印伯星 石俊康 孔令慧 楊仁琴 艾連中 熊智強(qiáng)

(1. 揚(yáng)州大學(xué)實(shí)驗(yàn)農(nóng)牧場，江蘇 揚(yáng)州 225009；2. 江蘇省乳業(yè)生物工程技術(shù)研究中心，江蘇 揚(yáng)州 225004；3. 揚(yáng)州市揚(yáng)大康源乳業(yè)有限公司，江蘇 揚(yáng)州 225004；4. 上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093；5. 上海食品微生物工程研究中心，上海 200093)

高膽固醇被認(rèn)為是引起冠心病、高血壓及腦中風(fēng)的重要因素[1]。膽鹽水解酶(bile salt hydrolase, BSH)是一種重要的降解膽固醇酶，能夠結(jié)合膽鹽釋放游離氨基酸和非結(jié)合態(tài)膽酸，由于游離膽酸的重吸收利用率低，從而達(dá)到降低體內(nèi)膽固醇的效果[2-3]。目前，從雙歧桿菌、乳桿菌和球菌等乳酸菌屬中發(fā)現(xiàn)的BSH基因具有降膽固醇和耐受膽鹽功能[4]。Smet等[5-6]研究表明發(fā)酵乳桿菌(Lactobacillusfermentum)能降低血清膽固醇的重要原因是能夠產(chǎn)生BSH?；诨蚪M學(xué)研究[7-8]發(fā)現(xiàn)不同乳酸菌中含有1～4個(gè)編碼膽鹽水解酶的BSH基因，分散在基因組不同位置上，其氨基酸相似度較低，僅為21%～39%。Lambert等[9]通過分別敲除植物乳桿菌WCFS1中的4個(gè)BSH同源基因，發(fā)現(xiàn)僅BSH1基因和植物乳桿菌的BSH活性密切相關(guān)，而其他3種BSH在植物乳桿菌不同菌株之間十分保守；Xiong等[10]從耐膽鹽能力強(qiáng)的植物乳桿菌AR113中克隆4個(gè)BSH基因，在干酪乳桿菌中異源表達(dá)，證明4種BSH均有水解結(jié)合甘氨酸膽鹽的能力。

發(fā)酵乳桿菌作為一種異型發(fā)酵乳酸菌，在食品工業(yè)中廣泛應(yīng)用。作為益生菌，發(fā)酵乳桿菌能減少由致病菌引起的胃腸道疾病發(fā)病率、調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)和降低患膀胱癌的風(fēng)險(xiǎn)[11-12]。由于胃腸道在運(yùn)輸過程中面臨膽汁酸壓力，因此迫切需要提升發(fā)酵乳桿菌的耐受性。盡管發(fā)酵乳桿菌中含有一個(gè)BSH基因，但發(fā)酵乳桿菌對膽鹽的脅迫仍比較敏感。課題組前期[13]分離出一株具有優(yōu)良生物學(xué)特性的發(fā)酵乳桿菌AR497，能有效改善小鼠腸炎。為提高該菌株耐膽汁和降膽固醇的益生功能，試驗(yàn)擬以AR497為宿主，表達(dá)來自植物乳桿菌AR113的4種BSH基因，從膽鹽脅迫下菌株的生長狀況、致死率和BSH酶活角度分析BSH基因異源表達(dá)的作用，為開發(fā)耐膽鹽和降解膽固醇的乳酸菌基因工程菌提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株和質(zhì)粒

所用菌株與質(zhì)粒如表1所示。

表1 菌株與質(zhì)粒Table 1 Bacterial strains and plasmids

1.1.2 試劑

質(zhì)粒提取試劑盒：美國Axygen公司；

MRS培養(yǎng)基(牛肉膏5 g/L、酪蛋白胨10 g/L、酵母膏5 g/L、葡萄糖20 g/L、乙酸鈉8.3 g/L、檸檬酸氫二胺2 g/L、K2HPO42 g/L、MgSO40.58 g/L、MnSO40.25 g/L、吐溫80 1 mL/L、固體培養(yǎng)基另加瓊脂粉15 g/L)：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

MRSMC復(fù)蘇培養(yǎng)基(0.8 mol/L山梨醇、20 mmol/L MgCl2、2 mmol/L CaCl2、MRS培養(yǎng)基)：分析純，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.1.3 儀器與設(shè)備

分光光度計(jì)：DΜ-800型，德國Beckman公司；

電轉(zhuǎn)化杯：2.0 mm型，美國BTX公司；

超微量核算蛋白測定儀：Nanodrop 2000型，賽默飛世爾科技公司；

厭氧培養(yǎng)箱：DG250型，英國Ruskinn公司；

電泳儀：Powerpacbasic型，美國Bio-Rad公司；

電泳槽：170-4486型，美國Bio-Rad公司；

凝膠成像儀：GelDocXR型，美國Bio-Rad公司；

PCR儀：S1000型，美國Bio-Rad公司；

冷凍離心機(jī)：3K30型，德國Sigma公司。

1.2 方法

1.2.1 發(fā)酵乳桿菌AR497感受態(tài)制備和重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化

將-80 ℃冰箱保存的AR497菌株進(jìn)行活化培養(yǎng)，然后接種至含20 g/L甘氨酸的MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)至OD600 mm為0.3～0.4。收集菌體用10%甘油(體積分?jǐn)?shù))洗滌兩次并重懸分裝，-80 ℃保藏，電轉(zhuǎn)化備用。從大腸桿菌中提取pMG36e(空質(zhì)粒，對照)和含有不同BSH基因的重組質(zhì)粒pMG-BSH1、pMG-BSH2、pMG-BSH3、pMG-BSH4和pMG-BSH1-3，將這些質(zhì)粒分別與感受態(tài)細(xì)胞混勻，電擊后加入MRSMC復(fù)蘇培養(yǎng)基，37 ℃下培養(yǎng)4 h，收集菌體涂布于紅霉素抗性平板，37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h。挑取轉(zhuǎn)化子進(jìn)行菌落PCR鑒定，采用Em-F(5’-CGAAAAACAAGTTAAGGGATGCA-3’)/Em-R(5’-TCAGCACAGTTCATTATCAACCAAA-3’)引物，擴(kuò)增條件為95 ℃預(yù)變性3 min，98 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物通過瓊脂糖凝膠電泳鑒定。

1.2.2 平板Ca2+沉淀法檢測 配制含有0.37 g/L CaCl2的MRS固體培養(yǎng)基平板，加入終濃度5 mmol/L膽鹽和100 μg/mL紅霉素。取OD600 mm≈1.0的重組菌株菌液10 μL點(diǎn)涂于上述固體培養(yǎng)基平板上，每株菌3個(gè)平行。37 ℃厭氧培養(yǎng)48 h，觀察培養(yǎng)基底部或菌落周圍是否有白色沉淀圈產(chǎn)生。

1.2.3 重組菌株在膽鹽脅迫下的生長 將重組菌株培養(yǎng)至OD600 mm≈1.0，3%接種量接種至含有100 μg/mL紅霉素和0.0，0.5，1.0，1.5，2.0 mg/mL甘氨脫氧膽酸鈉鹽的MRS培養(yǎng)基中，檢測20 h內(nèi)菌株生長狀況[14]。

1.2.4 重組菌株耐膽鹽能力的測定 將重組菌株接種至含有100 μg/mL紅霉素和0.0，0.5，1.0，1.5，2.0 mg/mL甘氨脫氧膽酸鈉鹽的MRS培養(yǎng)基中，培養(yǎng)12 h進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)。按式(1)計(jì)算致死率。

(1)

式中：

c——致死率，%；

m1——相應(yīng)膽鹽濃度下活菌數(shù)；

m2——普通MRS培養(yǎng)下活菌數(shù)。

1.2.5 BSH酶活的測定 通過水解結(jié)合膽鹽釋放的氨基酸量來衡量，即酶活力與氨基酸生成量呈正比。采用茚三酮顯色法測定氨基酸含量[15-16]。樣品超聲破碎(200 W 破碎20 min，工作5 s，間隔10 s)后加入溶菌酶，使細(xì)胞壁裂解完全，參照文獻(xiàn)[17]的方法測定上清液BSH活力。BSH酶活定義為每毫升菌體裂解上清液水解膽鹽生成1 mmol氨基酸為一個(gè)活力單位。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用 Origin 8.0和GraphPad 5.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和作圖。

2 結(jié)果與討論

2.1 發(fā)酵乳桿菌BSH基因工程菌的鑒定

轉(zhuǎn)化子菌落PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析(圖1)表明，含有重組質(zhì)粒的菌株都有734 bp的特異性條帶，且與預(yù)期大小一致，而不含重組質(zhì)粒的AR497沒有條帶，說明重組質(zhì)粒均已成功轉(zhuǎn)化至AR497中。

M. 2 000 Marker 1. 陰性對照 2. AR497/pMG36e 3. AR497/pMG-BSH1 4. AR497/pMG-BSH2 5. AR497/pMG-BSH3 6. AR497/pMG-BSH4 7. AR497/pMG-BSH1-3圖1 轉(zhuǎn)化子菌落PCR電泳Figure 1 Electrophoretogram of colony PCR

2.2 平板Ca2+沉淀法檢測發(fā)酵乳桿菌BSH基因工程菌

由圖2可知，除表達(dá)BSH2的重組菌外，其他工程菌均無法在添加5 mmol/L甘氨脫氧膽酸鈉鹽的MRS培養(yǎng)基上生長；表達(dá)BSH2的重組菌周圍產(chǎn)生不透明白色沉淀圈，說明該重組菌株具有降解甘氨脫氧膽酸鈉鹽的能力[10]?？蛰d體菌株與重組菌株都可以在含有5 mmol/L?；蛆Z脫氧膽酸鈉鹽的MRS固體培養(yǎng)基上生長，說明AR497具有良好的?；蛆Z脫氧膽酸鈉鹽耐受能力。在含有5 mmol/L?；蛆Z脫氧膽酸鈉鹽和甘氨脫氧膽酸鈉鹽的MRS固體培養(yǎng)基上，除空載體與BSH4表達(dá)菌株生長受到完全抑制外，其他菌株在該平板上均有生長，但表達(dá)BSH2或同時(shí)表達(dá)BSH1和BSH3菌株其耐受性明顯優(yōu)于表達(dá)BSH1或BSH3菌株。此外，含?；蛆Z脫氧膽酸鈉鹽的平板無明顯白色沉淀圈形成，說明其BSH酶活偏低或不具有水解?；蛆Z脫氧膽酸鈉鹽的能力。

圖2 Ca2+沉淀法檢測重組菌的耐膽鹽能力Figure 2 Bilesalt resistance of recombinant bacteria bycalcium ion precipitation method

2.3 發(fā)酵乳桿菌BSH基因工程菌在膽鹽脅迫下的生長

由圖3可知，在沒有膽鹽壓力下，與對照菌株AR479/pMG36e相比，表達(dá)BSH基因重組菌株可顯著提高發(fā)酵乳桿菌AR497的膽鹽耐受性，BSH2和BSH4基因的表達(dá)對菌株生長具有一定的抑制作用，BSH1和BSH3基因的表達(dá)對菌株生長有促進(jìn)作用。重組菌株在0.5 mg/mL膽鹽的MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)時(shí)，與不加膽鹽相比，重組菌株生長受到一定程度的抑制。重組菌株的生長隨甘氨脫氧膽酸鈉鹽濃度的提高受到明顯抑制，但BSH2基因的表達(dá)對菌株表現(xiàn)出優(yōu)良的耐膽鹽特性；當(dāng)膽鹽濃度提高到1.5 mg/mL時(shí)，在液體MRS培養(yǎng)基中，除表達(dá)BSH2重組菌株外，其他重組菌株均無法生長。綜上，異源表達(dá)植物乳桿菌來源的BSH能夠提高發(fā)酵乳桿菌的耐膽鹽能力。

圖3 重組菌株在不同甘氨脫氧膽酸鈉鹽濃度下的生長曲線Figure 3 Growth curve of recombinant strains under different glycodeoxycholic acid sodium salt

2.4 發(fā)酵乳桿菌BSH基因工程菌的耐膽鹽能力

由圖4可知，隨著甘氨脫氧膽酸鈉鹽濃度的增加，表達(dá)BSH2重組菌活菌總數(shù)并未減少，表明BSH2基因的表達(dá)可提高AR479的耐受膽鹽能力；表達(dá)BSH1、BSH3、BSH4及同時(shí)表達(dá)BSH1和BSH3基因的重組菌株致死率逐漸升高，BSH基因?qū)Πl(fā)酵乳桿菌提高膽鹽耐受效果依次為BSH2>BSH1和BSH3>BSH1>BSH3>BSH4，其中過表達(dá)BSH4基因與對照相比，效果不顯著(P>0.05)。

2.5 發(fā)酵乳桿菌BSH基因工程菌BSH酶活

由圖5可知，表達(dá)BSH2基因重組菌株酶活最高，達(dá)57.74 U/mL，為對照菌株酶活的2.88倍，推測BSH2基因可能在水解結(jié)合型甘氨類膽鹽為非結(jié)合型膽鹽過程中效果更強(qiáng)，與前述試驗(yàn)結(jié)果相符；而表達(dá)BSH1和BSH3、BSH1、BSH3及BSH4基因重組菌株的酶活依次降低。Ren等[18-19]在大腸桿菌中表達(dá)植物乳桿菌ST-III的4種BSH基因，其酶活數(shù)據(jù)與試驗(yàn)結(jié)果類似。Lambert等[9]在乳酸乳球菌中表達(dá)植物乳桿菌WCSF1的4種BSH基因，其中BSH1基因的活性最高，與試驗(yàn)結(jié)果不同，可能與宿主或酶活測定方法(如反應(yīng)條件和膽鹽底物)不同有關(guān)[20]。

圖4 重組菌株的膽鹽致死率Figure 4 Lethality of recombinant strains bybile salt

小寫字母不同表示差異顯著(P<0.05)

3 結(jié)論

將具有強(qiáng)耐膽鹽能力的植物乳桿菌AR113中4種BSH同功酶基因通過基因工程技術(shù)，在發(fā)酵乳桿菌AR497中異源表達(dá)。通過測定不同BSH基因表達(dá)菌株的生長、膽鹽耐受性和酶活，發(fā)現(xiàn)重組菌株均能在0.5 mg/mL 甘氨脫氧膽酸鈉鹽的脅迫下生長，僅AR497/pMG-BSH2能夠?qū)⒔Y(jié)合態(tài)甘氨脫氧膽酸鈉鹽為轉(zhuǎn)化為游離態(tài)；BSH2重組菌株的BSH酶活最高，達(dá)57.74 U/mL，表明BSH2可能具有較其他3種BSH更高的水解甘氨脫氧膽酸鈉鹽的能力。后續(xù)可進(jìn)一步研究4種BSH同功酶的動(dòng)力學(xué)和蛋白結(jié)構(gòu)特征，解析BSH2對甘氨脫氧膽酸鈉鹽的水解機(jī)制。