孫陶利,周芫宇，黎綾

（長(zhǎng)沙醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，新型藥物制劑研發(fā)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地，湖南長(zhǎng)沙 410219）

綠茶是中國(guó)主要茶類(lèi)之一，廣受歡迎，其中兒茶素約占其干重的30%。兒茶素中含量最高的表沒(méi)食子兒茶素沒(méi)食子酸酯（EGCG）約占兒茶素質(zhì)量的50%[1]。研究表明，EGCG具有多種藥理活性，包括明顯的消除體內(nèi)自由基、抗癌、抗炎、抗突變、抗衰老及改善肝功能等生物活性，現(xiàn)已列為潛在的抗癌藥物在中國(guó)和美國(guó)等國(guó)被研究[2]。

因EGCG屬于黃烷醇類(lèi)化合物，結(jié)構(gòu)中的酚羥基極易氧化為鄰醌，而鄰醌又很不穩(wěn)定，易發(fā)生復(fù)雜的聚合、縮合反應(yīng)，而形成雙黃烷醇類(lèi)、茶黃素類(lèi)和茶紅素類(lèi)等。EGCG被氧化后，其藥理活性會(huì)隨之降低[3]。因此，阻止EGCG在體外被氧化，提高EGCG的體外穩(wěn)定性是保留EGCG藥理活性的有效方法。

β-乳球蛋白（β-LG）是反芻動(dòng)物分泌的乳液中的一種乳清蛋白，屬純天然材料。研究表明，自然狀態(tài)下的β-LG可以直接結(jié)合脂肪酸、維生素A以及各種芳香族化合物等低級(jí)分子，且這些分子多位于β-LG中央空腔內(nèi)，是一種優(yōu)良的包埋材料[4]。但β-LG對(duì)親水性的分子（EGCG等）裝載效率較低，可以通過(guò)熱誘導(dǎo)改變蛋白結(jié)構(gòu)，提高β-LG裝載水溶性藥物的效率[5]。本課題將利用納米技術(shù)將EGCG包封在β-LG中央空腔內(nèi)，以提高EGCG的穩(wěn)定性。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

EGCG原料藥（98%，酷爾化學(xué)科技（北京）有限公司），EGCG對(duì)照品（98%，北京北方偉業(yè)計(jì)量技術(shù)研究院商城分院，批號(hào)：060509），β-LG（純度＞90%，上海源葉生物科技有限公司），（TritonX-100，分析純天津市恒興化學(xué)試劑有限公司），甲醇（色譜純），磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、冰乙酸、磷酸等試劑均為分析純（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司），AL204電子天平（梅特勒—托利多儀器（上海）有限公司），DP1100高效液相色譜儀（大連依利特分析儀器有限公司），WH-2微型渦旋混合儀（上海滬西分析儀器廠），HZ-9211K恒溫?fù)u床（太倉(cāng)華利達(dá)實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司），激光粒度分析儀（ZetaPALS美國(guó)布克海文儀器公司），Sino Chrome ODS-BP色譜柱（C18柱，250mm×4.6mm，5μm）。

1.2 EGCG含量測(cè)定方法的建立

1.2.1 色譜條件

色 譜 柱：C18柱，5μm，4.6 mm×250 mm；流動(dòng)相：甲醇-水-乙酸（30∶68∶2）；流速：1.0 mL/min；柱溫：25℃；檢測(cè)波長(zhǎng) 276nm；進(jìn)樣量20μL。

1.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

精密稱(chēng)取EGCG對(duì)照品25mg于25mL容量瓶中，配置為1mg/mL的EGCG母液，精密吸取0.8mL、1.0mL、1.2mL、1.4mL、1.6mL、2.0mL EGCG 母 液于10mL容量瓶中，配制一系列濃度的EGCG的對(duì)照品溶液，在1.2.1色譜條件下測(cè)定。以EGCG進(jìn)樣濃度（mg/mL）為橫坐標(biāo)（X），峰面積（mV.sec）為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖1），得回歸方程為Y=33232X-540.66，R2=0.996。結(jié)果表明，EGCG在0.08～0.20 mg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 EGCG的標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.3 EGCG-β-LG納米粒的制備

用磷酸鹽緩沖液配制一定濃度的β-LG溶液，室溫下在搖床（200r/min）中過(guò)夜，使其充分溶解。用pH為2.5的磷酸鹽緩沖液配制一定濃度的EGCG溶液。取β-LG溶液（9.5mL）水浴加熱20min，然后加入0.5mLEGCG溶液，快速渦旋混合20s，并馬上置于25℃的水浴鍋中，冷卻3h即得。

1.4 包封率的計(jì)算

包封率計(jì)算公式如（1）所示：

式中，W總表示加入的EGCG的總質(zhì)量，mg；W游表示上清液中游離的EGCG質(zhì)量，mg。

2 結(jié)果與分析

2.1 β-LG濃度對(duì)包封率的影響

固定EGCG濃度為0.4mg/mL，緩沖液pH為6.8，熱激溫度為75℃，β-LG濃度見(jiàn)表1。參照1.3中方法制備，根據(jù)公式（1）計(jì)算包封率。由表1可知，β-LG的濃度為3mg/mL時(shí)，包封率最大，選擇β-LG的濃度為3mg/mL進(jìn)行下一因素考察。

表1 β-LG濃度對(duì)包封率的影響

2.2 EGCG濃度對(duì)包封率影響

固定β-LG的濃度為3mg/mL，緩沖液pH為6.8，熱激溫度為75℃，不同EGCG濃度下的包封率如表2所示。EGCG濃度為0.8mg/mL時(shí)包封率較大，選擇EGCG濃度0.8mg/mL進(jìn)行下一因素考察。

表2 EGCG濃度對(duì)包封率的影響

2.3 pH對(duì)包封率的影響

固定β-LG的濃度為3mg/mL，EGCG濃度為0.8mg/mL，熱激溫度為75℃，測(cè)量不同緩沖液pH（6.3、6.5、6.8）下的包封率。由表3可知，緩沖液pH為6.5時(shí)，包封率最大，選擇緩沖液pH為6.5進(jìn)行下一因素考察。

表3 緩沖液pH對(duì)包封率的影響

2.4 熱激溫度對(duì)包封率的影響

固定β-LG的濃度為3mg/mL，EGCG濃度為0.8mg/mL，緩沖液pH為6.5，測(cè)量不同熱激溫度下的包封率。由表4可知，熱激溫度為75℃時(shí)包封率最大。

表4 熱激溫度對(duì)納米粒包封率的影響

綜上所述，最終選擇制備EGCG-β-LG納米粒的條件是：β-LG的濃度為3mg/mL，EGCG濃度0.8mg/mL，緩沖液pH為6.5，熱激溫度75℃。

2.5 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

用pH為6.5的磷酸鹽緩沖液配制濃度為3 mg/mL的β-LG溶液，室溫下?lián)u床（200 r/min）過(guò)夜，使其充分溶解。用pH為2.5的磷酸鹽緩沖液配制濃度為0.8 mg/mL的EGCG溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。取β-LG溶液（9.5 mL）在溫度 75℃下水浴加熱 20 min然后加入0.5mL濃度為0.8 mg/mLEGCG溶液，快速渦旋混合20s，并馬上置于25℃的水浴鍋中，冷卻3h。即得EGCG-β-LG納米粒。按照公式(1)進(jìn)行計(jì)算，納米粒的包封率為82.61%，激光粒度分析儀測(cè)定得粒徑為94.46 nm（圖2），Zeta電位為-27.9mV（圖3）。

圖2 EGCG-β-LG納米粒的粒徑

圖3 EGCG-β-LG納米粒的Zeta電位

3 納米粒穩(wěn)定性考察

3.1 EGCG-β-LG納米粒穩(wěn)定性測(cè)定

取最優(yōu)條件下制備的EGCG-β-LG納米粒到10mL容量瓶中，在高溫堿性條件下加入等量的TritonX-100破壞納米粒，旋渦震蕩使納米粒充分解體，定容，經(jīng)0.45μm微孔濾膜過(guò)濾，HPLC測(cè)定溶液中EGCG的含量。EGCG保留率計(jì)算公式如（2）所示。由圖1可知，EGCG-β-LG納米粒的EGCG保留率明顯高于EGCG水溶液。

3.2 EGCG納米粒體外釋放率測(cè)定

以EGCG水溶為對(duì)照組，取2mL的EGCG納米粒樣品加入到透析袋內(nèi)，置于0.05 mol/L、100mL的緩沖液（pH5.5、pH7.4）中，37℃下避光緩慢攪拌。每隔1h定點(diǎn)取樣一次，直至完全釋放。通過(guò)HPLC測(cè)定EGCG含量，繪制釋放曲線，見(jiàn)圖2。由圖2可知，EGCG納米粒在pH5.5和pH7.4條件下的釋放率均比EGCG水溶液慢。

圖1 EGCG納米粒保留率

圖2 EGCG納米粒體外釋放率

4 結(jié)論

通過(guò)單因素實(shí)驗(yàn)研究不同因素對(duì)β-LG和EGCG結(jié)合成納米粒的影響。β-LG濃度、EGCG濃度、緩沖液pH、熱激溫度對(duì)制備出的納米粒的粒徑、穩(wěn)定性、包封率和載藥量均有顯著影響。

穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)和體外釋放率實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，β-LG濃度為3mg/mL、EGCG濃度為0.8mg/mL、緩沖液pH為6.5、熱激溫度為75℃條件下制備的EGCG納米粒的保留率明顯高于EGCG水溶液，在pH5.5和為pH7.4條件下釋放率均小于EGCG水溶液，說(shuō)明EGCG-β-LG納米粒有一定的緩釋性能。