魏 霞， 陳功海， 龍周鍇， 范小峰，張文英， 徐延浩

(1.長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院澇漬災(zāi)害與濕地農(nóng)業(yè)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/主要糧食作物產(chǎn)業(yè)化湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北荊州 434100； 2.荊州市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，湖北荊州 434025)

抗性淀粉是指不被正常人體小腸所消化吸收的淀粉及其降解物[1]，能降低餐后血糖水平，調(diào)節(jié)腸道代謝，預(yù)防結(jié)腸癌，防止脂肪堆積和控制體重等[2-3]。大麥(HordeumvulgareL.)籽粒富含β-葡聚糖、抗性淀粉、γ-氨基丁酸和生育三烯酚等保健成分，是典型的藥食同源作物[4]。不同品系大麥籽?？剐缘矸酆坎町愶@著[5-6]，通過(guò)全基因組關(guān)聯(lián)分析[5]、QTL定位[4]等對(duì)抗性淀粉進(jìn)行的遺傳研究，為高抗性淀粉基因的精細(xì)定位及品種選育奠定了基礎(chǔ)。常用谷類(lèi)抗性淀粉含量測(cè)定主要是基于酶解顯色法(AOAC，2002)[7]，該方法步驟繁瑣、耗時(shí)長(zhǎng)、成本高?？剐缘矸蹨y(cè)定方法是高抗性淀粉大麥遺傳研究與品種育種的瓶頸之一，亟待探索一種簡(jiǎn)單、快速、低成本的抗性淀粉含量測(cè)定方法。

衰減全反射中紅外光譜(attenuated total reflection mid-infrared spectroscopy,ATR-MIR)和近紅外光譜(near-infrared spectroscopy,NIR)檢測(cè)技術(shù)具有快速、準(zhǔn)確、低成本、無(wú)損等特點(diǎn)，MIR光譜技術(shù)在麥芽品質(zhì)分類(lèi)[8]、豆粕摻假識(shí)別[9]、小麥制品的嘔吐毒素污染水平快速測(cè)定[10]等方面已有應(yīng)用。NIR光譜技術(shù)在谷物蛋白定量分析[11-12]、淀粉含量測(cè)定[13]、種子活力指標(biāo)的測(cè)定[14]及稻谷膠稠度的測(cè)定[15]等方面已有應(yīng)用，并被應(yīng)用于甘薯[16]、馬鈴薯[17]和水稻[18]的抗性淀粉含量預(yù)測(cè)和材料篩選工作。但NIR光譜技術(shù)在大麥抗性淀粉含量的光譜測(cè)定還未見(jiàn)報(bào)道，也未見(jiàn)利用ATR-MIR法進(jìn)行谷物籽?？剐缘矸垲A(yù)測(cè)的報(bào)道。

本研究擬利用ATR-MIR和NIR光譜構(gòu)建一種簡(jiǎn)單、快速、低成本的大麥籽粒抗性淀粉含量預(yù)測(cè)方法，為大麥抗性淀粉育種建立一種快速、高效群體材料篩選方法；同時(shí)，比較ATR-MIR和NIR光譜技術(shù)對(duì)大麥抗性淀粉含量的預(yù)測(cè)性能，拓寬ATR-MIR光譜方法在谷物化學(xué)計(jì)量學(xué)方面的應(yīng)用。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以長(zhǎng)江大學(xué)農(nóng)學(xué)院保存的136個(gè)有稃大麥為材料，其中114個(gè)組成校正集，22個(gè)用于驗(yàn)證模型，材料信息見(jiàn)表1。2017年5月對(duì)供試材料進(jìn)行收獲、脫粒、除雜、晾曬，室溫保存1個(gè)月后，用于后續(xù)試驗(yàn)。

1.2 樣品制備

每份材料選取飽滿(mǎn)、無(wú)病害、無(wú)霉變、籽粒大小均勻度一致的樣品約5 g，經(jīng)干燥后用配有標(biāo)準(zhǔn)的0.8 mm篩板的旋風(fēng)粉碎機(jī)(Perten Laboratory Mill 3100)打磨成細(xì)粉，裝入紙袋中，經(jīng)干燥、平衡保持水分為13.00%，備用。

1.3 籽?？剐缘矸鄣幕瘜W(xué)方法測(cè)定

供試大麥籽?？剐缘矸酆炕瘜W(xué)測(cè)定參照AOAC 2002.02方法[7]，用Megazyme抗性淀粉試劑盒(Ireland. K-RSTAR)進(jìn)行測(cè)定?？剐缘矸酆?%)=[樣品吸光值/D-葡萄糖(1.0 mg·mL-1)標(biāo)準(zhǔn)液的吸光值]×(92.7/0.87)。每個(gè)樣品3次重復(fù)。

1.4 光譜采集

1.4.1 衰減全反射中紅外光譜的采集

采用美國(guó)賽默飛世爾科技公司帶有衰減全反射(attenuated total reflection,ATR)附件的Nicolet is5紅外光譜儀對(duì)校正集樣品進(jìn)行MIR光譜測(cè)定。光譜采集范圍設(shè)定為525～4 000 cm-1、分辨率為4 cm-1、掃描時(shí)間16 s。以空氣為采集背景，每個(gè)樣品測(cè)定后用無(wú)水乙醇擦拭探頭和檢測(cè)窗口，自然晾干后進(jìn)行下一個(gè)大麥籽粒樣品光譜的采集，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.4.2 近紅外光譜的采集

采用瑞典波通儀器公司生產(chǎn)的DA7200近紅外儀對(duì)校正集樣品進(jìn)行NIR光譜采集，光譜范圍設(shè)置為950 nm～1 650 nm，分辨率設(shè)置為2 nm，掃描32次。測(cè)定時(shí)使樣品盒中的樣品保持平整。每個(gè)樣品3次重復(fù)。

1.5 樣本數(shù)據(jù)的劃分

將所有樣品的ATR-MIR和NIR光譜數(shù)據(jù)分別與抗性淀粉含量的化學(xué)方法實(shí)測(cè)值對(duì)應(yīng)整合后隨機(jī)分為校正集和驗(yàn)證集，在Unscrambler 9.7(美國(guó)CAMO公司)軟件中使用強(qiáng)影響點(diǎn)模型對(duì)校正集數(shù)據(jù)進(jìn)行異常值去除，將剩余的校正集樣品用于模型的建立，而驗(yàn)證集樣品用于模型的驗(yàn)證。

1.6 光譜預(yù)處理

為了減少隨機(jī)噪音、光散射及基線漂移等對(duì)光譜的影響，在建立預(yù)測(cè)模型之前，運(yùn)用平滑(消除噪音)、多元散射校正(消除顆粒不均勻產(chǎn)生的散射對(duì)光譜的影響)、導(dǎo)數(shù)(消除基線平移或漂移)等方法預(yù)處理光譜，以提高模型的穩(wěn)定性。

1.6.1 衰減全反射中紅外光譜預(yù)處理

對(duì)ATR-MIR光譜的校正集數(shù)據(jù)進(jìn)行三種不同的預(yù)處理：高斯濾波平滑(gaussian filter smoothing，GFS)+基線位移校正(baseline offset correction，BOC；以下簡(jiǎn)稱(chēng)GFS+BOC)；多元散射校正(multiplicative scatter correction，MSC)+savitzky-golay法一階求導(dǎo)(平滑點(diǎn)數(shù)15；以下簡(jiǎn)稱(chēng)MSC+1thD)；基線位移校正(baseline offset correction，BOC)+范圍歸一化(range normalization，RN；以下簡(jiǎn)稱(chēng)BOC+RN)。

1.6.2 近紅外光譜預(yù)處理

對(duì)NIR光譜的校正集數(shù)據(jù)進(jìn)行三種不同的預(yù)處理：面積歸一化(area normalization，AN；簡(jiǎn)稱(chēng)AN)；基線位移校正(baseline offset correction，BOC)+S-G卷積平滑法(saviteky golay smoothing，SGS；簡(jiǎn)稱(chēng)BOC+SGS)；標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變換(standard normal variate，SNV)+savitzky-golay法一階求導(dǎo)(平滑點(diǎn)數(shù)21；簡(jiǎn)稱(chēng)SNV+1thD)。

1.7 預(yù)測(cè)模型的評(píng)價(jià)與驗(yàn)證

用外部驗(yàn)證集數(shù)據(jù)檢驗(yàn)其預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值之間的符合程度，預(yù)測(cè)值數(shù)據(jù)和實(shí)測(cè)值數(shù)據(jù)之間的決定系數(shù)越大，平均相對(duì)誤差值越小，說(shuō)明兩者間的符合程度越好，并通過(guò)方差分析檢驗(yàn)兩者間的差異性。最大主成分(principal components,PCs)設(shè)為20，通過(guò)殘余方差分析(residual validation variance)確定模型的最佳主成分?jǐn)?shù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 校正集和驗(yàn)證集品種籽?？剐缘矸酆拷y(tǒng)計(jì)分析

使用強(qiáng)影響點(diǎn)模型分別對(duì)ATR-MIR(圖1A)和NIR(圖1B)校正集進(jìn)行異常值分析，去除2個(gè)異常樣品(CSK-81-556和Adagio)，校正集剩余樣品數(shù)量為112個(gè)。校正集材料籽?？剐缘矸酆孔畹蜑?.925%±0.023%(Zita，Weeah,TR06106)，最高為 6.315%±0.231%(WA13590)，平均含量為2.073%，變異系數(shù)為58.177%(表1)。驗(yàn)證集22個(gè)材料籽?？剐缘矸酆孔畹蜑?.945± 0.050%(WA13240)，最高為6.125± 0.214%(WA86372)，平均含量為2.455%，變異系數(shù)為58.411%。由此可見(jiàn)，參試大麥材料抗性淀粉含量差異較大，校正集和驗(yàn)證集的分布在合理范圍，樣本數(shù)量已經(jīng)超過(guò)ATR-MIR和NIR基礎(chǔ)模型的要求。

A:衰減全反射中紅外光譜校正模型；B:近紅外光譜校正模型。

表1 供試大麥材料來(lái)源及籽?？剐缘矸酆拷y(tǒng)計(jì)

(續(xù)表1 Continued table 1)

2.2 衰減全反射中紅外光譜最佳預(yù)測(cè)模型的篩選

A:光譜范圍在525～2 954 cm-1之間的ATR-MIR光譜；B:光譜范圍在950～1 650 nm之間的NIR光譜。

表2 大麥籽?？剐缘矸鬯p全反射中紅外和近紅外光譜最佳預(yù)測(cè)模型的篩選

2.3 近紅外光譜最佳預(yù)測(cè)模型的篩選

2.4 最佳預(yù)測(cè)模型的檢驗(yàn)

用驗(yàn)證集樣品進(jìn)行ATR-MIR和NIR光譜最佳預(yù)測(cè)模型的驗(yàn)證。使用BOC+RN預(yù)處理的ATR-MIR預(yù)測(cè)模型的相對(duì)誤差范圍為1.532%～23.941%，平均相對(duì)誤差為10.072 %；使用SNV+1thD預(yù)處理的NIR預(yù)測(cè)模型的相對(duì)誤差范圍為8.133%～29.913%，平均相對(duì)誤差為 17.400%(表3)。BOC+RN預(yù)處理的ATR-MIR預(yù)測(cè)模型驗(yàn)證集樣品的預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值之間的決定系數(shù)(R2)為0.941 0(圖3A)，SNV+1thD預(yù)處理的NIR預(yù)測(cè)模型驗(yàn)證集樣品的預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值之間的決定系數(shù)為0.842 9(圖3B)，這兩種最佳預(yù)處理的預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值之間沒(méi)有顯著性差異(Turkey 法多重比較)，而B(niǎo)OC+RN預(yù)處理的決定系數(shù)(R2)比SNV+1thD預(yù)處理的決定系數(shù)高，相對(duì)誤差平均值較SNV+1thD預(yù)處理的低。這與表2中的ATR-MIR光譜所建模型的所有決定系數(shù)都高于NIR光譜模型的決定系數(shù)，誤差值低于NIR光譜的誤差值結(jié)果一致，由此可見(jiàn)，ATR-MIR和NIR光譜技術(shù)都可以應(yīng)用于大麥籽?？剐缘矸酆款A(yù)測(cè)，ATR-MIR光譜技術(shù)具有更高的預(yù)測(cè)準(zhǔn)確性和精確度。

表3 大麥籽粒抗性淀粉衰減全反射中紅外和近紅外光譜最佳預(yù)測(cè)模型的驗(yàn)證

A:BOC+RN預(yù)處理的ATR-MIR光譜;B:SNV+1thD預(yù)處理的NIR光譜。

3 討論與結(jié)論

抗性淀粉作為一種新型膳食纖維，具有改善人類(lèi)健康的巨大潛力[1-3,20]。近年來(lái)，高抗性淀粉谷物的遺傳和育種研究受到廣泛關(guān)注[21]。已有的研究表明，通過(guò)遺傳選擇提高大麥籽粒抗性淀粉含量是可行的[4-5]。遺傳選擇的一個(gè)重要前提是能高效篩選大量群體材料，獲得優(yōu)異株系。但現(xiàn)有谷物抗性淀粉測(cè)定方法繁瑣、耗時(shí)、成本高，研究簡(jiǎn)單、快速、準(zhǔn)確的抗性淀粉測(cè)定方法，對(duì)于加速谷物高抗性淀粉育種具有重要意義[20]。

本研究基于ATR-MIR和NIR光譜技術(shù)，結(jié)合BOC、SGS、MSC、SNV等光譜預(yù)處理方式，采用PLS建立大麥籽粒抗性淀粉預(yù)測(cè)模型，通過(guò)對(duì)不同預(yù)處理的結(jié)果進(jìn)行比較分析，篩選出最佳ATR-MIR和NIR預(yù)測(cè)大麥籽?？剐缘矸酆康哪Ｐ?，分別對(duì)這兩種最佳預(yù)測(cè)模型進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果顯示預(yù)測(cè)值和真實(shí)值間沒(méi)有顯著性差異，表明ATR-MIR和NIR光譜模型均可代替化學(xué)測(cè)定法實(shí)現(xiàn)對(duì)大麥籽?？剐缘矸酆康念A(yù)測(cè)。與化學(xué)定量法相比，光譜方法對(duì)樣品進(jìn)行測(cè)定和分析的總時(shí)間少于5 min，極大的提高了測(cè)定效率，為大麥抗性淀粉研究和利用提供了新方法。但值得注意的是，ATR-MIR 和NIR光譜技術(shù)主要借助光譜反射進(jìn)行測(cè)定，本研究使用的材料全部為有稃大麥，該模型是否適用于裸粒大麥還需要更多的驗(yàn)證。

Ferreira等[22]使用這兩種光譜技術(shù)預(yù)測(cè)大豆樣品中的物質(zhì)含量，結(jié)果建議使用NIR光譜技術(shù)預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)和脂質(zhì)的含量，使用MIR光譜技術(shù)預(yù)測(cè)灰分和水分的含量。Sisouane等[23]認(rèn)為MIR比NIR光譜技術(shù)能更好的預(yù)測(cè)有機(jī)廢物和堆肥中有機(jī)碳和總氮含量。但Zhang等[24]的研究結(jié)果表明，在預(yù)測(cè)牛奶中的脂肪和蛋白質(zhì)含量上這兩種光譜技術(shù)沒(méi)有差異。本研究的結(jié)果表明，在預(yù)測(cè)大麥籽粒抗性淀粉上，與NIR光譜相比，ATR-MIR光譜的R2相對(duì)較高，RMSE相對(duì)較小，具有更好的預(yù)測(cè)性能。MIR光譜識(shí)別的是分子基團(tuán)的基本振動(dòng)吸收，而NIR光譜識(shí)別的是分子基團(tuán)的合頻及倍頻振動(dòng)，這可能是這兩種光譜定量分析具有不同的預(yù)測(cè)效果的原因之一。