王思曼，張 靜，張培培，Gebrewahid Takele Weldu，閆曉翠，劉大群，李在峰

(河北農業(yè)大學植物保護學院植物病理學系小麥葉銹病研究中心/河北省農作物病蟲害生物防治技術創(chuàng)新中心/國家北方山區(qū)農業(yè)工程技術研究中心,河北保定 071001)

小麥葉銹病是由小麥葉銹菌(Pucciniatriticina)引起的氣傳真菌性病害，發(fā)病嚴重時可造成小麥高達40%以上的減產，已成為全世界小麥最重要的病害之一[1-2]。近年來由于全球氣候變暖，葉銹病在我國有加重的趨勢，特別是2012和2015年，葉銹病在河南、山東、陜西和甘肅等省大面積發(fā)生[3]，造成了嚴重的經濟損失。由于小麥葉銹菌生理小種變異，小麥抗病基因抗性頻繁喪失，因此明確小麥品種中所攜帶的抗病基因對于抗病品種的選育和合理布局有重要意義。

小麥抗葉銹病基因可分為小種?；共』蚝头切》N?；共』騕4]。目前國內外發(fā)現的小麥抗葉銹病基因有100多個，已經被正式命名的有79個[5]，大多數表現為全生育期抗病，為小種專化抗病基因。成株抗葉銹病基因有12個[6]，其中Lr34[7]、Lr46[8]、Lr67[9]和Lr68[10]為成株慢銹基因，成株慢銹基因一般為非小種專化抗病基因[11]。目前，我國許多抗葉銹病基因已喪失抗性，僅有Lr9、Lr19、Lr24、Lr38、Lr47、Lr51和Lr53等少數抗葉銹病基因仍具有良好抗性[12-13]。因此，不斷發(fā)掘新的抗病基因，并利用抗病基因防治小麥葉銹病至關重要。

基因推導結合分子標記技術可以快速鑒定出小麥品種中所攜帶的抗葉銹病基因。趙麗娜等[14]對23份小麥微核心種質材料進行了苗期抗性鑒定和標記檢測，共推導出Lr1、Lr10等13個抗葉銹病基因。Ren等[15]在84份冬小麥材料中推導出Lr1、Lr3等12個抗葉銹病基因。Takele等[16]利用基因推導的方法在我國83份品種(系)中推導出Lr1、Lr26等9個抗葉銹病基因。

國內外小麥種質資源豐富，很多材料都攜帶有效的抗葉銹病基因，了解這些材料中所攜帶的抗葉銹病基因，可為抗病育種和基因布局防治小麥葉銹病提供有效抗源材料。本試驗選用69份國外小麥品種(系)進行苗期和成株抗葉銹性鑒定，同時結合分子標記檢測供試材料中所攜帶的苗期及成株期抗葉銹病基因，以期為合理實施抗病基因布局、防治小麥葉銹病提供參考信息。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料包括36份已知抗病基因的近等基因系、69份從國外引進材料中篩選出來的小麥品種(系)、感病對照鄭州5389和成株期慢銹對照SAAR，以及17個小麥葉銹菌生理小種(具體見表1)和田間成株期所用的混合生理小種(TGPS、PHTS和FHSS)均由河北省農作物病蟲害生物防治工程技術研究中心提供。69份國外小麥品種(系)中，5份來自羅馬尼亞(Romania)，10份來自南斯拉夫(Yugoslavia)，54份來自國際玉米小麥改良中心(CIMMYT)，具體名稱見表2。17個葉銹菌生理小種是由提供者根據Long等[17]提出的四字母命名法進行命名。

1.2 苗期基因推導及抗葉銹性鑒定

將所有供試材料播種于溫室育苗穴盤中，共播種17套。待小麥第一片葉片完全展開后，采用掃抹法將17個不同毒力的葉銹菌生理小種分別接于17套小麥葉片上，黑暗保濕16 h，再將其移入光照溫室(約25 ℃)培養(yǎng)大約兩周，待感病對照鄭州5389充分發(fā)病后，按照Roelfs等[18]的6級分級標準進行侵染型鑒定。利用Dubin等[19]提出的基因推導原則對69份小麥品種(系)進行基因推導。

1.3 田間接種及成株期抗葉銹性鑒定

于2017-2018年度將所有材料分別播種于河北保定河北農業(yè)大學試驗田和河南周口黃泛區(qū)農場試驗田。種植方法采用完全隨機區(qū)組設計，設置兩個重復，行長1.5 m，行距0.25 m，每10行種植一行感病對照鄭州5389，并且在兩側垂直種植感病對照鄭州5389作為誘發(fā)行。將用于田間接種的葉銹菌生理小種按等量的比例混合，制成含有0.05%吐溫20的葉銹菌孢子懸浮液，在小麥分蘗期噴施于誘發(fā)行，并用地膜覆蓋保濕 16 h。當感病對照鄭州5389嚴重度達到50%時，開始按照Li等[20]的方法鑒定病害嚴重度，之后每周鑒定一次，待感病對照嚴重度達100%時，所調查數據即為最終嚴重度(final disease severity,FDS)。

1.4 數據分析

利用軟件SAS 9.1進行方差分析，并計算品種間的LSD值。根據苗期和成株期的侵染型，將FDS明顯小于或與慢性對照SAAR無顯著差異的品種作為慢銹品種。

1.5 抗葉銹病基因的分子檢測

用CTAB法[21]提取小麥葉片基因組DNA，用0.5×TE把DNA溶解成100 μL原液，用分光光度計檢測提取DNA的純度和濃度。用ddH2O將DNA原液稀釋到40 ng·μL-1，作為進行PCR的模板DNA。選用與已知抗葉銹病基因Lr1[22]、Lr9[23]、Lr10[24]、Lr19[25]、Lr20[26]、Lr24[27]、Lr26[28-29]、Lr34[30]、Lr37[31]緊密連鎖的分子標記進行檢測，引物序列參照相應文獻，由生物工程(上海)股份有限公司合成。所有引物的PCR反應體系為10 μL，包括1 μL 40 ng·μL-1DNA、 1 μL 40 μmol·L-1引物、5 μL 2×Taq PCR Mix、 3 μL ddH2O。各Lr基因PCR擴增按照相應文獻進行，擴增后用1.5%瓊脂糖凝膠電泳進行檢測。

2 結果與分析

2.1 苗期基因推導及分子標記檢測結果

由表1可以看出，在36份已知抗病基因的近等基因系中， 攜帶Lr2c、Lr3、Lr16、LrB、Lr10、Lr3bg、Lr13和Lr14b這8個基因的載體品種對供試的17個葉銹菌生理小種均表現為感病，而攜帶Lr9、Lr19、Lr24、Lr28、Lr29、Lr42、Lr44、Lr47、Lr51和Lr53這10個基因的載體品種對所有供試小種均表現為抗病，因此這18個基因無法通過基因推導的方法在69份國外小麥品種(系)中鑒定出來，其余18個抗葉銹病基因對17個供試小種表現出不同的抗病性，可以在69份國外小麥品種(系)中被推導出來。根據基因推導結合分子標記檢測結果發(fā)現，Lr1、Lr10、Lr19、Lr26、Lr34和Lr37存在于在69份國外小麥品種(系)中(圖1)。

從表1和表2可以看出，Lr1對15個小種表現為抗性，而供試的國外材料中有8份小麥品種(系)(Lovrin-34、Transilvania-1、Agrounija、Sutjeska、CIM-3、CIM-14、CIM-26和CIM-42)的抗性與Lr1相同或較Lr1具有更廣譜的抗性，其中，Transilvania-1、Agrounija和Sutjeska對Lr26無毒的小種也表現出抗性，表明這些材料可能同時攜帶Lr1和Lr26。分子標記檢測發(fā)現，Transilvania-1、Agrounija、Sutjeska、CIM-3、CIM-14和CIM-26這6份材料與Lr1有相同的特異性片段，進一步說明這6份材料含有Lr1基因。Lovrin-34和CIM-42這兩份材料只對TGPS和PHTS 2個小種表現感病，分子標記檢測發(fā)現，這2份材料可能攜帶Lr10和Lr34。

Lr15對14個小種表現出抗性，而Flamura-80、CIM-31、CIM-41、CIM-49和CIM-51對這14個小種也表現為抗性，表明這些材料可能攜帶Lr15。其中，Flamura-80、CIM-31和CIM-49對Lr2a無毒的小種也表現出抗性，故推測這些材料可能也攜帶Lr2a。

Lr36對16個小種表現為低侵染型，而Fundulea-262、CIM-19、CIM-22、CIM-29、CIM-30、CIM-32和CIM-44對這16個小種也表現為抗性，表明這些材料可能攜帶Lr36。

Lr26對4個小種表現為低侵染型，而Fundulea-262、Lovrin-10、Transilvania-1、Agrounija、Posavka、Radusa、Stizanka、Sutjeska、CIM-23和CIM-50這10份材料與Lr26的抗性譜相似，表明這些材料可能攜帶Lr26。其中，Posavka和CIM-23對Lr11無毒的小種也表現出抗性，表明這2份材料可能同時攜帶Lr11和Lr26。利用分子標記檢測發(fā)現，這10份材料與Lr26特異性片段一致，進一步說明這10份材料含有Lr26。

Lr11對3個小種表現出抗性，而Posavka、CIM-2、CIM-4、CIM-5、CIM-8、CIM-9、CIM-21、CIM-23、CIM-41、CIM-45、CIM-51、CIM-53和CIM-54這13份材料與Lr11的抗性譜相似，表明這些材料可能攜帶Lr11。其中，CIM-8和CIM-21對Lr3ka無毒的小種也表現出抗性，表明這2份材料可能同時攜帶Lr11和Lr3ka。

Lr45對3個小種表現為低侵染型，而CIM-2、CIM-4、CIM-11、CIM-27、CIM-28、CIM-35、CIM-38、CIM-45、CIM-46、CIM-47、CIM-53和CIM-54這11份材料對3個Lr45無毒小種也表現為低侵染型，表明這些材料可能攜帶Lr45。其中，CIM-2、CIM-4、CIM-27、CIM-28、CIM-35、CIM-38、CIM-45、CIM-47和CIM-54對2個Lr17低毒小種也表現為抗病，推測這些材料可能同時攜帶Lr45和Lr17。此外，CIM-11、CIM-27、CIM-35、CIM-46對9個Lr14a低毒小種表現出抗性，推測這4份材料可能同時攜帶Lr14a和Lr45。

分子標記檢測發(fā)現，有18份國外小麥品種(系)檢測到與Lr10相同的條帶，但Lr10在苗期對所有供試小種均表現為感病，無法利用基因推導的方法鑒定出來。有5份供試小麥品種(系)與Lr19的抗性譜相似，即對17個葉銹菌小種均表現為高抗，分子標記檢測發(fā)現，其攜帶有與Lr19一致的特異性片段，進一步表明這些材料中含有Lr19。Lr34和Lr37是成株抗病基因，無法進行苗期基因推導，利用分子標記檢測發(fā)現，攜帶Lr34的材料有11份，攜帶Lr37材料的有26份。

在69份供試國外小麥材料中，有31份材料(Flamura-80、Fundulea-262、Agrounija、 Transilvania-1、Sutjeska、CIM-2、CIM-4、CIM-7、CIM-10、CIM-12、CIM-14、CIM-16、CIM-17、CIM-18、CIM-19、CIM-20、CIM-21、CIM-22、CIM-25、CIM-29、CIM-30、CIM-31、CIM-32、CIM-37、CIM-39、CIM-40、CIM-44、CIM-49、CIM-50、CIM-51和CIM-52)對所有供試葉銹菌小種表現為抗病，或僅對其中1個小種表現為感病，說明 這些材料中可能攜帶未知的抗葉銹病基因 (表2)。

M:DL2000; Z:鄭州5389; 1:Flamura-80; 2:Fundulea-262; 3:Lovrin-10; 4:Lovrin-34; 5:Transilvania-1; 6:Agrounija; 7:Jarka; 8:Krajinka; 9:Lepenica; 10:Panonija; 11:Posavka; 12:Radus。 Lr19和 Lr26右上角的“+、-”表示檢測所使用的標記不同。

2.2 田間成株期抗病性鑒定結果

對2017-2018年度河北保定和河南周口試驗田的田間抗葉銹性鑒定數據進行方差分析發(fā)現，品種間、環(huán)境間以及品種與環(huán)境間的差異均極顯著性，說明小麥抗葉銹性基因的表達受基因型和環(huán)境的共同影響。由表3可以看出，慢銹對照SAAR田間平均嚴重度為5.25%，47份小麥品種的FDS低于慢銹對照SAAR或與慢銹對照的FDS差異不顯著，且在苗期對供試小種均表現為感病，表明這些品種為成株慢銹性品種。

表1 17個葉銹菌生理小種對36個含有已知抗葉銹病基因的品系的苗期侵染型

表2 17個葉銹菌生理小種對69份小麥品種(系)的苗期侵染型

表3 47份成株抗性品種苗期對混合小種的反應型及成株期在田間的最終嚴重度

3 討 論

國外許多小麥品種攜帶有優(yōu)良抗病基因，引進國外小麥品種在我國麥區(qū)種植，可以有效減輕小麥葉銹病對小麥的侵害，從而提高產量。因此，可以利用這些高抗品種作為抗源，培育抗性更加持久的抗病品種，用于我國農業(yè)生產。

經鑒定，本試驗中69份國外材料的抗性基因是單個抗性基因或多個抗性基因聚合的形式存在。根據苗期基因推導發(fā)現，Lr1對Lr3ka、Lr30和Lr14a無毒的小種也表現出抗性，因此攜帶基因Lr1的小麥品種無法推導出這些基因；當材料中有Lr36時，不能推導出Lr1和Lr26；當材料中攜帶Lr20時，不能推導出Lr26；當材料中同時攜帶Lr15和Lr2a兩個基因時，不能推導出Lr1；當材料中同時攜帶Lr15和Lr11兩個基因時，不能推導出Lr26；而當在材料中同時攜帶Lr20和Lr45兩個基因時，不能推導出Lr11。

根據苗期基因推導發(fā)現，有8份小麥品種與Lr1抗性相同或比Lr1表現出更廣譜的抗性，分子標記檢測發(fā)現，有6份品種攜帶有與Lr1相同的特異性片段，其余2份品種可能攜帶Lr10和Lr34。Lr10[32]位于1A染色體短臂上，研究發(fā)現，該基因已喪失抗性，本研究中Lr10在苗期對所有小種均表現為感病，只能利用分子標記檢測該基因是否存在。因此，在鑒定供試品種中是否含有抗病基因時，需要基因推導與分子標記檢測相結合互相驗證，以確保試驗結果的可靠性。

Lr26[33]位于1BL/1RS易位系上，多年來被廣泛用于小麥抗病育種。本研究中共發(fā)現有10份小麥材料攜帶Lr26，通過系譜分析(http://www.wheatpedigree.net)發(fā)現，Transilvania-1、Sutjeska、Fundulea-262這3個材料的親本都有AVRORA。Purnhauser等[34]發(fā)現品種AVRORA攜帶Lr26基因。因此，這3份小麥品種中含有的Lr26來自AVRORA。黃國紅等[35]研究發(fā)現，品種Lovrin-10攜帶Lr26，這與本研究結果一致。

成株抗性基因Lr37[36]最早在小麥栽培品種VPM1中發(fā)現，本試驗通過分子標記檢測，共發(fā)現26份小麥品種攜帶有Lr37，所占比率達到 37.68%，這些品種在田間鑒定均表現出良好的抗性。Lr34[37]是成株慢銹基因，具有良好的抗葉銹性，本試驗中共檢測到11份品種攜帶Lr34，所占比率為15.94%，其在田間均表現為抗病。本研究共發(fā)現47份材料為成株慢銹品種，這些小麥材料可作為抗源用于培育持久抗葉銹病小麥品種。