岳 霞，白雨禾，王昭懿，宋 平

鹽脅迫下玉米種子萌發(fā)過程低場核磁共振研究

岳 霞，白雨禾，王昭懿，宋 平※

（1. 沈陽農(nóng)業(yè)大學信息與電氣工程學院，沈陽 110866；2. 遼寧省農(nóng)業(yè)信息化工程技術(shù)研究中心，沈陽 110161）

為探究鹽脅迫對玉米種子萌發(fā)過程中水分的分布和種子活性的影響，以非糯性玉米鄭單958種子為檢測對象，對不同NaCl濃度（0、50、100、150、200 nmol/L）環(huán)境下試驗樣本進行低場核磁共振成像以及核磁共振波譜試驗。結(jié)果表明：玉米萌發(fā)過程中，胚乳和胚部位的含水率均在0～2 d迅速增加，2 d之后胚乳水分波動增長，而胚部位水分則出現(xiàn)水平波動的現(xiàn)象。隨著鹽脅迫程度上升，種子發(fā)芽率從90%降至0，鹽濃度在50 nmol/L及以下時，不同相態(tài)水信號幅值變化趨勢受鹽脅迫影響較小，達到100 nmol/L時自由水信號幅值被抑制在低水平，達到150 nmol/L時結(jié)合水和半結(jié)合水信號幅值的變化速率均被大幅延緩。2弛豫譜圖中結(jié)合水主峰左側(cè)出現(xiàn)信號微弱且弛豫時間為0.1～1 ms的副峰，副峰的出現(xiàn)和玉米種子發(fā)芽密切關(guān)聯(lián)，是一種標志著種子發(fā)芽的結(jié)合水。試驗結(jié)果為玉米種子萌發(fā)過程對鹽堿脅迫的反應(yīng)機制后續(xù)研究提供理論支持和數(shù)據(jù)參考。

種子；水分；鹽脅迫；玉米萌發(fā)；低場核磁共振技術(shù)；核磁共振圖像

0 引 言

鹽漬化是土地惡化的一種現(xiàn)象，也是限制當前農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的主要環(huán)境因子。各類鹽漬土分布在100余個國家，類型包括原生鹽漬土、次生鹽漬土和灌區(qū)鹽漬土[1]。中國耕地中鹽漬化面積達920.9×104hm2，占全國耕地面積的6.62%，其中西部六省區(qū)（陜、甘、寧、青、蒙、新）鹽漬土面積占全國的69.03%[2]。

玉米是重要的糧食作物，為飼料和糧食兼用，對于土壤和氣候的適應(yīng)性較強[3]。玉米耐鹽能力存在臨界值[4]，低濃度的鹽對玉米萌發(fā)生長具有促進作用，但濃度過高對其有毒害作用[5]，即高濃度的Na+和Cl-對玉米造成萌發(fā)期的滲透脅迫和植株發(fā)育階段的離子毒害[6]。

玉米萌發(fā)過程中，水分變化影響淀粉和蛋白質(zhì)等生物大分子的活力，大分子的水合狀態(tài)進一步影響酶的活性[7]。目前低場核磁共振技術(shù)（LF-NMR，LowFieldNuclearMagneticResonance）已廣泛應(yīng)用于研究食品與作物內(nèi)部水分相態(tài)、分布和遷移等，LF-NMR以氫核為檢測對象、永磁體強度小于0.2 T，相比于傳統(tǒng)檢測手段，具有非破壞性、取樣量精準、能夠保持樣品完整性等優(yōu)點。目前國內(nèi)外學者利用LF-NMR進行了食品加工以及存儲過程的監(jiān)測、摻假鑒定[8-13]，頁巖資源油氣開發(fā)[14]，植物種子和水果的無損檢測[15-16]。研究鹽脅迫對玉米種子影響的傳統(tǒng)方法多基于室內(nèi)砂培及大田試驗，監(jiān)測種子的發(fā)芽指數(shù)和質(zhì)量變化[17]，更多注重種子外在的宏觀特征表達[18]，宋平等[19]通過低場核磁共振技術(shù)手段，對不同萌發(fā)時間和不同溫度下玉米種子進行水分分布和流動規(guī)律的探究，本文進一步探討鹽脅迫對玉米種子萌發(fā)過程中水分的分布和種子活性的影響。

本試驗通過人工模擬自然環(huán)境下的鹽脅迫環(huán)境，劃分4個濃度梯度的NaCl溶液，與對照組的種子樣本進行統(tǒng)一培養(yǎng)萌發(fā)，從種子內(nèi)部水分變化的角度分析不同濃度NaCl溶液對種子吸脹、萌動、發(fā)芽3個階段的影響，以期為后續(xù)研究玉米種子萌發(fā)對鹽堿脅迫的響應(yīng)機制提供更多的理論基礎(chǔ)支持和數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)備與材料

儀器設(shè)備：Sartorius BSA124S-CW分析天平（最大稱量：120 g，賽多利斯工業(yè)稱重設(shè)備北京有限公司）；MGC-1500HP-2人工氣候箱（控溫范圍：有光照10～50 ℃，光照強度：0～40 000 lx，光照方式：隔板式，上海一恒科學儀器有限公司）；MiniMR-60核磁共振儀（磁體類型：永磁體，磁場強度：（0.5±0.05）T，射頻脈沖頻率：12.2 MHz，磁體溫度：32 ℃，探頭線圈直徑：15 mm，上海紐邁電子科技有限公司）；另玻璃試管、發(fā)芽紙、錐形瓶、雙頭不銹鋼藥匙、圓形培養(yǎng)皿、方形培養(yǎng)盒、鑷子、滴定管若干。

化學試劑：NaCl固體、次氯酸鈉（NaOCl）溶液、蒸餾水。

試驗對象：玉米種子（非糯性玉米鄭單958，種子粗蛋白質(zhì)量分數(shù)9.33%，粗脂肪3.98%，粗淀粉73.02%，呈半馬齒狀，發(fā)芽率88%～90%）。

鹽濃度梯度劃分為5組，對照組樣本采用蒸餾水培養(yǎng)（NaCl濃度為0），4組試驗組采用濃度由低到高，分別為50、100、150、200 nmol/L的NaCl溶液培養(yǎng)樣本。

1.2 試驗方法

1.2.1 樣品制備處理

探究鹽脅迫對玉米種子萌發(fā)的影響試驗整體分為3部分，包括種子萌發(fā)指標檢測試驗，核磁共振波譜試驗和核磁共振成像（MRI，Magnetic Resonance Imaging）試驗。

核磁共振波譜試驗采集樣本核磁信號時采用CPMG（Carr-Purcell-Meiboom-Gillsequence）脈沖序列，通過反演信號數(shù)據(jù)，得到2弛豫譜圖；核磁共振成像試驗?zāi)康氖遣杉|(zhì)子密度加權(quán)圖像。試驗分組和檢測具體內(nèi)容如下：

1）核磁共振波譜試驗，挑選籽粒均勻、飽滿的鄭單玉米種子共90粒，每組18粒，共5組。

2）MRI試驗，取種子15粒，每組3粒，共5組。

3）標準發(fā)芽指標檢測試驗，取250粒種子，每組50粒，共5組，置于圓形培養(yǎng)皿中。

以上3個部分試驗的樣本均被劃分為5組，分別置于對照組和50、100、150、200 nmol/L的NaCl溶液環(huán)境下培養(yǎng)。

進行標準發(fā)芽試驗的玉米種子需測得其胚芽與胚根長度，具體方法為：第6 天時，測量胚芽基部到頂部的距離，計算已發(fā)芽種子的平均胚芽長度。測量胚芽基部到頂部的距離，計算已發(fā)芽種子的平均根長。計算種子的發(fā)芽勢（GE，Germination Potential）、發(fā)芽率（GR，Germination Rate）及發(fā)芽指數(shù)（GI，Germination Index），具體公式如下所示：

發(fā)芽勢=第4天內(nèi)發(fā)芽種子/50×100%（1）

發(fā)芽率=總發(fā)芽數(shù)/50×100 %（2）

發(fā)芽指數(shù)=∑/%（3）

式中為第天種子發(fā)芽數(shù)；為對應(yīng)發(fā)芽的天數(shù)。

試驗前先配置質(zhì)量分數(shù)3%的NaOCl溶液，對種子做消毒處理，浸泡試驗樣本3 min，然后用蒸餾水沖洗3～5次，并用吸水紙吸干表面水分，均勻放置于鋪有濾紙的培養(yǎng)盒中，分別用等量的蒸餾水和50、100、150、200 nmol/L的NaCl溶液對種子進行培養(yǎng)，以浸濕濾紙和種子為宜，將5組樣本（核磁共振信號每個梯度下設(shè)置18個平行樣本，核磁成像每個梯度下設(shè)置3個平行樣本）置于溫度為（28±1）℃、相對濕度80%的人工氣候箱中培養(yǎng)，為排除缺乏光照可能對種子萌發(fā)產(chǎn)生的影響，設(shè)置12 h光照和12 h無光照交替的模擬自然環(huán)境，每隔24 h對每個核磁波譜信號樣本重復采樣4次，并測定其質(zhì)量，每個核磁成像樣本采樣1次，試驗總時長為6 d。

1.2.2 核磁共振波譜試驗

首先進行FID（Free Induction Decay）脈沖試驗，利用標準油樣尋找核磁共振的中心頻率及脈沖寬度，參考宋平等試驗結(jié)果[19]，CPMG脈沖序列的主要參數(shù)設(shè)置如下：重復采樣次數(shù)NS=16，硬脈沖90o脈寬P1=17.52s，重復采樣等待時間TW=2 000 ms，后段180o脈寬NECH=6 000，射頻信號頻率偏移量O1每次設(shè)置存在偏差。

對于核磁共振波譜試驗的樣品，將5組試驗樣本的玉米種子裝入玻璃試管，置于試管底端，將試管豎直放入低場核磁共振儀線圈中央，利用CPMG脈沖序列采集核磁共振信號，獲取萌發(fā)初始狀態(tài)（干種子狀態(tài)，記做0），1～6 d（萌發(fā)階段）的試驗數(shù)據(jù)。將采集到的重復數(shù)據(jù)導入核磁共振反演軟件，用同時迭代重建算法（SIRT，Simultaneous Iterative Reconstruction Technique）進行反演運算。參考以往試驗結(jié)果[20]，反演軟件主要參數(shù)設(shè)定如下：分組形式為多分組，反演參數(shù)為2弛豫時間，開始時間為0.01 ms，迭代次數(shù)為100 000，截止時間為10 000 ms，參與反演點數(shù)為200個。

1.2.3 核磁共振成像試驗（MRI試驗）

得到2弛豫譜之后，繼續(xù)進行核磁共振成像試驗。核磁共振成像采用多層自旋回波（MSE，Multi-slice Spin Echo）脈沖序列，對樣本冠狀面（縱向）進行掃描。參數(shù)設(shè)置為：90o軟脈沖回波時間TE=5.885 ms，重復采樣等待時間TR=300 ms，每次成像時間為30 min。

1.3 數(shù)據(jù)處理

將反演得到的2弛豫譜數(shù)據(jù)導入SPSS軟件，進行質(zhì)量歸一化處理，再計算每個樣本歸一化處理之后的弛豫譜數(shù)據(jù)均值，將均值作為試驗樣本的核磁信號幅值，導入Origin2018軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同NaCl濃度對種子萌發(fā)的影響

玉米種子發(fā)芽指數(shù)統(tǒng)計結(jié)果，如表1所示。在鹽脅迫和對照組的培養(yǎng)條件下，玉米種子萌發(fā)期的外在特征出現(xiàn)差異：對照組最終發(fā)芽率達到90%，平均根長和芽長分別達到0.678 cm和0.309 cm。隨著鹽濃度的增加，種子的萌發(fā)率、發(fā)芽指數(shù)、發(fā)芽勢不斷下降。外源NaCl脅迫對根和芽的生長造成明顯脅迫。當NaCl濃度達到200 nmol/L時，種子樣本不發(fā)芽，發(fā)芽率和平均根長、平均芽長下降到0。

表1 鹽脅迫對種子發(fā)芽指標的影響

2.2 圖像分析

2.2.1 感興趣區(qū)域平均灰度值統(tǒng)計

對核磁共振質(zhì)子密度圖像先進行統(tǒng)一映射得到灰度圖，再提取感興趣區(qū)域（Region of Interest，ROI）的平均灰度值，ROI區(qū)域包括胚和胚乳兩部分，如圖1所示?；叶葓D中某區(qū)域越亮越白，表示灰度值越大，整體含水率越大、活性越強，反之整體含水率越小且活性越弱[21]。因此灰度值也可以表示種子整體或者局部含水率。

玉米種子萌發(fā)過程中胚部位、胚乳灰度值即含水率變化如圖2所示。胚部位的平均灰度值在種子吸脹階段（0～2 d）迅速增加，在2 d之后增速下降；胚乳水分在2 d之后出現(xiàn)波動增長的趨勢，而胚部位水分則出現(xiàn)水平波動的現(xiàn)象。此外，0、50、100 nmol/L 3組，胚和胚乳的平均灰度值比值的變化趨勢為先增加后減少，在1 d達到峰值，而150、200 nmol/L兩組比值在0～2 d遞減，2 d后分別出現(xiàn)波動遞減和水平波動的現(xiàn)象。

圖1 玉米種子胚乳和胚感興趣ROI區(qū)域

圖2 玉米種子胚乳和胚部位ROI區(qū)域平均灰度值

2.2.2 偽彩圖像分析

對質(zhì)子密度圖像進行偽彩處理，可以直觀看到種子內(nèi)部水分變化。種子的核磁共振信號主要來源于種子內(nèi)部水分的氫質(zhì)子，紅色（高亮度）代表該區(qū)域氫質(zhì)子密度大、含水率高，藍色（低亮度）說明該區(qū)域氫質(zhì)子密度小、含水率低[22]。圖像的亮度反映種子萌發(fā)過程中氫質(zhì)子密度，可推斷水分遷移和分布[23]。玉米種子萌發(fā)涉及一系列的生化反應(yīng)和形態(tài)改變，并受到周圍環(huán)境條件的影響。根據(jù)一般規(guī)律，玉米種子萌發(fā)過程可以分為3個主要階段：吸脹階段、萌動階段、發(fā)芽階段[24]。

圖3是不同濃度NaCl處理下鄭單958種子萌發(fā)過程中0、1、2、3、4、5、6 d時偽彩圖。初始時，各組種子胚部位亮度明顯高于胚乳，這是因為干種子休眠期生理反應(yīng)微弱，胚乳中主要貯藏淀粉，而胚中蛋白質(zhì)和脂肪含量較高，各部分組織堅實緊密，細胞內(nèi)物質(zhì)呈干燥的凝膠狀態(tài)，因而胚比胚乳中的氫質(zhì)子密度大。由于人工放置樣品，種子縱面會和機器磁場角度產(chǎn)生偏差，導致圖像出現(xiàn)一定偏差；但是質(zhì)子密度分布圖中，胚部位的紅色時有時無，最主要的原因是種子的發(fā)育過程中，生長細胞持續(xù)增生需要大量營養(yǎng)物質(zhì)，在圖2b中表現(xiàn)為灰度平均值“水平波動”。對于對照組1～2 d的圖像，可以看出，種子體積逐漸增大，各部位亮度驟然升高，胚乳部位水分面積擴大，其亮度呈現(xiàn)出由胚邊緣向種皮遞減的趨勢，這是因為種子胚乳中的淀粉粒等物質(zhì)吸水膨脹，直到細胞內(nèi)部的水分達到一定的飽和程度，這也可以解釋胚乳和胚灰度平均值比值在1 d達到峰值后逐漸下降。高濃度NaCl溶液對種子照成的影響首先是阻礙種子的吸脹。

對照組經(jīng)過3 d的培養(yǎng)，種子普遍開始萌動，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)上俗稱為露白。3 d圖像中顯示為各部位亮度繼續(xù)升高，胚根尖端突破種皮向外延展。此時吸水暫時停滯，酶開始活動，種子內(nèi)部代謝加強，胚乳中的淀粉粒等營養(yǎng)物質(zhì)被分解成葡萄糖等可溶性物質(zhì)，同時種胚吸收這些被分解的物質(zhì)，從休眠狀態(tài)恢復的細胞器活性提高，種胚細胞恢復生長[25]。

4 d后，對照組試驗樣本開始長出胚芽，胚根繼續(xù)生長，種子進入發(fā)芽階段，種胚細胞開始或加速分裂和分化，種胚的新陳代謝極為旺盛，在圖像中顯示為種胚部位水分面積持續(xù)擴大，亮度高。

對于50～200 nmol/L組，3 d之后的圖像變化明顯遲緩，隨著NaCl溶液濃度上升，鹽脅迫對種子的露白以及根和芽的生長的抑制作用增強，這可能是因為鹽分抑制了種子中淀粉酶的活性，阻礙淀粉轉(zhuǎn)化為蔗糖和可溶性糖[26]。

注：偽彩值越大說明樣品中氫質(zhì)子密度越大。

2.3 鹽脅迫對不同相態(tài)水的影響

雖然圖像可直觀展示種子萌發(fā)過程，但是還需要更精準的數(shù)據(jù)支撐。核磁共振2弛豫譜反映了水分子的動力學特性。一般地，與淀粉或蛋白質(zhì)等生物大分子緊密結(jié)合的水分具有極短的橫向弛豫時間，而細胞內(nèi)液泡以及維管束導管中的游離水分則具有較長的橫向弛豫時間。核磁共振2弛豫譜信號幅值與活體組織的水分質(zhì)量成正比[27-28]。活體植物器官內(nèi)不同相態(tài)的水分的核磁共振2弛豫譜特性差異較大，表現(xiàn)為2弛豫譜的多組分特征[29]。

分析玉米萌發(fā)不同階段的核磁共振2弛豫譜，發(fā)現(xiàn)2弛豫時間主要分布范圍為1～10 000 ms，所有試驗對象的2弛豫譜均有3個明顯的主峰，從左到右依次代表結(jié)合水（0.1 ms <21<10 ms）、半結(jié)合水（10 ms <2< 100 ms）和自由水（100 ms <22<1 000 ms），以及1個在結(jié)合水左側(cè)的副峰（0.1ms <23<1 ms），副峰代表游離性比結(jié)合水弱的水。核磁共振2弛豫譜峰面積（無量綱單位）與樣品中氫質(zhì)子的數(shù)量成正比，2弛豫譜中各個峰面積也可以反映各相態(tài)水分的含量，代表總水分含量，21為結(jié)合水，22為半結(jié)合水，23為自由水，則有=21+22+23。不同鹽脅迫處理下鄭單958玉米種子2弛豫譜，如圖4所示，種子總體活性增強，表現(xiàn)為2弛豫譜峰后移。不同處理下玉米種子單位質(zhì)量2峰面積數(shù)據(jù)統(tǒng)計，如表2所示。

圖4 不同處理下鄭單958玉米種子反演譜（弛豫譜）

2.3.1 鹽脅迫對結(jié)合水的影響

通過分析表2，發(fā)現(xiàn)在0～2 d的吸脹階段，隨著鹽濃度的增加，結(jié)合水的增速隨著鹽濃度增加依次遞減，對照組和50 nmol/L組的結(jié)合水峰值出現(xiàn)在2 d，100 nmol/L組的結(jié)合水峰值則推遲到3 d，3組種子的結(jié)合水在達到峰值之后逐漸下降，下降速率從小到大依次是50、100 nmol/L、對照組，而150、200 nmol/L兩組種子的結(jié)合水在3 d達到一個小峰值之后并沒有出現(xiàn)下降趨勢，而是小范圍水平波動變化。這可以解釋為，種子吸脹結(jié)束后開始萌動，內(nèi)部生化反應(yīng)主要在解除休眠的種子胚乳中進行，淀粉分子的鏈狀結(jié)構(gòu)伸展，淀粉粒吸水，在淀粉酶的催化作用下開始降解。因此種子內(nèi)部結(jié)合水量先增加后減少。鹽脅迫程度越厲害，種子內(nèi)部淀粉顆粒吸水越慢，淀粉酶活性受到抑制，分解轉(zhuǎn)移淀粉的速度越慢[30]。此外，種子貯藏的生物大分子還包括脂肪和蛋白質(zhì)，大分子降解不只與淀粉有關(guān)。

表2 單位質(zhì)量T2峰面積統(tǒng)計表

2.3.2 鹽脅迫對半結(jié)合水的影響

0～1 d種子從休眠狀態(tài)蘇醒，體內(nèi)半結(jié)合水信號幅值劇增；隨著試驗進行，半結(jié)合水的增長趨勢逐漸減緩。1 d之后，5組試驗對象的半結(jié)合水增長出現(xiàn)差異，對照組、50、100 nmol/L 3組的半結(jié)合水峰面積增速依次為957.79/d、626.19/d、736.04/d，而150、200 nmol/L兩組的增長速率分別為289.69/d、254.23/d，均低于對照組、50、100 nmol/L組增速。以上數(shù)據(jù)表明NaCl脅迫程度在100 nmol/L及以下時對半結(jié)合水的影響較小。

2.3.3 鹽脅迫對自由水的影響

自由水對鹽脅迫最敏感。對照組和50 nmol/L組自由水峰面積分別在1和2 d達到最小值后出現(xiàn)大幅回升現(xiàn)象；100 nmol/L的自由水峰面積在2 d達到最小值后小幅上漲，但低于其初始狀態(tài)；150、200 nmol/L組自由水2弛豫譜峰面積一直在600以下，并出現(xiàn)下降現(xiàn)象。

自由水代表細胞內(nèi)液泡和細胞間水。植物細胞在鹽脅迫條件下有無機滲透調(diào)節(jié)和有機滲透調(diào)節(jié)兩種形式[31]。在鹽脅迫過程中，植物可以通過對無機離子的選擇性吸收或隔離來維持細胞內(nèi)外的離子平衡，從而在鹽環(huán)境中維持正常生長狀態(tài)。參與滲透調(diào)節(jié)過程的離子中，Cl-作用存在較大爭議，有學者認為它被動進入細胞，只作為離子電荷的平衡物質(zhì)，在調(diào)節(jié)滲透勢方面作用不大；而另一些學者認為在脅迫初級階段時，玉米可以通過對Cl-快速吸收來增強植株的耐鹽性，因此種子在低濃度（50 nmol/L）NaCl環(huán)境下表現(xiàn)出一定的耐鹽性。

較高濃度的無機離子環(huán)境下，植物平衡細胞內(nèi)外的滲透勢還需要借助有機分子。非鹽生植物若需減輕鹽脅迫，則借助外源物質(zhì)誘導積累滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，從而調(diào)節(jié)體內(nèi)滲透壓的動態(tài)平衡，這樣可以從根本上保護酶活性，對于生物膜的結(jié)構(gòu)更可以發(fā)揮出穩(wěn)定的作用[32]。玉米屬于非鹽生植物，其主要滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)以有機小分子為主，主要包括脯氨酸、多元醇等，本試驗沒有增加外源物質(zhì)誘導試驗對象產(chǎn)生足夠有機小分子調(diào)節(jié)滲透壓，致使玉米種子在較高濃度（200 nmol/L）NaCl環(huán)境下，細胞膜功能遭到破壞。以上分析可以說明玉米種子在低濃度的鹽環(huán)境中通過無機滲透和有機滲透兩種形式調(diào)節(jié)體內(nèi)滲透壓，從而保持正常生長，但兩種調(diào)節(jié)滲透壓的形式在高濃度鹽環(huán)境下均遭到破壞。

2.3.4 鹽脅迫對副峰水的影響

除了上述變化明顯的主峰，試驗發(fā)現(xiàn)，在對照組、50、100、150 nmol/L 4組2弛豫譜圖中，結(jié)合水左側(cè)均出現(xiàn)小面積的副峰，出現(xiàn)時間為1～6 d，其弛豫時間在結(jié)合水范圍之內(nèi)，占總體水分的比例在10%以下；當鹽溶液濃度達到200 nmol/L，種子不發(fā)芽且無副峰出現(xiàn)。組內(nèi)副峰隨時間變化不具有明顯規(guī)律。副峰信號出現(xiàn)，可能由于某些活性基團和水形成的氫鍵比淀粉中的氫鍵穩(wěn)定性更強[33-34]。副峰的出現(xiàn)說明了種子在吸脹階段并不完全是物理現(xiàn)象，此過程中的化學反應(yīng)為后續(xù)萌動、露白做了準備。副峰的出現(xiàn)和種子發(fā)芽有密切關(guān)聯(lián)，是一種標志著種子發(fā)芽的結(jié)合水。

2.3.5 鹽脅迫對總水分的影響

5個濃度梯度的種子總體水分的變化趨勢均表現(xiàn)為：吸脹階段前期（0～1 d）劇增，2 d之后放緩速度。隨著鹽脅迫的加劇，單位質(zhì)量的總體水T弛豫譜峰面積依次下降?？傮w水峰面積的增速以及截至到6 d的積累量的排列順序為：對照組、50 nmol/L組、100nmol/L組、150 nmol/L組、200 nmol/L組。這和胚和胚乳灰度值的統(tǒng)計結(jié)果一致。

2.3.6 個體內(nèi)部3種相態(tài)水比例

根據(jù)表2，玉米種子休眠狀態(tài)時，21>23>22，經(jīng)過6 d的培養(yǎng)，對照組3種相態(tài)水的最終含量為22>23>21，結(jié)合水占總體比例從83.05%降到20.62%，半結(jié)合水比例從4.38%增加到56.83%；50 nmol/L組3種相態(tài)水的最終含量為22>21>23，結(jié)合水占總體比例從82.31%降到28.56%，半結(jié)合水比例從4.35%增加到47.57%；100 nmol/L組3種相態(tài)水的最終含量為22>21>23，結(jié)合水占總體比例從84.5%降到34.45%，半結(jié)合水比例從4.77%增加到57.81%；150 nmol/L組3種相態(tài)水的最終含量為21>22>23，結(jié)合水占總體比例從83.84%降到55.92%，半結(jié)合水比例從5.51%增加到36.47%；200 nmol/L組3種相態(tài)水的最終含量為21>22>23，結(jié)合水占總體比例從83.76%降到55.14%，半結(jié)合水比例從6.03%增加到39.92%。

此外，對照組吸脹1 d后，自由水比例從12.92%驟降至2.9%，1～6 d勻速增加到23.79%。50 nmol/L組自由水比例在2 d出現(xiàn)最小值，從13.77%驟降至3.51%，隨后緩慢增加到21.58%。100 nmol/L組較特殊，自由水比例初始值為10.65%，同樣在2 d達到最小值2.16%，隨后緩慢增加到31.51%，但是2弛豫譜峰面積和150、200 nmol/L兩組峰面積同樣保持在600以下，種子活性受到嚴重脅迫。150 nmol/L組自由水比例呈現(xiàn)不斷下降的趨勢，從11.42%降到1%。200 nmol/L組和150 nmol/L組類似，自由水比例從11.45%持續(xù)降到1.8%。

5組試驗對象的結(jié)合水占總體水比例的變化趨勢均為持續(xù)下降，半結(jié)合水比例持續(xù)上升，鹽脅迫程度加劇則會延緩下降或上升的速率，當NaCl濃度達到150 nmol/L水平時，二者比例變化均被大幅延遲；自由水對NaCl比較敏感，鹽濃度達到100 nmol/L，自由水含量受到嚴重抑制。

3 結(jié) 論

1）通過對質(zhì)子密度圖像進行ROI提取并統(tǒng)計感興趣區(qū)域的平均灰度值，發(fā)現(xiàn)胚乳部分和胚部位的平均灰度值在種子吸脹階段迅速增加，在2 d之后增速下降；胚乳水分在2 d之后出現(xiàn)波動增長的趨勢，而胚部位水分則出現(xiàn)水平波動的現(xiàn)象；隨著鹽濃度從0增至200 nmol/L，水分變化速率減緩。偽彩圖像可以直觀展示種子萌發(fā)過程，解釋總體水分的分布和遷移，但還需要更精準的數(shù)據(jù)分析不同相態(tài)水分的劃分和變化規(guī)律。

2）隨著鹽脅迫程度上升，種子發(fā)芽率從90%降至0。鹽濃度在50 nmol/L及以下時，不同相態(tài)水信號幅值變化趨勢受鹽脅迫影響較小，達到100 nmol/L時自由水信號幅值被抑制在低水平，達到150 nmol/L時結(jié)合水和半結(jié)合水信號幅值的增速均被大幅延緩；但是50 nmol/L是否可以當做鹽脅迫的閾值，值得進一步劃分濃度梯度探究。此外，2弛豫譜圖結(jié)合水左側(cè)出現(xiàn)副峰，弛豫時間為0.1 ms<23<1 ms。對照組（0）、50、100、150 nmol/L各組內(nèi)副峰隨時間變化不具有明顯規(guī)律，當鹽溶液濃度達到200 nmol/L，種子不發(fā)芽且無副峰出現(xiàn)。因此副峰的出現(xiàn)和種子是否發(fā)芽有密切關(guān)聯(lián)，是一種標志著種子發(fā)芽的結(jié)合水。

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Low-field nuclear magnetic resonance of maize seed germination process under salt stress

Yue Xia, Bai Yuhe, Wang Zhaoyi, Song Ping※

(1,,110866,;2,110161,)

Taking the non-waxy corn Zhengdan 958 seeds as the test object, a Low-Field Nuclear Magnetic Resonance (LF-NMR) experiment was performed under different NaCl concentrations (0, 50, 100, 150 and 200 nmol/L), in order to explore the influence of salt stress on the water distribution and activity during the germination of corn seeds. Two parts were included in the LF-NMR experiment, Magnetic Resonance Imaging (MRI) and nuclear magnetic resonance signal test. The proton density image was obtained by the Multi-slice Spin Echo (MSE) pulse sequence, and the nuclear magnetic signal was obtained by Carr-Purcell-Meiboom-Gill sequence (CPMG) pulse. The samples were incubated for 6 days at 28℃, providing for the analysis of nuclear magnetic resonance proton density images and NMR relaxation spectrum. The results showed that: The germination of maize had undergone the swelling (0-2 d), sprout (3-4 d), and budding (5-6 d) during the entire experimental period. Specifically, the overall moisture content increased, while the activity became stronger, as the gray value increased, where the grayscale image became brighter and whiter in a certain area. Therefore, the gray value of images can be used to represent the overall or local moisture content of seeds. Furthermore, the Region of Interest (ROI) of proton density image was extracted further to count the average gray value. It was found that the moisture content of endosperm and embryo part increased rapidly during the seed swelling stage, whereas, the growth rate decreased after 2 d. There was also a fluctuating increase in the moisture content of endosperm, whereas, the water in the embryo site fluctuated horizontally. The rate of water decreased as the salt concentration increased. Since the pseudo-color images can be used to visually show the germination process of seeds, they were used to explain the distribution and migration of overall moisture. However, more accurate data was needed to analyze the division and change rules of moisture in different phase states. The germination rate of seeds decreased from 90% to 0, as the degree of salt stress increased. When the salt concentration was 50 nmol/L and even below, the water signal amplitude of different phases was less affected by the salt stress, but when the salt concentration reached 100 nmol/L, the content of free water was suppressed at a low level. Particularly when it reached 150 nmol/L, the rate of change was greatly delayed in the content of bound and semi-bound water. After the 1thd, the2relaxation spectra showed that, a small area of the side peaks which did not have obvious regularities with time appeared on the left of the bound water, the relaxation time was within the range of bound water, and the proportion of total moisture was below 10%; the seeds would not germinate and no side peaks appeared when the salt solution concentration reached 200 nmol/L. Side peak signal represents water whose hydrogen bond is more stable than in starch, and the special hydrogen bond might come from the biochemical reaction that occurred after the seed was released from the dormant state. The appearance of the side peaks closely related to whether the seeds germinate showed that the swelling stage is not completely a physical phenomenon, and the chemical reaction in this process prepares for the subsequent germination and exposure. Side peaks indicate a kind of bound water that marks the germination of seeds. The findings can provide the theoretical reference for the follow-up research on the response mechanism of maize seed germination to salt-alkali stress.The LF-NMR test can be used to simulate the salt-alkali environment, futher to quickly identify the salt-tolerant ability of seeds or plants.

seeds; water; salt stress; corn germination; low field nuclear magnetic resonance technology; magnetic resonance imaging

岳霞，白雨禾，王昭懿，等. 鹽脅迫下玉米種子萌發(fā)過程低場核磁共振研究[J]. 農(nóng)業(yè)工程學報，2020，36(24)：292-300.doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2020.24.034 http://www.tcsae.org

Yue Xia, Bai Yuhe, Wang Zhaoyi, et al. Low-field nuclear magnetic resonance of maize seed germination process under salt stress[J]. Transactions of the Chinese Society of Agricultural Engineering (Transactions of the CSAE), 2020, 36(24): 292-300. (in Chinese with English abstract) doi：10.11975/j.issn.1002-6819.2020.24.034 http://www.tcsae.org

2020-07-25

2020-12-06

國家自然科學基金資助項目（31701318）；遼寧省教育廳基礎(chǔ)研究項目（LSNJC201916）；國家自然科學基金委員會與韓國國家研究基金會聯(lián)合資助合作交流項目（31811540396）

岳霞，從事精準農(nóng)業(yè)方面的研究。Email：13220819559@163.com。

宋平，博士，教授，從事精準農(nóng)業(yè)方面的研究。Email：songping_1010@163.com。

10.11975/j.issn.1002-6819.2020.24.034

S351.5+1

A

1002-6819(2020)-24-0292-09