邢晨光

（廈門歐米克生物科技有限公司，福建廈門 361000）

香蘭素（Vanillin），又名香草醛，學(xué)名4-羥基-3-甲氧基苯甲醛，在秘魯香脂、丁子香芽油、香子蘭、咖啡、葡萄和白蘭地中有發(fā)現(xiàn)，具有香子蘭氣味，味甜[1-3]。香蘭素是一種重要的香料，可以作為賦香劑、矯味劑、協(xié)調(diào)劑、增香劑應(yīng)用于食品、煙草、日化和農(nóng)業(yè)。因其用途廣泛，每年的需求量以10%的速度增長(zhǎng)，但國(guó)內(nèi)產(chǎn)量仍然滿足不了國(guó)內(nèi)外市場(chǎng)需求[4-5]。

香蘭素的生產(chǎn)方法有化學(xué)合成法、提取法、生物轉(zhuǎn)化法和酶法[6]。隨著人們健康意識(shí)的提高，天然香蘭素的需求量和價(jià)格持續(xù)攀高，也成為了近幾年研究的熱點(diǎn)[7]。但是天然香蘭素通過植物提取所得，數(shù)量有限，遠(yuǎn)遠(yuǎn)滿足不了市場(chǎng)的需求，而化學(xué)合成法所造成的環(huán)境負(fù)擔(dān)也越來越重，所以生物轉(zhuǎn)化法和酶法成為生產(chǎn)香蘭素的主力軍[8-9]。

本文采用生物轉(zhuǎn)化法，以阿魏酸為底物通過微生物代謝而生成香蘭素，周期短、產(chǎn)率高、污染少，經(jīng)過對(duì)發(fā)酵條件的優(yōu)化，已具備工業(yè)化條件。

1 材料與方法

1.1 供試菌株

沙鏈霉菌（Streptomyces psammoticus）OMK-4，保藏于廈門歐米克生物科技有限公司菌種室。

1.2 主要儀器

30 L自動(dòng)補(bǔ)料發(fā)酵罐，上海保興生物科技有限公司；高效液相色譜（HPLC），美國(guó)安捷倫，1260Ⅱ；生物傳感器，山東科學(xué)院，SBA-40E；分光光度計(jì)，島津，UV-1780；pH計(jì)，梅特勒，S-210S。

1.3 培養(yǎng)基

1.3.1 種子培養(yǎng)基

可溶性淀粉 1.0～3.5 g/L，磷酸二氫鉀 0.1～0.5 g/L，尿素0.1～0.3 g/L，硫酸鎂0.05～0.10 g/L，碳酸鈣0.1～0.3 g/L，酵母浸粉 0.1～1.0 g/L，玉米漿 0.1～1.0 g/L，硫酸銨0.1～0.6 g/L，阿魏酸 0.2 g/L。

1.3.2 發(fā)酵培養(yǎng)基

可溶性淀粉 2.0～5.0 g/L、磷酸二氫鉀 0.1～0.3 g/L、尿素 0.1～0.5 g/L、硫酸鎂 0.05～0.1 g/L、碳酸鈣 0.5～2.0 g/L、酵母浸粉 0.1～1.0 g/L、硫酸銨 0.1～0.5 g/L、阿魏酸 2.0 g/L。

1.4 培養(yǎng)方法

1.4.1 種子培養(yǎng)

在無菌條件下從培養(yǎng)好的固體斜面上用接種鏟劃一滿環(huán)長(zhǎng)勢(shì)良好的菌株接入無菌種子培養(yǎng)基中，該種子培養(yǎng)基初始pH為5～8，在培養(yǎng)溫度28～35 ℃、轉(zhuǎn)速200～500 r/min的條件下培養(yǎng)菌體到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

1.4.2 發(fā)酵罐培養(yǎng)

將培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的種子液在無菌條件下以5%～15%的體積比接入發(fā)酵培養(yǎng)基；發(fā)酵培養(yǎng)基初始 pH 為 7.2～7.8，在溫度 30～40 ℃、攪拌轉(zhuǎn)速 200～500 r/min，通氣量 1 ∶ 0.5 的條件下發(fā)酵 70～120 h。

1.5 發(fā)酵條件優(yōu)化

1.5.1 pH對(duì)香蘭素發(fā)酵的影響

發(fā)酵過程的pH不僅影響到底物的存在形式，還和細(xì)胞的滲透壓有關(guān)聯(lián)，影響底物進(jìn)出細(xì)胞，為得到最優(yōu)發(fā)酵pH，考察不同的pH控制對(duì)香蘭素效價(jià)的影響，具體方法為：（1）發(fā)酵整個(gè)過程的pH控制為7.5；（2）0～12 h控制pH為7.5，后續(xù)控制pH為8.0；（3）發(fā)酵整個(gè)過程pH控制為8.0。

1.5.2 溶氧對(duì)香蘭素發(fā)酵的影響

實(shí)驗(yàn)證明，發(fā)酵液中溶氧的控制對(duì)菌體的生長(zhǎng)以及后期產(chǎn)物的積累均有較大的影響，因此，需要對(duì)發(fā)酵過程中的溶氧進(jìn)行控制。為得到最優(yōu)的發(fā)酵溶氧控制，考察不同的溶氧控制對(duì)菌體和產(chǎn)物的積累影響。具體實(shí)驗(yàn)如下：通過轉(zhuǎn)速和通氣量聯(lián)動(dòng)分別將溶氧控制在0%、10%、20%、30%、40%和50%。

1.5.3 培養(yǎng)溫度對(duì)香蘭素發(fā)酵的影響

溫度對(duì)微生物的生產(chǎn)、代謝產(chǎn)物的合成和積累都有重要的影響作用。溫度升高會(huì)加快微生物的生長(zhǎng)代謝，但是溫度過高也會(huì)導(dǎo)致菌體提前進(jìn)入衰亡期，影響產(chǎn)物的積累。因此對(duì)菌株進(jìn)行溫度優(yōu)化具有重要的意義[10]。為得到最優(yōu)的發(fā)酵培養(yǎng)溫度，考察不同的培養(yǎng)溫度對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響，通過控制溫度分別為25 ℃、30 ℃、35 ℃和 40 ℃來對(duì)比菌體生長(zhǎng)情況和香蘭素的積累情況，從而獲得最優(yōu)的溫度控制方式。

1.5.4 接種量對(duì)香蘭素發(fā)酵的影響

不同的接種量對(duì)菌體正常的生長(zhǎng)和代謝有重要的影響作用，接種量過小時(shí)會(huì)導(dǎo)致菌體生長(zhǎng)緩慢，菌體生長(zhǎng)的延滯期加長(zhǎng)，次生代謝產(chǎn)物復(fù)雜不利于后期產(chǎn)物的積累；接種量過大會(huì)導(dǎo)致菌體過度生長(zhǎng)，培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)損耗加大，溶氧量達(dá)不到控制要求[11]。因此控制發(fā)酵接種量具有重要的意義。為得到最優(yōu)的發(fā)酵接種量，考察不同的接種量對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響，通過接種量分別為1%、3%、5%、7%和9% 5個(gè)梯度來對(duì)比菌體生長(zhǎng)情況和香蘭素的積累情況，從而獲得最優(yōu)的接種量。

1.6 分析方法

菌體濃度測(cè)定：取培養(yǎng)液用蒸餾水稀釋一定倍數(shù)后混勻，在620nm波長(zhǎng)下，利用分光光度計(jì)測(cè)定吸光度。

殘?zhí)菧y(cè)定：采用斐林試劑滴定法進(jìn)行測(cè)定[12]。

香蘭素含量測(cè)定：采用HPLC進(jìn)行檢測(cè)[13]。

2 結(jié)果與討論

2.1 pH對(duì)香蘭素發(fā)酵的影響

如圖1所示，在pH為7.5時(shí)，菌體生長(zhǎng)情況較好，最大OD620為0.62；pH為8.0時(shí)菌體生長(zhǎng)情況較差，最大OD620為0.41；pH在0～12 h為7.5，后續(xù)控制為8.0，最大OD620為0.64。因此，pH為7.5時(shí)有助于菌體的生長(zhǎng)，pH越高，菌體生長(zhǎng)越緩慢。從分段控制pH可以看出，在后期pH調(diào)至8.0時(shí)菌體生長(zhǎng)并沒有受到影響，因此在發(fā)酵12 h左右菌體已經(jīng)基本達(dá)到穩(wěn)定期。

從圖2可以看出不同的pH控制下，香蘭素濃度分 別 為 13.200 g/L、16.988 g/L 和 14.500 g/L；在 0～12 h控制pH為7.5，后續(xù)控制pH為8.0時(shí)香蘭素轉(zhuǎn)化率最高，pH為8.0時(shí)轉(zhuǎn)化率次之，pH為7.5時(shí)轉(zhuǎn)化率較差，可能是因?yàn)樵趐H為8.0時(shí)酶活要優(yōu)于pH為7.5時(shí)。

綜合圖1和圖2可以總結(jié)出菌體在pH為7.5時(shí)菌體生長(zhǎng)情況較好，在pH為8.0時(shí)酶活轉(zhuǎn)化率較高，因此選擇在發(fā)酵過程中進(jìn)行分段控制有助于菌體的生長(zhǎng)并獲得較優(yōu)的酶活。

圖1 不同pH控制對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響

圖2 不同pH控制對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)香蘭素的影響

2.2 溶氧對(duì)香蘭素發(fā)酵的影響

從圖3可以看出，隨著溶氧量的不斷增加，菌體濃度越來越大，其中在溶氧量為0%時(shí)，菌體生長(zhǎng)情況最差，基本不長(zhǎng)菌體；在溶氧量在40%～50%時(shí)，是菌體最適生長(zhǎng)條件，菌體生長(zhǎng)至最高，OD620為0.75左右。在溶氧量不斷增加的情況下，菌體進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的時(shí)間逐漸減小，在溶氧量達(dá)到40%～50%時(shí)，菌體生長(zhǎng)的適應(yīng)期最短，可以快速進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，縮短發(fā)酵周期。因此，可以判斷菌體生長(zhǎng)需要大量的氧氣供應(yīng)，在溶氧量為40%～50%時(shí)菌體生長(zhǎng)情況最佳。

從圖4可以看出，隨著溶氧量的不斷增加，香蘭素的積累量呈現(xiàn)先逐漸上升、再緩慢下降的趨勢(shì)；在溶氧量為30%左右時(shí)，香蘭素的積累量最佳，最高可以達(dá)到17.5 g/L左右；在溶氧量較低時(shí)，香蘭素的積累量少可能是因?yàn)榫w生產(chǎn)情況不佳，酶量不夠或者低溶氧情況影響了酶活力。隨著溶氧量的逐漸增加，香蘭素的積累量逐漸出現(xiàn)了下降趨勢(shì)，特別是在50%溶氧量的情況下，在發(fā)酵后期會(huì)出現(xiàn)香蘭素減少的情況，在檢測(cè)過程中發(fā)現(xiàn)副產(chǎn)物香草酸的積累量逐漸增加，懷疑是溶氧量過大導(dǎo)致整個(gè)代謝流偏向產(chǎn)生香草酸。因此在產(chǎn)香蘭素的階段，溶氧控制不宜過高，避免影響其整體的轉(zhuǎn)化率。

綜合圖3和圖4可以看出，在發(fā)酵過程中對(duì)溶氧的控制選擇分段控制，其中在菌體生長(zhǎng)階段溶氧控制在40%～50%，以保證菌體量的積累并縮短菌體生長(zhǎng)周期；在發(fā)酵產(chǎn)香蘭素階段將溶氧控制在30%左右以保證產(chǎn)物的快速積累。

圖3 不同溶氧量對(duì)菌體生長(zhǎng)情況的影響

圖4 不同溶氧量對(duì)香蘭素轉(zhuǎn)化量的影響

2.3 培養(yǎng)溫度對(duì)香蘭素發(fā)酵的影響

從圖5可以看出，溫度較低時(shí)菌體生長(zhǎng)較為緩慢，隨著培養(yǎng)溫度的升高菌體濃度越來越高，在溫度達(dá)到35 ℃左右時(shí)，菌體濃度最高，OD620達(dá)到0.73；然而，隨著溫度升高至40 ℃，菌體濃度開始降低，可能是因?yàn)闇囟冗^高破壞了菌體正常的代謝環(huán)境。

從圖6可以看出，隨著溫度的逐漸升高，香蘭素的轉(zhuǎn)化率越來越高，轉(zhuǎn)化效果按照大小依次排序?yàn)?5 ℃、30 ℃、40 ℃和 25 ℃；按照每份菌體轉(zhuǎn)化效率計(jì)算，最適溫度依次為 40 ℃、35 ℃、30 ℃和25 ℃。從中可以看出，隨著溫度的逐漸升高，香蘭素的轉(zhuǎn)化率越來越高，在較高溫度下，香蘭素的轉(zhuǎn)化率要優(yōu)于低溫環(huán)境下香蘭素的轉(zhuǎn)化。

對(duì)比圖5和圖6可以看出，溫度對(duì)OMK-4菌株發(fā)酵轉(zhuǎn)化香蘭素的影響較大，綜合兩方面的對(duì)比，選擇在溫度為35 ℃下進(jìn)行菌株的培養(yǎng)和香蘭素的轉(zhuǎn)化。

圖5 不同溫度對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響

圖6 不同溫度對(duì)香蘭素轉(zhuǎn)化的影響

2.4 接種量對(duì)香蘭素發(fā)酵的影響

從圖7可以看出不同接種量對(duì)最終菌體濃度的影響，5種不同的接種量最終均能達(dá)到菌濃0.7左右，其中1%的接種效果較差，最高菌濃僅為0.65左右。在前10 h，隨著菌種量的加大，發(fā)酵的延滯期明顯縮短，對(duì)比1%和9%的接種量，延滯期明顯縮短了6 h左右。從圖8可以看出9%的接種量明顯要差于其他4種接種量，可能是由于在培養(yǎng)過程中菌體主要是在供給與菌體濃度的增加，酶活力相對(duì)會(huì)減小。因此接種過程中接種量不宜過大。對(duì)比1%、3%、5%和7%的接種量，5%的接種量條件下，香蘭素轉(zhuǎn)化率略高于其他4種，最高轉(zhuǎn)化量依次為17.21 g/L、17.23 g/L、18.05 g/L 和 17.27 g/L。綜合考慮圖7 和圖8，最終選擇最優(yōu)的接種量為5%。

圖7 不同接種量對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響

3 結(jié)論

30 L自動(dòng)補(bǔ)料發(fā)酵罐優(yōu)化所得到最佳的發(fā)酵條件為：在0～12 h控制pH為7.5、溶氧控制40%～50%，后續(xù)控制pH為8.0、溶氧控制30%；發(fā)酵溫度全程35 ℃，接種量5%。在最優(yōu)條件下發(fā)酵36 h，香蘭素最終效價(jià)高達(dá)25.3g/L，取得了較好的中試效果。

圖8 不同接種量對(duì)香蘭素積累的影響