馬曉鵬，宋立群，楊紅利，周琪，李佳琦，范楨亮，贠捷，宋業(yè)旭

(1.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院腎病科，哈爾濱150040； 2.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，哈爾濱150040)

慢性腎臟病(chronic kidney disease,CKD)是由多種原發(fā)性或繼發(fā)性腎臟疾病導(dǎo)致的慢性腎臟疾病。自2002年美國腎臟病及透析臨床實踐指南提出CKD的理念及定義后，十余年內(nèi)CKD發(fā)病率不斷增加，已成為一種嚴(yán)重威脅人類健康的慢性疾病。腎間質(zhì)纖維化是CKD進展至終末期腎臟病的病理表現(xiàn)和途徑。既往研究證明，腎間質(zhì)纖維化是一個涉及氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)以及與轉(zhuǎn)化生長因子-β/Smad和Wnt/β聯(lián)蛋白(β-catenin)等多條細(xì)胞信號通路密切相關(guān)的病理變化[1]。其中Wnt/β-catenin信號通路是近年來研究較為廣泛的一個細(xì)胞信號通路，研究發(fā)現(xiàn)其在糖尿病腎病、梗阻性腎病和多囊腎中均有明顯活化[2]。進一步研究發(fā)現(xiàn)Wnt/β-catenin信號通路在急性和慢性腎損傷中發(fā)揮截然不同的作用，表明可能成為干預(yù)腎間質(zhì)纖維化的新的重要靶點[3]。

蟲草益腎方是宋立群教授根據(jù)多年臨床及科研工作擬定的經(jīng)驗方，前期已有大量臨床和動物研究證明蟲草益腎方在防治腎間質(zhì)纖維化中具有多靶點、多環(huán)節(jié)、多角度的優(yōu)勢。蟲草益腎方可以通過調(diào)節(jié)核因子κB及相關(guān)細(xì)胞因子的表達延緩CKD進展，抑制腎間質(zhì)纖維化[4]。本課題旨在分析蟲草益腎方對Wnt/β-catenin信號通路的干預(yù)作用及與福辛普利作用靶點的差異，探究其與藥效的關(guān)系，從而闡明蟲草益腎方多途徑、多靶點防治腎間質(zhì)纖維化的優(yōu)勢。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 清潔級雄性Wistar大鼠50只，體重180～200 g，平均(200±20) g，購自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)實驗動物中心[許可證號：SYXK(黑)2013-012]，飼養(yǎng)于臨床分子生物學(xué)實驗室(中醫(yī)管理局Ⅲ級重點實驗室)，飼養(yǎng)環(huán)境保持濕度40%～70%，溫度恒定在(22±2) ℃，給予實驗大鼠12/12 h晝夜循環(huán)。

1.1.2藥品與試劑 中藥飲片(黃芪、大黃、水蛭、草豆蔻、貓須草)購自黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院。冬蟲夏草菌絲粉由江西濟民可信集團提供(批號：180521)。福辛普利(商品名：蒙諾)購自中美上海施貴寶制藥有限公司(批號：P2018627151130753)。

肌酐(SBJ-R0120)、尿素氮(SBJ-R0119)、尿蛋白(SBJ-R1384)檢測試劑盒購自德國羅氏診斷有限公司；蘇木精購自上海標(biāo)本模型廠(329D0312)；兔Wnt4(K005478P)、Wnt5a(BA23921)、基質(zhì)金屬蛋白酶7(matrix metalloproteinase 7,MMP-7)(K001731P)多克隆抗體購自北京索萊寶科技有限公司。

1.1.3儀器設(shè)備 PL602-S精密電子天平[梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司]；日立-7170A型自動生化分析儀(日本日立公司)；HZS-HA水浴振蕩器(哈爾濱市東聯(lián)電子技術(shù)開發(fā)有限公司)；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠)；電泳儀、電泳槽及凝膠成像分析系統(tǒng)[伯樂生命醫(yī)學(xué)產(chǎn)品(上海)有限公司]。

1.2方法

1.2.1動物分組 將50只Wistar大鼠根據(jù)隨機數(shù)字法分為空白組10只，假手術(shù)組10只，以及造模組30只。造模組在建立單側(cè)輸尿管梗阻模型后再隨機分為模型組、蟲草益腎方組、福辛普利組，每組10只。

1.2.2單側(cè)輸尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction,UUO)模型建立 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進行手術(shù)造模，于造模前24 h禁食不禁水。采用10%水合氯醛以0.3 mL/100 g的劑量腹腔注射麻醉。常規(guī)固定麻醉后的大鼠，備皮、消毒、鋪巾，于大鼠左側(cè)腹腎區(qū)切口，鈍性分離左側(cè)輸尿管，用4-0手術(shù)線，在腎盞處和腎下極處分別結(jié)扎并離斷輸尿管。手術(shù)后將腎臟置于原位，局部給予適量的注射用青霉素，逐層縫合肌肉與皮膚，手術(shù)切口處?？瞻捉M不做任何處理，假手術(shù)組僅游離左腎輸尿管，但不結(jié)扎離斷。

1.2.3藥物制備 將黃芪、大黃、水蛭、草豆蔻、貓須草混合后用冷水浸泡2 h，每次煎煮40 min，煎煮2次后將得到水煎液混合，使用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將水煎液濃縮成含生藥0.657 g/mL的濃縮液，密閉避光保存于4 ℃冰箱中，保質(zhì)期3 d。福辛普利用無菌注射用水配置成0.09 mg/mL的水溶液，密閉避光保存于4 ℃冰箱中，給藥當(dāng)日現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.2.4給藥方法 造模組術(shù)后第1天開始給予灌胃治療，其中蟲草益腎方組大鼠給予10 mL/kg蟲草益腎方水煎液灌胃，福辛普利組給予10 mL/kg福辛普利水溶液灌胃，空白組、假手術(shù)組和模型組給予同體積的0.9%氯化鈉注射液灌胃，連續(xù)給藥28 d。

1.2.5樣本采集 于給藥后的第27天灌胃后將各組大鼠置于代謝籠中收集24 h尿液，記錄尿量，用于24 h尿蛋白定量測定。第28天給藥后2 h，用10%水合氯醛以0.3 mL/100 g的劑量腹腔注射麻醉大鼠。常規(guī)固定麻醉后的大鼠，備皮、消毒、鋪巾，腹部正中線行縱向切口，暴露大鼠下腔靜脈。采集下腔靜脈血5 mL，相對離心力29 200×g,離心10 min分離血清，用于肌酐、尿素氮檢測。隨后游離大鼠雙側(cè)腎臟，稱取腎臟重量后將梗阻側(cè)腎組織沿腎門部切成兩部分，上部腎組織用于腎間質(zhì)纖維化的病理學(xué)檢測(蘇木精-伊紅染色與Masson染色)，中部及下部腎組織采用Western blot檢測相關(guān)分子生物學(xué)指標(biāo)(Wnt4、Wnt5a以及MMP-7)。

1.2.6腎組織形態(tài)學(xué)觀察 腎組織采用10%甲醛固定，梯度乙醇脫水，二甲苯透明，石蠟包埋，制成3 μm 厚切片，中性樹膠封片，并行蘇木精-伊紅染色與Masson染色。Masson染色在200倍光鏡下觀察腎間質(zhì)膠原纖維染色，每組選取10張切片，每張切片選取不重復(fù)的10個視野。借助HMIAS-2000系統(tǒng)計算纖維化面積占整個視野腎間質(zhì)面積的百分比(排除腎血管、腎小球、腎小管所占面積)。

1.2.724 h尿蛋白定量與腎功能檢測 采用日立-7170A型自動生化分析儀進行24 h尿蛋白定量、血肌酐和尿素氮的檢測。

1.2.8Western blot檢測蛋白表達 細(xì)胞裂解液(磷酸鹽緩沖溶液∶乙二胺四乙酸∶蛋白酶抑制劑=100∶1∶1)提取腎組織總蛋白，將混合液置于冰上，勻漿。勻漿后在冰上靜置30 min，相對離心力29 200×g，離心15 min后取上清液。二喹啉加酸法測定蛋白濃度，根據(jù)蛋白marker位置切下目的蛋白所在的聚丙烯酰胺凝膠電泳；將蛋白轉(zhuǎn)至聚偏氟乙烯膜后，Tris-HCl-Tween緩沖鹽溶液洗膜3次，每次5 min。室溫下二抗孵育1 h，化學(xué)發(fā)光成像儀中顯影。目的蛋白與內(nèi)參照β-actin吸光度值之比為該蛋白的相對表達量。

2 結(jié) 果

2.1腎組織外觀 造模時肉眼觀察各個大鼠雙側(cè)腎臟，空白組、假手術(shù)組、模型組、蟲草益腎方組以及福辛普利組并未發(fā)現(xiàn)肉眼可見的差異。第28天取材時發(fā)現(xiàn)模型組結(jié)扎側(cè)腎臟均較對側(cè)腎臟明顯腫大，顏色呈暗紅色或紫紅色，腎盂、腎盞擴張。切開腎臟后發(fā)現(xiàn)腎盂積水，腎盂內(nèi)可見大量淡黃色或暗紫色膠凍樣血塊，腎皮質(zhì)變薄。蟲草益腎方組與福辛普利組大鼠也均可見上述典型表現(xiàn)，但較模型組輕，空白組與假手術(shù)組均未見上述表現(xiàn)。說明造模時已順利結(jié)扎了左輸尿管，所有大鼠均成功建立UUO大鼠模型，見圖1。

2.2腎組織形態(tài)學(xué)觀察 顯微鏡下觀察空白組和假手術(shù)組大鼠腎組織，未見明顯的病理改變，腎間質(zhì)無炎癥細(xì)胞浸潤及纖維組織形成。模型組造模后28 d發(fā)現(xiàn)大部分腎小球硬化壞死，腎小管重度擴張或萎縮，間質(zhì)大面積炎癥細(xì)胞浸潤。可見間質(zhì)局灶性出血，局灶腎小管上皮細(xì)胞脫落，部分小管腔內(nèi)可見紅細(xì)胞管型和透明管型，腎間質(zhì)纖維化，幾乎觀察不到正常腎組織。蟲草益腎組和福辛普利組大鼠的腎組織也可見明顯的腎小管擴張，間質(zhì)炎癥細(xì)胞浸潤，紅細(xì)胞管型和透明管型，腎間質(zhì)纖維化與腎小球硬化，但程度明顯較模型組輕微，見圖2。

1a：正常大鼠雙腎； 1b：UUO大鼠雙腎； 1c：UUO大鼠雙腎剖面; UUO：單側(cè)輸尿管梗阻

HE：蘇木精-伊紅

2.3各組大鼠腎組織纖維化水平比較 各組大鼠纖維化面積比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)，模型組、蟲草益腎方組、福辛普利組腎間質(zhì)纖維化面積大于空白組和假手術(shù)組(P<0.05)，蟲草益腎方組、福辛普利組小于模型組(P<0.05)，假手術(shù)組與空白組腎間質(zhì)纖維化面積比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

組別只數(shù)腎纖維化面積空白組102.19±0.21假手術(shù)組102.20±0.26模型組1050.31±3.54ab蟲草益腎方組1043.57±2.11abc福辛普利組1046.76±4.10abcF值891.684P值<0.001

a與空白組比較，P<0.05；b與假手術(shù)組比較，P<0.05；c與模型組比較，P<0.05

2.4理化指標(biāo)

2.4.1各組大鼠24 h尿量和24 h尿蛋白定量比較 第28天時，各組大鼠24 h尿量與24 h尿蛋白定量比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。模型組、蟲草益腎方組、福辛普利組24 h尿量低于空白組、假手術(shù)組(P<0.05)，蟲草益腎方組、福辛普利組高于模型組(P<0.05)，福辛普利組高于蟲草益腎方組(P<0.05)，空白組與假手術(shù)組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；模型組、蟲草益腎方組、福辛普利組24 h尿蛋白定量高于空白組、假手術(shù)組(P<0.05)，蟲草益腎方組、福辛普利組低于模型組(P<0.05)，福辛普利組高于蟲草益腎方組(P<0.05)，空白組與假手術(shù)組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表2。

2.4.2各組大鼠血尿素氮與血肌酐比較 第28天時，各組大鼠血尿素氮與血肌酐比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。模型組、蟲草益腎方組以及福辛普利組血尿素氮、血肌酐水平均高于空白組和假手術(shù)組(P<0.05)，蟲草益腎方組血尿素氮低于模型組(P<0.05)，蟲草益腎方組和福辛普利組血肌酐低于模型組(P<0.05)，空白組與假手術(shù)組血尿素氮與血肌酐水平比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表3。

組別只數(shù)24 h尿量(mL)24 h尿蛋白定量(g)空白組1018.18±2.702.04±0.20假手術(shù)組1018.91±1.711.98±0.24模型組108.15±1.39ab10.24±1.34ab蟲草益腎方組1013.16±3.59abc4.49±1.34abc福辛普利組1014.82±2.74abc5.87±0.54abcdF值28.815234.875P值<0.001<0.001

a與空白組比較，P<0.05；b與假手術(shù)組比較，P<0.05；c與模型組比較，P<0.05；d與蟲草益腎方組比較，P<0.05

組別只數(shù)血尿素氮(mmol/L)血肌酐(μmol/L)空白組105.45±0.5530.09±4.67假手術(shù)組105.96±2.8427.44±5.05模型組1013.26±1.91ab72.94±5.48ab蟲草益腎方組109.50±2.78abc49.93±6.85abc福辛普利組1011.31±1.91ab62.97±3.01abcdF值24.312149.098P值<0.001<0.001

a與空白組比較，P<0.05；b與假手術(shù)組比較，P<0.05；c與模型組比較，P<0.05；d與蟲草益腎方組比較，P<0.05

2.4.3各組大鼠腎組織Wnt4、Wnt5a和MMP-7水平比較 第28天時各組大鼠腎組織Wnt4、Wnt5a和MMP-7表達水平比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.01)。模型組Wnt4表達水平高于空白組和假手術(shù)組(P<0.05)，福辛普利組高于假手術(shù)組(P<0.05)，蟲草益腎方與福辛普利組均低于模型組(P<0.05)，空白組和假手術(shù)組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)；模型組、蟲草益腎方組以及福辛普利組Wnt5a、MMP-7高于空白組和假手術(shù)組，蟲草益腎方組和福辛普利組低于模型組(P<0.05)，空白組和假手術(shù)組比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表4、圖3。

組別只數(shù)Wnt4Wnt5aMMP-7空白組100.229±0.0280.496±0.0490.016±0.002假手術(shù)組100.158±0.0150.307±0.0730.016±0.006模型組101.738±0.793ab6.660±0.363ab4.445±0.310ab蟲草益腎方組100.419±0.041c1.418±0.029abc1.068±0.088abc福辛普利組100.614±0.072bc1.277±0.063abc0.722±0.051abcF值32.5212 393.3591 590.451P值<0.001<0.001<0.001

MMP-7:基質(zhì)金屬蛋白酶7；a與空白組比較，P<0.05；b與假手術(shù)組比較，P<0.05；c與模型組比較，P<0.05

MMP：基質(zhì)金屬蛋白酶

3 討 論

腎間質(zhì)纖維化是多種CKD最終都要經(jīng)歷的病理改變，腎間質(zhì)纖維化時腎臟的固有結(jié)構(gòu)被增生的纖維組織替代，腎功能逐漸喪失。近年來，腎間質(zhì)纖維化在CKD進展中的重要性逐漸被認(rèn)識，延緩腎間質(zhì)纖維化進展逐漸成為臨床治療CKD的重要舉措[5-7]。大量研究表明中醫(yī)藥防治CKD具有多靶點、不易產(chǎn)生耐藥性、長期使用不良反應(yīng)少、臨床療效肯定等優(yōu)點，逐漸得到臨床腎臟病醫(yī)師的認(rèn)可[8-13]。中醫(yī)學(xué)認(rèn)為CKD病機是以“正虛邪實”為關(guān)鍵，正虛是以肺、脾、腎三臟不足為主，邪實是以體內(nèi)“濁、痰、瘀、毒”壅盛為標(biāo)。“虛”“濁”“痰”“瘀”“毒”五大環(huán)節(jié)，貫穿于CKD發(fā)生、發(fā)展的全過程。因此，治療CKD應(yīng)標(biāo)本兼顧，扶正祛邪。

宋立群教授基于中醫(yī)“氣化”學(xué)說，提出了“補肺健脾益腎，泄?jié)犰铕鼋舛尽钡闹委熢瓌t，并總結(jié)出經(jīng)驗方蟲草益腎方，得到了較好的臨床效果[9-10,14-15]。蟲草益腎方由冬蟲夏草菌絲粉、黃芪、大黃、水蛭、草豆蔻、貓須草6味藥物組成。其中蟲草甘溫，重在補肺益腎。大黃泄?jié)犰铕鼋舛?，黃芪重在健脾化痰，貓須草利水解毒，水蛭破血逐瘀，草豆蔻長于燥濕健脾，芳化疏利，旨在恢復(fù)三焦氣化。方中蟲草、黃芪為主藥，意在補肺健脾益腎，大黃、水蛭、草豆蔻、貓須草為輔藥，意在泄?jié)犰铕鼋舛?。藥雖六味，性味歸經(jīng)，蟲草主入，黃芪主升，大黃主降，貓須草、水蛭、草豆蔻主出，充分體現(xiàn)了“氣化”學(xué)說的升降出入原則[8,16-18]。

Wnt/β-catenin信號通路是近年來在CKD領(lǐng)域研究較為廣泛的一個細(xì)胞信號通路。體內(nèi)外研究均表明，Wnt/β-catenin信號通路下游調(diào)控著數(shù)個與腎間質(zhì)纖維化密切相關(guān)的靶基因，如Snail1、纖溶酶原激活物抑制劑-1、MMP-7等[19]。Wnt/β-catenin信號通路的活化與腎間質(zhì)纖維化的進展密切相關(guān)，靶向抑制Wnt/β-catenin信號通路可以有效抑制成纖維細(xì)胞的增殖與活化[20]，上皮細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)換[21]，抑制UUO大鼠腎間質(zhì)纖維化的進展[22]。近年來實驗研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)典途徑的Wnt/β-catenin信號通路較非經(jīng)典途徑的Wnt/β-catenin信號通路在UUO導(dǎo)致的腎間質(zhì)纖維化發(fā)病中發(fā)揮更重要的作用[23]。部分中藥單體抗纖維化的研究證明，某些中藥單體成分可以通過干預(yù)Wnt/β-catenin信號通路發(fā)揮抗纖維化的作用機制，表明Wnt/β-catenin信號通路同樣可能是中藥抗腎間質(zhì)纖維化的重要治療靶點[5-7]。

本研究結(jié)果顯示，單側(cè)輸尿管梗阻后第28天，UUO大鼠24 h尿蛋白定量明顯升高，血肌酐、尿素氮水平顯著升高，高于正常大鼠與假手術(shù)組大鼠(P<0.05)。在給予大鼠蟲草益腎方或福辛普利干預(yù)后，大鼠24 h尿蛋白定量、血肌酐、尿素氮水平較模型組明顯降低(P<0.05)，有效保護了大鼠腎功能。此外，UUO大鼠腎組織中Wnt4、Wnt5a以及MMP-7水平均較正常大鼠顯著升高，而運用蟲草益腎方或福辛普利干預(yù)后，大鼠腎組織中Wnt4、Wnt5a以及MMP-7水平均較模型組有所降低(P<0.05)。說明Wnt/β-catenin信號通路與UUO大鼠梗阻腎組織纖維化進展密切相關(guān)，UUO大鼠梗阻腎組織中Wnt4/Wnt5a以及MMP-7水平均明顯升高，且與大鼠梗阻腎組織正常結(jié)構(gòu)被破壞，炎癥細(xì)胞浸潤，腎間質(zhì)纖維化以及腎小球硬化的程度保持一致。各組間Wnt/β-catenin信號通路相關(guān)分子的表達水平與其腎間質(zhì)纖維化程度保持一致，說明Wnt/β-catenin信號通路的活化與UUO大鼠腎間質(zhì)纖維化密切相關(guān)，Wnt/β-catenin信號通路會進一步加重UUO大鼠腎間質(zhì)纖維化的進展。

本研究進一步研究發(fā)現(xiàn)，給予大鼠蟲草益腎方或福辛普利干預(yù)均可有效抑制UUO大鼠梗阻腎組織中Wnt/β-catenin信號通路活化以及相關(guān)信號分子的表達。同時蟲草益腎方與福辛普利均可有效抑制UUO大鼠梗阻腎組織的結(jié)構(gòu)損傷與破壞，減輕腎組織中炎癥細(xì)胞的浸潤，延緩腎間質(zhì)纖維化以及腎小球硬化的進展。蟲草益腎方對UUO大鼠梗阻腎組織中Wnt/β-catenin信號通路以及腎間質(zhì)纖維化的抑制作用明顯大于福辛普利，說明Wnt/β-catenin信號通路的活化可能是UUO大鼠腎間質(zhì)纖維化發(fā)生發(fā)展的重要信號通路，且其可能是蟲草益腎方與福辛普利治療腎間質(zhì)纖維化的重要機制之一，值得深入研究。

總之，腎間質(zhì)纖維化是多種慢性腎臟損傷的共同病理改變，各種原因引起的腎損傷均可能通過多種機制導(dǎo)致腎間質(zhì)纖維化。中藥復(fù)方具有多種有效成分，通過同時干預(yù)多個靶點而發(fā)揮療效的特殊作用機制已得到廣大學(xué)者的認(rèn)可。蟲草益腎方作為典型的中藥復(fù)方，同樣具有這一特點。雖然蟲草益腎方在延緩腎間質(zhì)纖維化的療效上已得到大量臨床研究和實驗研究的證實，但具體作用機制的研究尚屬于初始階段，仍需要進一步的研究與探討。