葛智超 李 燕，2 施文正 郎 蒙

(1. 上海海洋大學(xué)食品學(xué)院，上海 201306；2. 上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海 201306)

裸藻是古代原生動(dòng)物眼蟲的植物學(xué)名稱，其細(xì)胞含有葉綠體，可進(jìn)行光合作用，同時(shí)具有動(dòng)物與植物兩種特性。因無(wú)細(xì)胞壁，裸藻有高達(dá)93.1%的高效吸收率，可有效吸收營(yíng)養(yǎng)素。裸藻中含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分，如維生素、礦物營(yíng)養(yǎng)物、不飽和脂肪酸、多糖等。還具有清除有害膽固醇、重金屬，解決便秘、宿便的功能[1]。多糖具有抗癌、抗病毒、抗衰老、降血糖、降血脂、抑菌等功能，而有關(guān)裸藻多糖(Euglena Gracilis Polyccharides，EGPS)的研究報(bào)道較少。

目前，多糖的提取方法主要有傳統(tǒng)熱水提取法、堿提法、酸提法、超聲波提取法和酶工程提取法。傳統(tǒng)熱水提取法耗時(shí)、耗能且得率較低[2]，堿提法和酸提法容易斷裂多糖的糖苷鍵，導(dǎo)致結(jié)構(gòu)和活性改變[3]。利用超聲波的空化作用使細(xì)胞易于破碎，有助于多糖溶出，而酶工程技術(shù)可在較溫和的條件下分解組織，加速多糖的釋放和提取[4]。這兩種方法具有高效、節(jié)能等特點(diǎn)，已被廣泛用于動(dòng)植物有效成分的提取。試驗(yàn)擬以裸藻為原料，采用超聲波輔助酶解對(duì)裸藻多糖提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并分析其抗氧化活性，為裸藻多糖的進(jìn)一步開發(fā)利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

裸藻粉：德味生物科技(上海)有限公司；

枯草桿菌中性蛋白酶：酶活2.8×105U/g，上海源葉生物科技有限公司；

無(wú)水乙醇、三氯乙酸、重蒸酚、鐵氰化鉀、濃硫酸、三氯化鐵、菲啰嗪、L-抗壞血酸、過(guò)氧化氫、水楊酸等：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

抗超氧陰離子自由基試劑盒：南京建成生物科技研究所；

超濾杯、超濾膜：MSC300，上海摩速科學(xué)器材有限公司；

2，2-聯(lián)苯基-1-苦基肼基：純度>98%，美國(guó)Sigma公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

真空冷凍干燥箱：CHRIST ALPHA1-2型，北京博勱行儀器有限公司；

冷凍離心機(jī)：GL-20G-11型，上海安亭科學(xué)儀器廠；

紫外分光光度計(jì)：UV-2000型，北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；

超聲波處理器：FS-1200N型，上海生析超聲儀器有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RE-52AA型，上海亞榮生化儀器廠。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 超聲波輔助酶解提取工藝 取一定量的裸藻粉末，按料液比1∶40 (g/mL)加入pH 7的磷酸鹽緩沖溶液，在一定的超聲功率下處理相應(yīng)時(shí)間后加入中性蛋白酶，50 ℃下酶解一定時(shí)間，離心，取上清液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)后的濃縮液加入8倍體積的無(wú)水乙醇，靜置24 h，TCA法除蛋白，冷凍干燥得裸藻粗多糖。

1.2.2 裸藻多糖含量測(cè)定 采用苯酚—硫酸法[5]測(cè)定多糖含量，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為A=0.015 6c，R2=0.997 2。按式(1)計(jì)算裸藻多糖得率。

(1)

式中：

c——多糖質(zhì)量濃度，μg/mL；

V——總體積，mL；

n——稀釋倍數(shù)；

M——原料質(zhì)量，mg。

1.2.3 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

(1) 超聲功率：超聲時(shí)間25 min、中性蛋白酶添加量5%、酶解時(shí)間5 h，考察超聲功率(120，240，360，480，600 W)對(duì)裸藻多糖得率的影響。

(2) 超聲時(shí)間：超聲功率360 W、中性蛋白酶添加量5%、酶解時(shí)間5 h，考察超聲時(shí)間(5，15，25，35，45 min)對(duì)裸藻多糖得率的影響。

(3) 中性蛋白酶：超聲功率360 W、超聲時(shí)間25 min、酶解時(shí)間5 h，考察中性蛋白酶添加量(0%，1%，2%，3%，4%，5%)對(duì)裸藻多糖得率的影響。

(4) 酶解時(shí)間：超聲功率360 W、超聲時(shí)間25 min、中性蛋白酶添加量5%，考察酶解時(shí)間(2，3，4，5，6 h)對(duì)裸藻多糖得率的影響。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上根據(jù)SPSS顯著性差異分析(P<0.05)，以超聲時(shí)間、中性蛋白酶添加量、酶解時(shí)間為試驗(yàn)因素，以多糖得率為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)三因素三水平響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)化裸藻多糖提取工藝條件。

1.2.5 不同分子量段的裸藻多糖的制備 將裸藻粗多糖溶解，經(jīng)超濾分離得>10(EGPS-1)，5～10(EGPS-2)，3～5(EGPS-3) kDa 3個(gè)分子量段裸藻多糖溶液，冷凍干燥備用。

1.2.6 不同分子量段裸藻多糖的抗氧化分析

(1) 超氧陰離子自由基清除率的測(cè)定：參照抗超氧陰離子試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行測(cè)定[6]。

(2) DPPH自由基清除率的測(cè)定：參照Xie等[7]的方法。

(3) 羥基自由基清除率的測(cè)定：參照邵佳等[8]的方法。

(4) Fe2+螯合率的測(cè)定：參照萬(wàn)茜淋等[9]的方法。

(5) 還原力的測(cè)定：參照Sun等[10]的方法。

(6) 脂質(zhì)過(guò)氧化抑制率的測(cè)定：參照Khan等[11]的方法。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPASS 20對(duì)試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性差異分析(用不同字母表示)，單因素試驗(yàn)、抗氧化試驗(yàn)采用Origin 8.0作圖，響應(yīng)面優(yōu)化采用Design-Expert 8.0.6。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)

2.1.1 超聲功率 由圖1可知，多糖得率隨超聲功率的增強(qiáng)緩慢提高，當(dāng)超聲功率為360 W時(shí)，多糖得率達(dá)到3.08%，繼續(xù)增大超聲功率，多糖得率趨于平穩(wěn)。功率過(guò)大會(huì)使多糖的糖苷鍵斷裂，轉(zhuǎn)變?yōu)榭扇苡谝掖嫉膯翁?、寡糖或低聚糖，?dǎo)致醇沉過(guò)程中的多糖得率下降[12]。因此，最佳超聲功率為360 W。

2.1.2 超聲時(shí)間 由圖2可知，多糖得率在超聲5～15 min 內(nèi)顯著提升，隨后趨于平緩。超聲波作用時(shí)間太長(zhǎng)，空化效應(yīng)的作用力進(jìn)一步破壞提取物中部分多糖的糖鏈，導(dǎo)致醇沉過(guò)程中多糖得率下降[13]。故最佳超聲時(shí)間為15 min。

圖1 超聲功率對(duì)多糖得率的影響Figure 1 The effect of ultrasonic power on the yield of polysaccharide

圖2 超聲時(shí)間對(duì)多糖得率的影響Figure 2 The effect of ultrasonic time on the yield of polysaccharide

2.1.3 酶解時(shí)間 由圖3可知，多糖得率隨酶解時(shí)間的延長(zhǎng)(前3 h內(nèi))呈上升趨勢(shì)，表明與糖結(jié)合的蛋白質(zhì)逐步被水解，有利于多糖的釋放溶出[14]。而隨著酶解時(shí)間(3 h 后)的繼續(xù)延長(zhǎng)，中性蛋白酶活性逐步減弱，裸藻多糖得率提升不明顯，與葉洵璐等[14]的結(jié)論相似。故最佳酶解時(shí)間為3 h。

2.1.4 中性蛋白酶添加量 由圖4可知，多糖得率隨中性蛋白酶添加量的增加逐漸增大，當(dāng)中性蛋白酶添加量達(dá)3%后，多糖得率趨于平穩(wěn)，確定中性蛋白酶的最佳添加量為3%。

圖3 酶解時(shí)間對(duì)多糖得率的影響Figure 3 The effect of enzymatic hydrolysis time on the yield of polysaccharide

圖4 中性蛋白酶添加量對(duì)多糖得率的影響Figure 4 The effect of the amount of neutral protease on the yield of polysaccharide

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)

2.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果分析 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，以多糖得率為響應(yīng)值。根據(jù)Box-Benhnken中心組合原理進(jìn)行響應(yīng)面設(shè)計(jì)，試驗(yàn)因素水平表見表1，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2。

利用Design-Expert 8.0.6軟件對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行多元回歸擬合，得到以裸藻粗多糖得率(Y)為響應(yīng)值的二次多項(xiàng)回歸方程：

Y=3.66+0.16A+0.18B+0.24C+0.14AB-0.022AC+0.085BC-0.37A2-0.24B2-0.39C2。

(2)

表1 試驗(yàn)因素、水平及編碼Table 1 Experiment factors, levels and code

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 RSM design matrix and the responses

表3 多糖得率回歸模型系數(shù)的顯著性檢驗(yàn)?Table 3 Regression coefficient and ANOVA test of the yield of polysaccharide

2.2.2 試驗(yàn)因素間的交互作用 由圖5～7可知，酶解時(shí)間與中性蛋白酶添加量之間的相互作用顯著，其次為超聲時(shí)間與酶解時(shí)間的相互作用，最后是中性蛋白酶添加量與超聲時(shí)間。通過(guò)響應(yīng)面的陡峭程度[15]可以看出，超聲時(shí)間影響最大，酶解時(shí)間的影響大于中性蛋白酶添加量，與方差分析結(jié)果一致。

圖5 酶解時(shí)間與中性蛋白酶的交互作用對(duì)多糖得率的影響Figure 5 The effects of enzymatic hydrolysis time, neutral protease and its interaction on the yield of polysaccharide

圖6 超聲時(shí)間與中性蛋白酶添加量的交互作用對(duì)多糖得率的影響Figure 6 The effects of ultrasound time, addition of neutral protease and its interaction on the yield of polysaccharide

圖7 超聲時(shí)間與酶解時(shí)間的交互作用對(duì)多糖得率的影響Figure 7 The effects of ultrasound time, enzymatic hydrolysis time and its interaction on the yield of polysaccharide

2.2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 經(jīng)響應(yīng)面優(yōu)化法分析得到裸藻多糖的理論工藝條件為超聲時(shí)間18.57 min、中性蛋白酶添加量3.66%、酶解時(shí)間3.55 h，此條件下多糖得率的預(yù)測(cè)值為3.77%。為檢驗(yàn)響應(yīng)面結(jié)果的可靠性，對(duì)最優(yōu)工藝參數(shù)進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)(n=5)，根據(jù)實(shí)際操作情況，將驗(yàn)證條件修正為超聲時(shí)間19 min、中性蛋白酶添加量3.7%、酶解時(shí)間3.5 h，此時(shí)實(shí)測(cè)多糖得率為3.68%，與預(yù)測(cè)值相差0.09%，證明用所建模型預(yù)測(cè)裸藻多糖得率是準(zhǔn)確可行的。

2.3 不同分子量段裸藻多糖含量分析

超聲波輔助酶法制得的裸藻多糖粗提液經(jīng)超濾膜分離后，各組分中EGPS-1、EGPS-2、EGPS-3含量分別為42.07%，21.75%，26.67%。

2.4 裸藻多糖抗氧化分析

2.4.1 羥基自由基清除率 由圖8可知，裸藻多糖對(duì)羥基自由基的清除能力隨樣品濃度增大逐漸增長(zhǎng)[16]。EGPS-1、EGPS-2、EGPS-3分子量段的裸藻多糖達(dá)到IC50時(shí)的濃度分別為0.25，0.29，0.23 mg/mL，其中羥基自由基的清除效果相對(duì)較弱。高于陳藝煊EGPS-2對(duì)等[17-18]提取的小球藻多糖與羊棲菜多糖。

圖8 不同分子量段裸藻多糖對(duì)羥基自由基的清除效果Figure 8 The effect of different molecular weight euglena polysaccharides on hydroxyl radical scavenging

2.4.2 DPPH自由基清除率 由圖9可知，DPPH自由基清除率隨著VC的濃度增加逐漸上升，但試驗(yàn)3個(gè)組分均無(wú)DPPH自由基清除效果(清除率均為0)，對(duì)比桑葉多糖的DPPH自由基清除率較弱[19]，可能是由于兩者多糖的結(jié)構(gòu)不同所致。

圖9 不同分子量段裸藻多糖對(duì)DPPH自由基的清除效果Figure 9 The effect of different molecular weight euglena polysaccharides on DPPH-scavenging scavenging

2.4.3 超氧陰離子自由基清除率 由圖10可知，超氧陰離子清除率隨樣品濃度增加逐漸上升[22]，不同分子量段裸藻多糖在20 mg/mL后的清除率增長(zhǎng)緩慢。EGPS-3組分的超氧陰離子清除能力較強(qiáng)，且高于其余兩段，當(dāng)濃度為20 mg/mL時(shí)，EGPS-3的清除率達(dá)62.12%。高于劉洪超等[24]制備的羊棲菜多糖的，與殷玲等[22]制備的巢脾多糖的較為接近。

2.4.4 Fe2+螯合率 由圖11可知，裸藻多糖對(duì)Fe2+螯合能力隨樣品濃度的升高逐漸增強(qiáng)，當(dāng)濃度為0.1 mg/mL后其螯合能力上升趨緩。各個(gè)分子量段裸藻多糖對(duì)Fe2+螯合能力較接近，IC50為0.06～0.08 mg/mL，均高于相同濃度下的陽(yáng)性對(duì)照組及李正鵬等[20]研究的藍(lán)空地花菌多糖，說(shuō)明各分子量段對(duì)Fe2+的螯合能力較強(qiáng)。

圖10 不同分子量段裸藻多糖對(duì)超氧陰離子自由基的清除效果Figure 10 The effect of different molecular weight of euglena polysaccharides on superoxide anion removal

圖11 不同分子量段裸藻多糖對(duì)Fe2+的螯合能力Figure 11 The chelating ability of euglena polysaccharides with different molecular weights for Fe2+

2.4.5 還原力 由圖12可知，EGPS-1、EGPS-3在20 mg/mL 時(shí)的還原力分別達(dá)到0.593，0.699，隨著濃度的進(jìn)一步增加，還原力緩慢上升；EGPS-2在10 mg/mL時(shí)的還原力達(dá)0.170，隨后趨于平緩；還原力大小為EGPS-3>EGPS-1>EGPS-2。張寧等[21]研究的黑木耳分級(jí)多糖在20 mg/mL時(shí)的還原力達(dá)到最大值(1.023)，高于試驗(yàn)結(jié)果。

圖12 不同分子量段裸藻多糖的還原力Figure 12 The reducing power of different molecular weight euglena polysaccharides

2.4.6 脂質(zhì)過(guò)氧化抑制率 由圖13可知，脂質(zhì)過(guò)氧化抑制率隨樣品濃度的增加逐漸上升，不同分子量段裸藻多糖在30 mg/mL時(shí)的抑制率達(dá)到較大值后趨于平穩(wěn)。EGPS-1、EGPS-3的IC50分別為28.27，29.90 mg/mL，而EGPS-2的脂質(zhì)過(guò)氧化抑制率較弱，在所選范圍內(nèi)并未達(dá)到50%。當(dāng)濃度為40 mg/mL時(shí)，EGPS-1、EGPS-2、EGPS-3的脂質(zhì)過(guò)氧化抑制率分別為59.08%，32.09%，58.01%，低于張寧等[22]研究的黑木耳多糖。

圖13 不同分子量段裸藻多糖對(duì)脂質(zhì)過(guò)氧化的抑制效果Figure 13 The effect of different molecular weight of euglena polysaccharides on lipid peroxidation

3 結(jié)論

裸藻多糖的最佳提取工藝為超聲時(shí)間19 min，中性蛋白酶添加量3.7%，酶解時(shí)間3.5 h，該條件下的多糖得率為3.68%。通過(guò)超濾將裸藻多糖分離成3個(gè)不同分子量段裸藻多糖，并對(duì)其進(jìn)行體外抗氧化試驗(yàn)，得出分子量為3～5 kDa的裸藻多糖的綜合抗氧化效果較好，其對(duì)Fe2+螯合率、羥基自由基清除能力、還原力、超氧陰離子自由基清除能力的效果最佳，各分子量段對(duì)DPPH自由基均無(wú)清除效果。后續(xù)可通過(guò)膜分離、色譜等方法對(duì)裸藻多糖進(jìn)行進(jìn)一步純化及結(jié)構(gòu)鑒定。