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        鐵錳礦產(chǎn)電菌PseudomonasputidaF04的分離及其產(chǎn)電性能

        2020-03-07 04:59:42付彩萍蔣詠梅章文賢
        生物化工 2020年1期
        關(guān)鍵詞:電性能功率密度碳源

        付彩萍,蔣詠梅,章文賢

        (福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,工業(yè)微生物教育部工程研究中心,福建福州 350117)

        微生物燃料電池(Microbial fuel cells,MFCs)是一種利用微生物將有機(jī)物中的化學(xué)能轉(zhuǎn)化為電能的裝置。其工作原理是微生物分解陽(yáng)極室中的基質(zhì)產(chǎn)生電子,電子通過(guò)合適的電子介質(zhì)從胞內(nèi)轉(zhuǎn)移至陽(yáng)極,再通過(guò)外電路傳遞至陰極,從而產(chǎn)生電流。由于MFCs能夠?qū)U棄物中的有機(jī)質(zhì)轉(zhuǎn)化為電能,有助于同時(shí)解決能源短缺和環(huán)境污染兩大問(wèn)題,因而受到廣泛關(guān)注[1-2]。

        1911年,Potter[3]首次發(fā)現(xiàn)微生物在代謝過(guò)程中產(chǎn)生電子。產(chǎn)電菌是微生物燃料電池的核心,截至目前已有20多個(gè)屬相繼被報(bào)道[4]。其中研究較多的有希瓦氏菌屬(Shewanella)、地桿菌屬(Geobacteracae)、紅育菌屬(Rhodoferax)、弧形桿菌屬(Arcobacter)、克雷伯氏菌屬(Klebsiella)以及蒼白桿菌屬(Ochrobactrum)的菌株[5-6]。產(chǎn)電菌的電子傳遞機(jī)制與其種類密切相關(guān),例如S.oneidensise通過(guò)自身產(chǎn)生細(xì)胞色素作為可溶性電子穿梭介體,這是典型的電子穿梭體介導(dǎo)的間接傳遞機(jī)制[7];Geobactersulfurreducens等微生物利用類似纖毛或菌毛的導(dǎo)電物質(zhì),轉(zhuǎn)移電子至胞外,此為納米導(dǎo)線傳遞電子機(jī)制[8]。

        進(jìn)一步研究不同的產(chǎn)電機(jī)制有利于提高電子傳遞速率,而新的產(chǎn)電菌具有獨(dú)特的生理特性和代謝功能,可在不同的領(lǐng)域發(fā)揮作用,如生物傳感器、金屬氧化還原等。因此,新型高效產(chǎn)電菌的分離篩選及生理特性研究具有重要意義。鄭艷等[9]曾利用產(chǎn)電微生物還原磁黃鐵礦中的鐵。常見(jiàn)的電子受體主要有不溶性的鐵/錳氧化物、腐殖質(zhì)等大分子有機(jī)物和MFCs的電極3類,因此,產(chǎn)電菌廣泛分布于鐵/錳氧化物、腐殖質(zhì)這些富含電子受體的區(qū)域及厭氧環(huán)境中,如鐵錳礦山、土壤及海底沉積物等。本研究從鐵錳礦樣品中富集篩選具有產(chǎn)電性能的菌株,并對(duì)其產(chǎn)電性能進(jìn)行了初步研究,優(yōu)化其產(chǎn)電條件。

        1 材料與方法

        1.1 實(shí)驗(yàn)培養(yǎng)基

        菌株 N-N 富集培養(yǎng)基:NH4NO31.0 g/L,NaNO30.5 g/L,K2HPO40.5 g/L,MgSO4·7H2O 0.5 g/L,NaCl 0.2 g/L,檸檬酸三鈉 2.0 g/L,瓊脂 20 g/L,pH 7.0~7.2。

        LB 生長(zhǎng)培養(yǎng)基:胰蛋白胨 10 g/L,酵母粉 15 g/L,NaCl 10 g/L,pH 7.0~7.2。

        陽(yáng)極液采用M9培養(yǎng)基:Na2HPO4·12H2O 17.8 g/L,KH2PO43.0 g/L,NaCl 0.5 g/L,NH4Cl 1.0 g/L,MgSO4·7H2O 0.12 g/L,CaCl20.01 g/L 和碳源;陰極液采用0.1 mol/L鐵氰化鉀溶液:鐵氰化鉀32.92 g/L,KCl 5.6 g/L,Na2HPO4·12H2O 17.8 g/L,KH2PO43.0 g/L。

        1.2 菌株分離與鑒定

        取鐵錳礦石樣品和陽(yáng)極溶液組裝電池,待運(yùn)行穩(wěn)定后,取少量陽(yáng)極碳?xì)稚锬ぴ贜-N富集培養(yǎng)基上稀釋涂布、培養(yǎng)。挑取形態(tài)差異明顯的單菌落,分離4~5次直至得到純菌株。分別接種至MFCs檢測(cè)其產(chǎn)電能力。

        選取產(chǎn)電效果較好的MFCs,陽(yáng)極室的菌液分離純化后送至福州鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司,進(jìn)行16S rRNA測(cè)序鑒定?;蛐蛄性贜CBI上BLAST比對(duì)并提交序列,選取同源性較高的參比序列,MEGA4.0進(jìn)行同源序列比對(duì),鄰接法(NJ)構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

        1.3 MFCs組裝與運(yùn)行

        MFCs為有效容積100 mL的雙室電解池,示意圖如圖1所示,Nafion 117質(zhì)子交換膜中間隔開(kāi),陰、陽(yáng)極碳?xì)置娣e2 cm×3 cm,0.5 mm鈦絲作電子集流體,外電阻(R)為1000 Ω。培養(yǎng)12h的菌液離心,菌體接種至陽(yáng)極液中,使其終濃度OD600為1.0,在磁力攪拌器上室溫下運(yùn)行。輸出電壓(U)以每分鐘的頻率用信號(hào)記錄儀采集系統(tǒng)(MPS-010602)記錄。

        圖1 微生物燃料電池裝置示意圖

        1.4 電化學(xué)活性測(cè)試

        1.4.1 極化曲線與功率密度曲線

        MFCs運(yùn)行穩(wěn)定后,斷開(kāi)電路6~8h,依次連接阻 值 為 50000Ω、10000Ω、5000Ω、2000Ω、1000Ω、800Ω、500Ω、300Ω、200Ω、100 Ω 的電阻,運(yùn)行30 min,記錄對(duì)應(yīng)外電阻的電壓值U,繪制極化曲線及功率密度曲線。電流密度i和功率密度P根據(jù)公式1和公式2的歐姆定律計(jì)算獲得,式中S為陽(yáng)極碳?xì)值谋砻娣e。

        1.4.2 循環(huán)伏安掃描

        分別在陽(yáng)極室中加入菌體和陽(yáng)極液、12h培養(yǎng)菌液的上清液,組裝MFCs,使用電化學(xué)工作站(CHI1040C)的三電極系統(tǒng)進(jìn)行完整的循環(huán)伏安掃描。其中,工作電極為碳?xì)?、?duì)電極為鉑絲電極,參比電極為Ag/AgCl,掃描速率為0.01 V/s,電位限值為 -0.4~0.4 V,靈敏度為 10-3。

        1.5 條件優(yōu)化

        1.5.1 生長(zhǎng)培養(yǎng)基對(duì)菌株產(chǎn)電性能的影響

        采用LB與N-N富集培養(yǎng)基,進(jìn)行生長(zhǎng)能力和產(chǎn)電性能的比較。

        1.5.2 陽(yáng)極液碳源對(duì)菌株產(chǎn)電性能的影響

        M9陽(yáng)極液中分別添加2 g/L可溶性淀粉、蔗糖、葡萄糖、乙酸鈉作為碳源,組裝電池,測(cè)定電壓;改變碳源濃度(0 g/L、2 g/L、4 g/L、8 g/L),組裝電池,測(cè)定電壓。

        1.5.3 陽(yáng)極液pH對(duì)菌株產(chǎn)電性能的影響

        將陽(yáng)極液pH分別調(diào)節(jié)至4、6、7、8、10,其他條件一致,組裝電池,測(cè)定電壓。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 產(chǎn)電菌株的分離與鑒定

        從運(yùn)行穩(wěn)定的鐵錳礦樣品富集MFCs的陽(yáng)極碳?xì)种?,分離得到4個(gè)形態(tài)差異明顯的菌株,分別命名為菌株F01,F(xiàn)02,F(xiàn)03,F(xiàn)04,其形態(tài)特征與產(chǎn)電能力如表1所示。菌株F04的產(chǎn)電效果最好。

        表1 4株菌株的形態(tài)特征及產(chǎn)電能力

        菌株F04的16S rRNA基因測(cè)序結(jié)果顯示其序列長(zhǎng)度為1428 bp,將該序列提交至GenBank(序列號(hào)為MN726711)。BLAST顯示,該菌株分別與Pseudomonas putida strainM9、P.putida strain M7 及P.putida BN-St序 列 的 相 似 性 為 99.79%、99.86%和99.79%,這3個(gè)菌株均屬于惡臭假單胞菌。由MEGA4.0構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù),如圖2所示,發(fā)現(xiàn)該菌株與 P.putida strainM9(KF358272.1)序列同源性達(dá)100%,判斷菌株F04為惡臭假單胞菌,將其命名為P.putida F04。

        圖2 菌株F04的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

        2.2 條件優(yōu)化

        2.2.1 生長(zhǎng)培養(yǎng)基對(duì)菌株F04產(chǎn)電性能的影響

        分別在N-N、LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)菌株P(guān).putida F04,發(fā)現(xiàn)不同培養(yǎng)基對(duì)菌株的生長(zhǎng)有明顯影響,結(jié)果如圖3所示。N-N培養(yǎng)基中,菌株的停滯期與對(duì)數(shù)期均較短,細(xì)胞數(shù)量在8 h之后便不再增加,穩(wěn)定期較長(zhǎng)。而在LB培養(yǎng)基中,菌株不僅生長(zhǎng)繁殖速度快,且最終OD600達(dá)到2.8,是N-N培養(yǎng)基中的3.5倍。

        分別取在N-N和LB培養(yǎng)基培養(yǎng)12h的菌體,與陽(yáng)極液混合(OD600為1)加入陽(yáng)極室,組裝電池。MFCs在室溫下運(yùn)行一個(gè)周期,結(jié)果如圖4所示。發(fā)現(xiàn)兩種MFCs均在214 h達(dá)到最大電壓,分別為158 mV(N-N)和 167 mV(LB),高于 100 mV 的持續(xù)時(shí)間分別為 253 h(N-N)和 315 h(LB)。由于兩個(gè)MFCs的陽(yáng)極室中起始菌體數(shù)量相同,可見(jiàn)LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)的菌株產(chǎn)電性能較好,推測(cè)與LB培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)較豐富有關(guān)。

        圖3 培養(yǎng)基對(duì)菌株F04生長(zhǎng)曲線的影響

        圖4 培養(yǎng)基對(duì)菌株F04產(chǎn)電性能的影響

        2.2.2 陽(yáng)極液碳源對(duì)菌株F04產(chǎn)電性能的影響

        碳源是微生物生長(zhǎng)的基礎(chǔ),MFCs陽(yáng)極室中的微生物分解碳源產(chǎn)生電子和質(zhì)子,電子再經(jīng)陽(yáng)極至陰極的傳遞產(chǎn)生電流。因此,碳源的種類和含量差異會(huì)導(dǎo)致微生物的代謝途徑和氧化還原反應(yīng)發(fā)生變化,進(jìn)而影響電子產(chǎn)生的快慢及產(chǎn)量的高低,最終影響MFCs的產(chǎn)電性能[10]。

        不同碳源對(duì)P.putida F04產(chǎn)電性能的影響見(jiàn)圖5。以乙酸鈉作為碳源時(shí),MFCs的輸出電壓極低且長(zhǎng)時(shí)間低于20 mV。然而,Kim[11]在培養(yǎng)G.sulfurreducens時(shí),只有乙酸作為碳源時(shí)菌株才生長(zhǎng)且最高功率密度為13~16 mW/m2。可見(jiàn)碳源種類會(huì)對(duì)產(chǎn)電菌的適應(yīng)性產(chǎn)生顯著性影響。

        以葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉作為陽(yáng)極液碳源時(shí),MFCs產(chǎn)電較高,均達(dá)到100 mV以上;以葡萄糖為碳源的MFCs在60 h即可達(dá)到最大輸出電壓119 mV,用時(shí)最短;以可溶性淀粉為碳源的MFCs產(chǎn)電最高,294 h 電壓達(dá)到 198 mV;以蔗糖作為碳源的 MFCs,93 h內(nèi)電壓達(dá)到189 mV。以葡萄糖、可溶性淀粉和蔗糖為碳源的MFCs的電壓維持高于100 mV的時(shí)間分別為17h、53h和275 h。以上結(jié)果與3種碳源的相對(duì)分子質(zhì)量和結(jié)構(gòu)相對(duì)應(yīng),葡萄糖為單糖,能直接被微生物利用,因此達(dá)到最高電壓的速度較快,但維持高電壓的時(shí)間短??扇苄缘矸鄣姆肿咏Y(jié)構(gòu)較復(fù)雜,需要水解成小分子物質(zhì),才能被微生物代謝,故而達(dá)到最大電壓值的時(shí)間較長(zhǎng)。蔗糖為二糖分子,被微生物分解為果糖和葡萄糖,產(chǎn)電速率快,在52 h后蔗糖MFCs電壓便遞增,產(chǎn)電量較高。綜合最大輸出電壓和產(chǎn)電速率考慮,將蔗糖作為P.putida F04產(chǎn)電的碳源進(jìn)行后續(xù)研究。

        在陽(yáng)極液中加入不同濃度的蔗糖作為碳源,如圖6所示,MFCs電壓隨蔗糖濃度的增大而上升。陽(yáng)極液中碳源濃度為0時(shí),MFCs幾乎不產(chǎn)電;蔗糖濃度為2 g/L時(shí),菌株輸出電壓在69 h升高至最大輸出電壓152 mV;8g/L蔗糖時(shí)菌株在后期稍有下降。整體來(lái)看,4 g/L蔗糖作為碳源,菌株的產(chǎn)電效果較好,最大電壓達(dá)到217 mV。

        圖5 碳源種類對(duì)菌株F04產(chǎn)電性能的影響

        圖6 碳源濃度對(duì)菌株F04產(chǎn)電性能的影響

        2.2.3 陽(yáng)極液pH對(duì)菌株F04產(chǎn)電性能的影響

        pH對(duì)微生物的生長(zhǎng)具有極大影響,在MFCs中,陽(yáng)極的pH值通過(guò)改變陽(yáng)極液中的離子濃度、細(xì)胞內(nèi)的酶活性和細(xì)胞膜所帶電荷的狀態(tài),從而導(dǎo)致產(chǎn)電菌的底物代謝速率、產(chǎn)生電子的多少及生物膜的形成發(fā)生變化[12]。

        將陽(yáng)極液調(diào)至不同pH,運(yùn)行MFCs,輸出電壓見(jiàn)圖7。與 Tremouli[12]和 S.Veer Raghavulu[13]的結(jié)果類似,在中性環(huán)境下,P.putida F04產(chǎn)電性能最好,陽(yáng)極液pH為7時(shí),MFCs的最大輸出電壓為266 mV,且產(chǎn)電能力最為穩(wěn)定;pH為8時(shí),最大輸出電壓為180 mV,高于pH為6時(shí)最大輸出電壓的1.5倍,可見(jiàn)菌株P(guān).putida F04更適應(yīng)偏堿性環(huán)境,而偏酸性環(huán)境不利于其產(chǎn)電。由于強(qiáng)酸、強(qiáng)堿會(huì)破壞生物大分子的穩(wěn)定性,影響細(xì)胞酶活性,不利于菌體的生長(zhǎng),導(dǎo)致陽(yáng)極碳?xì)值纳锬るy以形成,因而陽(yáng)極液pH為4和10時(shí),MFCs產(chǎn)電量極低。

        圖7 不同pH的MFCs輸出電壓

        2.3 極化曲線和功率密度曲線

        極化曲線和功率密度曲線是描述MFCs電化學(xué)性能的重要判斷方法。隨著外電阻減小,電流密度增大,外電壓減少,功率密度先上升后下降[14]。當(dāng)外阻與內(nèi)阻相同時(shí),面積功率密度最大,故通過(guò)功率密度曲線可獲得MFC的內(nèi)阻值[15]。

        4 g/L蔗糖為碳源的MFCs的極化曲線與功率密度曲線見(jiàn)圖8。開(kāi)路電壓為564mV,整體看來(lái),電流密度與外電壓之間呈線性相關(guān),但區(qū)域1偏移擬合曲線,電壓急劇下降,這是因電極氧化還原反應(yīng)、細(xì)胞膜與電極間的電子傳遞過(guò)程造成的能量損失,引起的活化內(nèi)阻。區(qū)域2電壓二次降低,是因電極底物的消耗速率和底物的補(bǔ)給速率不同引起的傳質(zhì)內(nèi)阻[16]。功率密度曲線中,電流密度為956 mA/m2,最大面積功率密度為 181.8 mW/m2,此時(shí)外電阻為 1000 Ω,由此判斷,微生物燃料電池內(nèi)阻為1000 Ω。

        表2是菌株F04與首次被報(bào)道典型產(chǎn)電菌的產(chǎn)電性能的對(duì)比。為便于比較,面積功率密度單位統(tǒng)一為mW/m2。在已發(fā)現(xiàn)的產(chǎn)電菌中,以乳酸鹽為碳源的Shewanellaoneidensis DSP10和以乙酸鹽為碳源的Rhodopseudomonaspalustris DX-1的面積功率密度最高,分別為 3000mW/m2、2720 mW/m2,其他菌株面積功率密度多在30~400 mW/m2。經(jīng)初步條件優(yōu)化,菌株P(guān).putida F04 產(chǎn)電面積功率密度達(dá)到 181.8 mW/m2。

        2.4 循環(huán)伏安掃描

        產(chǎn)電菌的氧化還原性是MFCs運(yùn)行的關(guān)鍵。產(chǎn)電菌產(chǎn)生電子介質(zhì),將氧化還原過(guò)程中產(chǎn)生的電子傳遞到胞外的產(chǎn)電機(jī)制,是目前最具說(shuō)服力的產(chǎn)電機(jī)理。而循環(huán)伏安法(cyclic voltammetry,CV)是用來(lái)檢測(cè)微生物中是否有電子介質(zhì)的常用方法[28]。

        為進(jìn)一步研究菌株P(guān).putida F04的產(chǎn)電機(jī)制,將菌體和陽(yáng)極液、上清液各進(jìn)行了一次完整的循環(huán)伏安掃描,結(jié)果見(jiàn)圖7。菌體和陽(yáng)極液在-0.071 V、-0.270 V有明顯的氧化峰和還原峰,而上清液未出現(xiàn)氧化還原峰,這表明傳遞電子的介質(zhì)可能存在于菌體中。

        圖7 菌株F04的循環(huán)伏安曲線

        3 結(jié)論

        (1)本研究從鐵錳礦樣品中富集分離得到1株產(chǎn)電能力較強(qiáng)且運(yùn)行穩(wěn)定的菌株,鑒定并命名為P.putida F04。

        圖8 極化曲線與功率密度曲線

        (2)菌株的生長(zhǎng)培養(yǎng)基、陽(yáng)極液的碳源和pH等參數(shù)對(duì)菌株P(guān).putida F04的產(chǎn)電性能有較大影響。LB培養(yǎng)基有利于菌株生長(zhǎng);乙酸鈉不利于MFCs產(chǎn)電;以葡萄糖為碳源時(shí),MFCs在60 h內(nèi)達(dá)到最大電壓119 mV;以可溶性淀粉為碳源,MFCs高于 100 mV持續(xù)時(shí)間長(zhǎng),而在4 g/L蔗糖濃度陽(yáng)極液下,菌株的產(chǎn)電速率較快且最大輸出電壓較高。菌株在中性環(huán)境下產(chǎn)電能力最強(qiáng),最高可達(dá)到266 mV,酸性、堿性環(huán)境不利于產(chǎn)電。

        表2 初次報(bào)道的產(chǎn)電菌的產(chǎn)電能力

        (3)以4 g/L蔗糖為碳源時(shí),菌株F04最大面積功率密度達(dá)181.8 mW/m2,內(nèi)電阻為 1000 Ω。循環(huán)伏安掃描分析表明,傳遞電子的介質(zhì)可能存在于菌體中,但具體的產(chǎn)電機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究。

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