用酶基因奠定了基礎。本研究擬以土壤宏基因組DNA為聚合酶鏈式反應（PCR）模板，使用CODEHOP方法[16]設計木聚糖酶基因核心序列的簡并引物，采用hiTAILPCR技術[17]獲悉其側翼序列，并最終克隆非培養(yǎng)木聚糖酶基因全長序列，為有效利用土壤微生物資源，發(fā)掘新穎木聚糖酶基因奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 土壤樣品及采樣方法

土壤樣品采自河南科技學院校園內常年潮濕的花壇土。除去地表植被和枯枝落葉，鏟除表面5cm左右的表土，取樣深度距土壤表面5～10cm，置于無菌采樣袋后帶回實驗室。

1.2 生化及分子生物學試劑

土壤基因組DNA提取試劑盒購自天根生化科技（北京）有限公司，大腸桿菌（Escherichia coli）感受態(tài)細胞、微柱濃縮DNA凝膠回收試劑盒購自北京莊盟國際生物基因科技有限公司，2×Taq PCR MasterMix、DNA分子量標準品購自北京博邁德基因技術有限公司，pMD?19-T Vector Cloning Kit、PrimeSTAR?GXL DNA Polymerase 購 自 Takara Bio，pEASY?-Blunt Zero Cloning Kit購自北京全式金生物技術有限公司，瓊脂糖、50×TAE緩沖液，購自北京索萊寶科技有限公司。

1.3 土壤宏基因組DNA的提取與質量檢測

剔除土壤中的石礫和植物殘根等雜物，按照土壤基因組DNA提取試劑盒說明書提取其DNA，經瓊脂糖凝膠電泳檢測判斷所提取DNA樣品的完整性。使用微生物16S rRNA通用引物進行PCR擴增，檢驗DNA樣品是否滿足PCR擴增的純度要求。使用引物為 27F（5’AGAGTTTGATCCTGGCTCAG）/1525R（5’AAGGAGGTGATCCAGCC）[18]。反應程序為：95℃，5min；95℃，30s；55℃，30s；72℃ 45s，30個循環(huán)；72℃，5min。

1.4 木聚糖酶基因核心序列的克隆與分析

1.4.1 簡并引物設計

在UniProt網站（https://www.uniprot.org/）以檢索詞“xylanase”檢索并下載登錄號為Q8GJ44、Q9HFH0、B3A0S5等的多條已公開木聚糖酶氨基酸序列，使用CODEHOP設計基因核心區(qū)簡并引物[19]。Xyn-GH10（F）：CTACGACTGGGAYGTNIBSAAYGA；Xyn-GH10（R）：GTGACTCTGGAWRCCIABNCCRT。下劃線為核心序列的簡并區(qū)域，Y=C/T、N=A/T/G/C、I為次黃嘌呤、B=C/G/T、S=C/G、W=A/T、R=A/G。

1.4.2 核心序列擴增

以經27F/1525R檢測正常的土壤宏基因組DNA為模板，使用Xyn-GH10（F）/Xyn-GH10（R）進行PCR擴增。鑒于核心序列擴增用引物為簡并引物，反應程序采用降落PCR的方式進行，即以66℃為首個循環(huán)的退火溫度；前15個循環(huán)，每循環(huán)的退火溫度降低1℃；以51℃為退火溫度循環(huán)25輪。

1.4.3 核心序列克隆與分析

將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳和切膠回收，膠回收產物與pMD?19-T克隆載體連接，連接產物轉化DH5α感受態(tài)細胞，隨機挑取單克隆轉化子經PCR鑒定后送測序。測序結果通過以下流程進行分析：（1）測序結果去除簡并引物序列；（2）多條測序結果使用Vector NTI的Alignment子程序進行序列比對，如發(fā)現(xiàn)一致率為100%的序列，則僅保留一條序列用于后續(xù)分析；（3）序列提交至NCBI，使用blastx程序進行同源序列檢索；（4）綜合考慮檢索到同源序列的注釋信息及序列一致率，篩選相關核心序列進行側翼序列的擴增。

1.5 候選核心區(qū)側翼序列的克隆

如表1所示，根據候選基因核心區(qū)測序結果，按照hiTAIL-PCR特異性引物設計規(guī)則，設計3條特異性上游引物和3條特異性下游引物，分別與hiTAILPCR通用引物配合使用，擴增核心區(qū)3’端和5’端側翼序列。

1.6 木聚糖酶基因編碼區(qū)全長序列的克隆

將前期克隆的木聚糖酶基因核心區(qū)及其5’端、3’端側翼序列進行拼接，根據拼接序列，設計2對引物（表2），以前期相應的土壤宏基因組DNA為模板，通過巢式PCR擴增木聚糖酶基因編碼區(qū)全長序列。

表1 側翼序列擴增用引物

表2 編碼區(qū)全長序列擴增用引物

1.7 木聚糖酶基因編碼區(qū)序列的生物信息學分析

克隆序列經DNAMAN軟件翻譯為氨基酸序列后，使用各工具網站（表3）進行同源序列的比對和理化性質、蛋白結構等的分析。

表3 生物信息學分析用工具網站

2 結果與分析

2.1 土壤宏基因組DNA的質量檢測

土壤中因富含腐殖酸、多酚等雜質，其高質量微生物總DNA的提取頗有困難困難較大。本研究使用試劑盒法提取總DNA。所提樣品經瓊脂糖凝膠電泳檢測，結果如圖1所示。發(fā)現(xiàn)其條帶單一，泳道內無彌散、降解現(xiàn)象，初步認為可滿足PCR擴增對模板質量的要求。為了進一步驗證模板質量，以微生物16S rRNA通用引物27F/1525R擴增，PCR產物經電泳檢測，結果如圖2所示?？梢钥吹綌U增產物條帶清晰、符合預期大小，因此所提取DNA可滿足后續(xù)實驗要求。

圖1 土壤宏基因組DNA的電泳檢測

2.2 木聚糖酶基因核心序列的PCR擴增

目標基因編碼區(qū)核心序列的擴增，是獲得其全長的必要條件。本研究使用CODEHOP方式設計的簡并引物、通過降落PCR的方式開展上述工作。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測，獲得長度約為250bp（base pairs，堿基對）的電泳條帶（圖3），認為其符合CODEHOP簡并引物設計的預期大小。PCR產物經切膠回收后，連入T載體，隨機挑取15個單克隆經PCR檢測后送武漢金開瑞生物工程有限公司進行序列測定工作。

圖2 16S rRNAPCR 檢測

圖3 木聚糖酶基因核心序列PCR產物的電泳檢測

2.3 木聚糖酶基因核心序列的新穎性分析

將核心序列測序結果去除簡并引物及其外側序列，使用blastx程序進行同源序列檢索，發(fā)現(xiàn)有3條序列與非全長的未培養(yǎng)微生物GH10家族（glycosyl hydrolase family 10）木聚糖酶氨基酸序列具有較高的一致率，認為其具有一定的新穎性。編號為Xyn10-3的核心序列，其一致率最高（70.59%）的序列為未培養(yǎng)微生物來源木聚糖酶（ACR24800），將其作為目標序列，開展編碼區(qū)全長序列的克隆工作。

2.4 Xyn10-3編碼區(qū)全長序列的克隆

根據Xyn10-3核心序列設計特異性引物，采用hiTAIL-PCR方式克隆其5'端和3'端側翼序列。根據獲悉的側翼序列信息，設計巢式PCR引物進行編碼區(qū)全長序列的克隆。經過兩輪PCR，克隆到Xyn10-3 的完整開放閱讀框（open reading frame，ORF），全長為 1 284bp（表4）。

2.5 Xyn10-3編碼區(qū)序列的生物信息學分析

將Xyn10-3編碼區(qū)核苷酸序列進行blastx檢索，其編碼的氨基酸序列與海洋放線菌（Actinoalloteichuscyanogriseus）β-1,4-內 切 木 聚糖酶的一致率最高，且僅為51.43%，表明所克隆的Xyn10-3編碼區(qū)為未知的新序列。NCBI的結構域預測結果（圖4）顯示：Xyn10-3的295-1272位氨基酸為β-1,4-內切木聚糖酶結構域，E值（E-value）為8.22E-61，認為其預測可靠。

圖4 Xyn10-3的結構域預測

將Xyn10-3編碼區(qū)核苷酸序列翻譯為氨基酸序列，發(fā)現(xiàn)其共有427aa，分子量為47398.91Da，理論等電點為8.99。各氨基酸位點的親疏水系數(shù)如圖5所示，平均親水系數(shù)（GRAVY）為-0.287，可判斷為親水蛋白。蛋白質跨膜區(qū)域分析結果（圖6）表明，該蛋白可能不存在跨膜區(qū)域。

圖5 氨基酸疏水性分析

圖6 蛋白質跨膜區(qū)域分析

表4 Xyn10-3編碼區(qū)核苷酸序列信息

3 結論

傳統(tǒng)的新酶發(fā)掘技術方案，通常以目標性狀微生物的分離、篩選為起始環(huán)節(jié)。為了充分利用土壤未培養(yǎng)微生物蘊藏的海量基因資源，本研究嘗試使用CODEHOP方法設計的簡并引物先行克隆目標酶基因的編碼區(qū)核心序列，繼而使用hiTAIL-PCR方式獲悉其旁側DNA序列信息，最終通過巢式PCR的方式克隆全長的編碼區(qū)DNA序列。所克隆Xyn10-3經生物信息學分析，認為其是一個未報道的木聚糖酶全長基因。后續(xù)將構建pGAPZαA-Xyn10-3重組質粒，并進行畢赤酵母（Pichia pastoris）工程菌株的構建和目標蛋白的表達、純化等工作，以進一步檢測其酶活。