王秀華，于鴻翔，潘香逾，趙 巖，李斯深

(1.山東農業(yè)大學農學院，作物生物學國家重點實驗室，山東泰安 271018； 2.山東農業(yè)大學資源與環(huán)境學院，山東泰安 271018)

小麥(TriticumaestivumL.)是世界第一大糧食作物，占世界農作物種植面積的17%；在我國，小麥有近5 000年的種植歷史，是僅次于水稻和玉米的第三大糧食作物，每年消費量高達1.2億t，關系到國計民生[1]。小麥生長期間，易受到水分和鹽堿等非生物因素的影響[2-3]。據(jù)統(tǒng)計，世界上約70%的小麥種植于干旱半干旱地區(qū)，因水分脅迫導致的小麥減產幅度一般在15%左右，嚴重時可達80%～100%[4]。同時，全世界鹽堿地面積約9.54億hm2[5]。水分脅迫和土壤鹽堿化問題，已經成為世界農業(yè)可持續(xù)發(fā)展的制約因素，因此對小麥節(jié)水抗旱和耐鹽性進行研究具有重要意義。

小麥的節(jié)水抗旱、耐鹽性均是由多基因控制的數(shù)量性狀。前人對小麥節(jié)水抗旱和耐鹽相關QTL定位做了大量工作。例如，Acuna-Galindo等[6]在水分脅迫下檢測到502個與節(jié)水抗旱相關的QTL；任永哲等[7]以“小偃54×京411”RIL群體為材料，在鹽脅迫條件下檢測到25個與小麥最長根長、根系干重、地上部干重和總干重及其相對性狀相關的QTL。但截至目前，有關水分和鹽脅迫下小麥種子萌發(fā)性狀的QTL研究較少。

QTL定位頻率較高的染色體區(qū)域被稱為相對高頻QTL(relative high frequency QTL,RHF-QTL)，由于在高頻區(qū)域內定位到特定性狀QTL的可能性較大，亦被稱為QTL熱點區(qū)域。而某一性狀的QTL熱點區(qū)域可能會與其他性狀的QTL熱點區(qū)域重合，從而形成QTL簇(QTL cluster,QC)[8]。RHF-QTL和QC對小麥的遺傳改良有重要意義，前人在對小麥的研究中發(fā)現(xiàn)了數(shù)目不等的RHF-QTL和QC。例如，Guo等[9]在對小麥營養(yǎng)利用效率的QTL研究中，發(fā)現(xiàn)了32個RHF-QTL和26個QC。滿君霞等[10]在對小麥苗期抗旱QTL研究中，共發(fā)現(xiàn)11個RHF-QTL和1個QC。

萌發(fā)期作為小麥生育期的初始階段，對水分和鹽脅迫的響應尤為敏感。提高萌發(fā)期節(jié)水抗旱、耐鹽性，能從植物自身遺傳發(fā)育上克服水分和鹽脅迫對其生長的影響，保證基本苗的數(shù)量和質量，為高產穩(wěn)產奠定基礎[11-12]。因此，研究該時期水分和鹽脅迫下小麥種子萌發(fā)相關性狀的QTL定位具有重要的意義。本研究以“泰農18×臨麥6號”重組自交系群體(recombinant inbred lines,RIL)為材料，對水分和鹽脅迫下小麥種子萌發(fā)相關性狀進行測定，結合已構建的分子標記遺傳圖譜進行QTL定位[13-14]，以期為小麥節(jié)水、耐鹽相關基因的克隆以及分子標記輔助選擇育種提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗材料為小麥“泰農18×臨麥6號”RIL群體(TL-RIL，包含184個株系)及其親本。泰農18是本課題組選育的品種，于2008年通過山東省審定。臨麥6號是臨沂市農科院選育的小麥品系。課題組前期試驗發(fā)現(xiàn)，在種子萌發(fā)期，臨麥6號種子萌發(fā)和幼苗生長較快，胚芽鞘較長，但泰農18的根系發(fā)育較好。

1.2 試驗設計和性狀調查

試驗設置3種處理，分別用20%PEG-6000水溶液、100 mmol·L-1NaCl溶液和去離子水進行水分脅迫處理(D)、鹽脅迫處理(S)和正常處理(C)。試驗進行2次，第1、2次試驗及其平均值分別用D1、S1、C1，D2、S2、C2和DA、SA、CA表示。每次設置3個重復。將50粒種子放入鋪有雙層濾紙的發(fā)芽盒(18.5 cm×13.5 cm×7.5 cm)中，加入25 mL的脅迫溶液或蒸餾水，在光照培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(25 ℃，光照強度1 000 lx，12 h； 20 ℃，12 h)，分別在第2、4、6、8天統(tǒng)計發(fā)芽數(shù)(根長≥種長，芽長≥1/2種長時為發(fā)芽)，第8天隨機取10株幼苗對小麥萌發(fā)相關性狀進行測定。

測定的小麥萌發(fā)相關性狀包括發(fā)芽勢、發(fā)芽率、萌發(fā)指數(shù)、萌發(fā)抗旱系數(shù)、萌發(fā)耐鹽系數(shù)、根長、苗長、胚芽鞘長、根干重和苗干重。發(fā)芽勢、發(fā)芽率采用陳蕾太等[15]的方法，萌發(fā)指數(shù)、萌發(fā)抗旱系數(shù)和萌發(fā)耐鹽系數(shù)采用李國瑞等[16]的方法。主要計算公式如下：

發(fā)芽勢=第4天的發(fā)芽數(shù)/供試種子數(shù)×100%

發(fā)芽率=第8天的發(fā)芽數(shù)/供試種子數(shù)×100%

萌發(fā)指數(shù)=(1.00)n2+(0.75)n4+(0.50)n6+(0.25)n8，其中，n2、n4、n6、n8分別為第2、4、6、8天的發(fā)芽率

萌發(fā)抗旱系數(shù)=(水分脅迫下的萌發(fā)指數(shù)/對照萌發(fā)指數(shù))×100

萌發(fā)耐鹽系數(shù)=(鹽脅迫下的萌發(fā)指數(shù)/對照萌發(fā)指數(shù))×100

1.3 數(shù)據(jù)分析

利用張桂芝等[13]和Zhang等[14]構建的“泰農18×臨麥6號”分子標記遺傳圖譜進行QTL定位。應用QTL IciMapping軟件中QTL完備區(qū)間作圖(ICIM-ADD)法進行QTL分析[19]，設置步長為0.5 cM，LOD閾值為2.5。采用本課題組編寫的MS Excel(2003) VBA腳本進行QTL作圖。

QTL命名方式為“QTL+性狀縮寫+染色體+同一性狀QTL在同一染色體上的出現(xiàn)次數(shù)”[20]。定義在D1、D2、DA(或S1、S2、SA，CK1、CK2、CKA)中的兩個或兩個處理以上的環(huán)境中檢測到的QTL為RHF-QTL。定義在同一染色體置信區(qū)間重疊涉及到2個以上性狀的RHF-QTL為QC[21]。

2 結果與分析

2.1 種子萌發(fā)性狀的表型變異及相關分析

TL-RIL群體在不同處理下各性狀變異較大，均表現(xiàn)超親分離現(xiàn)象(表1)。水分脅迫下各性狀變異系數(shù)范圍為13.20%～27.77%，鹽脅迫下為8.20%～17.31%，正常處理下為6.32%～14.24%。各性狀的遺傳力最大值為58.69%，最小值為15.14%，水分和鹽脅迫下的遺傳力均低于對照。方差分析表明，各性狀的基因型和環(huán)境間的變異，除根干重只達到0.01的顯著水平外，其余性狀均達到了0.001的顯著水平，可以進行下一步的QTL定位。

相關分析(表2)表明，3種處理下，苗長、胚芽鞘長和根長3個形態(tài)指標間均呈極顯著正相關，說明不論在脅迫或非脅迫環(huán)境下，小麥萌發(fā)期苗、根和胚芽鞘的生長均具有高度的協(xié)調一致性；萌發(fā)指標間，發(fā)芽率、發(fā)芽勢和萌發(fā)指數(shù)均與萌發(fā)抗旱系數(shù)、萌發(fā)耐鹽系數(shù)呈極顯著正相關，說明發(fā)芽率、發(fā)芽勢和萌發(fā)指數(shù)可以作為抗旱、耐鹽性的鑒定指標。但萌發(fā)抗旱系數(shù)和萌發(fā)耐鹽系數(shù)相關性不顯著，說明抗旱和耐鹽可能是兩個獨立遺傳的性狀。大部分形態(tài)指標和萌發(fā)指標間也呈顯著或極顯著正相關，說明無論在脅迫或非脅迫條件下，萌發(fā)較快的品系生長也都較快。胚芽鞘長與萌發(fā)抗旱系數(shù)呈極顯著正相關，說明胚芽鞘長可以作為抗旱性的鑒定指標。

2.2 種子萌發(fā)相關性狀的QTL位點

QTL分析表明，共檢測到103個與萌發(fā)性狀相關的QTL，位于除2D、6D外的19條染色體上，單一QTL可解釋2.30%～18.79%的表型變異，LOD最大值為15.20(發(fā)芽率)。其中，38個QTL為正值，其增加效應來自母本泰農18；65個QTL為負值，其增加效應來自父本臨麥6號。QTL的貢獻率在10%以上的有43個(占 41.75%)，為主效QTL。

103個QTL中有17個RHF-QTL，分布在1A、3A、3B、4A、7A、7B和7D染色體上(表3，圖1)，對表型變異的平均貢獻率為7.55%～ 15.97%。其中，8個RHF-QTL(QGi-1A，QGstc-3A，QGf-3A.2，QGi-3A，QGf-7B.1，QGp-7B，QGp-7D，QGi-7D.2)的增加效應來自父本臨麥6號，9個RHF-QTL(QShl-3B.4，QGi-4A，QSdw-7A.1，QGf-7A.1，QGi-7A.1，QSl-7B.1，QGi-7D.1，QGdrc-7D.1，QGf-7D.1)的增加效應來自母本泰農18。對17個RHF-QTL進行分類，第一類為僅在正常處理下表達的RHF-QTL，僅檢測到1個(QShl-3B.4)；第二類為僅在脅迫處理下表達的RHF-QTL，其中，僅在水分脅迫處理下檢測到的RHF-QTL有8個(QGi-1A，QGf-7B.1，QGp-7B，QGi-7D.1，QGdrc-7D.1，QGf-7D.1，QGp-7D和QGi-7D.2)，僅在鹽脅迫處理下檢測到的RHF-QTL有7個(QGstc-3A，QGf-3A.2，QGi-3A，QGi-4A，QGf-7A.1，QGi-7A.1和QSl-7B.1)，沒有檢測到在水分和鹽脅迫下均表達的QTL；第三類為在脅迫處理(水、鹽脅迫一種或兩種處理)和正常處理下均表達的RHF-QTL，僅檢測到1個(QSdw-7A.1)，它在正常和鹽脅迫兩種處理下均能檢測到，說明其受環(huán)境影響較小。

17個RHF-QTL中貢獻率大于10%的有11個，占總數(shù)的64.7%(表3)，為主效RHF-QTL，分別為QGi-1A、QGstc-3A、QSdw-7A.1、QGf-7A.1、QGf-7B.1、QGp-7B、QGi-7D.1、QGdrc-7D.1、QGf-7D.1、QGp-7D和QGi-7D.2。其中，QGi-1A(15.70%)、QGi-7D.1(15.97%)和QGi-7D.2(15.66%)貢獻率較大。

表1 TL-RIL群體及其親本的種子萌發(fā)性狀分析

表2 萌發(fā)性狀間的相關系數(shù)

表3 正常、干旱和鹽脅迫3種處理下的RHF-QTLs

圖1 RHF-QTLs和QCs在遺傳圖譜上的位置

2.3 種子萌發(fā)相關性狀的QTL簇

17個RHF-QTL中有9個(52.94%)形成了4個QTL簇(QC1～QC4)，分布在3A、7A和7D染色體上(表4，圖1)。QC1位于3A染色體上，包括控制發(fā)芽勢的QGf-3A.2和控制萌發(fā)指數(shù)的QGi-3A，平均貢獻率分別為9.00%和8.55%。QC2位于7A染色體上，包括控制苗干重的QSdw-7A.1、控制發(fā)芽勢的QGf-7A.1和控制萌發(fā)指數(shù)的QGi-7A.1，平均貢獻率為9.48%～ 10.47%。QC3位于7D染色體上，包括控制萌發(fā)指數(shù)的QGi-7D.1和控制萌發(fā)抗旱系數(shù)的QGdrc-7D.1，平均貢獻率為15.97%和14.84%。QC4位于7D染色體上，包括控制發(fā)芽率的QGp-7D和控制萌發(fā)指數(shù)的QGi-7D.2，平均貢獻率分別為14.46%和15.66%。QC1和QC4簇各QTL的增加效應均來自父本臨麥6號，QC2 和QC3簇各QTL的增加效應均來自母本泰農18。

表4 小麥萌發(fā)期抗旱耐鹽相關性狀QTL簇

3 討 論

小麥生長始于萌發(fā)期，此時期易受水分脅迫和鹽脅迫等外界環(huán)境的影響[22]。小麥萌發(fā)期節(jié)水抗旱性、耐鹽性的鑒定指標很多，通常選用根長、苗長、胚芽鞘長和干鮮重等鑒定指標[23-25]。由于小麥抗旱耐鹽機制的復雜性，本研究選用萌發(fā)期的3個形態(tài)指標、2個生物量指標和5個萌發(fā)指標共10個指標對小麥的抗旱和耐鹽性進行評價，結果發(fā)現(xiàn)，在水分和鹽脅迫下變異系數(shù)均大于10%的指標有6個，分別為苗干重、根干重、發(fā)芽率、萌發(fā)指數(shù)、萌發(fā)抗旱系數(shù)和萌發(fā)耐鹽系數(shù)。這6個指標在水分和鹽脅迫下群體間的表型變異豐富，是評價小麥抗旱耐鹽性的重要指標。相關分析表明，在水分脅迫和鹽脅迫下根長與苗長呈極顯著正相關，這與Batool等[26]的研究結果一致；在鹽脅迫下根干重與苗干重呈極顯著正相關，這與任永哲等[7]的研究結果一致，說明小麥根系與幼苗存在著相互協(xié)調的關系；萌發(fā)抗旱系數(shù)和萌發(fā)耐鹽系數(shù)相關性不顯著，而且本研究也沒有檢測到在水分和鹽脅迫下同時表達的RHF-QTL，說明抗旱和耐鹽可能兩個是相對獨立遺傳的性狀，這與楊 帆等[27]認為植物對鹽和水分脅迫擁有不同的響應機制的研究結果一致。

由于分析群體和遺傳圖譜標記類型的不同，本研究中的大多數(shù)RHF-QTL定位在新的標記區(qū)間。本研究中位于7A染色體上控制苗干重的QSdw-7A.1和控制發(fā)芽勢的QGf-7A.1均在3個環(huán)境條件下檢測到，受環(huán)境影響較小。前人在7A染色體上也曾檢測到控制苗干重和發(fā)芽勢的QTL，如Hao等[28]在水分脅迫下檢測到控制發(fā)芽勢的QTL，Zhang等[24]在水分脅迫下檢測到控制苗干重的QTL。本研究中位于7D染色體上控制發(fā)芽率的QGp-7D在3個水分脅迫環(huán)境條件(D1,D2,DA)下均能穩(wěn)定表達，Landjeva等[29]在7D染色體上也檢測到控制發(fā)芽率的QTL。

多個QTL定位在染色體相同置信區(qū)間而形成QTL簇。本研究發(fā)現(xiàn)的QTL簇QC2位于7A染色體上，包括3個RHF-QTL(QSdw-7A.1、QGf-7A.1、QGi-7A.1)，且這3個RHF-QTL大部分是在鹽脅迫處理條件下檢測到的，主要與小麥的耐鹽性相關。前人在小麥QTL研究中也發(fā)現(xiàn)了許多的QC[9,30]。Zhang等[14]在小麥氮素利用效率相關性狀的QTL研究中，在7A染色體上定位到一個控制根冠比的QTL，與本文的QC2有相同的分子標記wPt-2780和wPt-9207；Guo等[9]在小麥氮、磷、鉀利用效率相關性狀的QTL研究中，在7A染色體上發(fā)現(xiàn)了控制地上部干重和總干重等14個性狀的QC，與本文的QC2有1個相同的分子標記wPt-7034，說明QC2區(qū)段可能存在一類基因，通過提高小麥萌發(fā)期的氮、磷、鉀利用效率，從而提高耐鹽能力。本研究發(fā)現(xiàn)的QC3位于7D染色體上，包括2個RHF-QTL (QGi-7D.1、QGdrc-7D.1)，且這2個RHF-QTL是在干旱環(huán)境條件下檢測到的，主要與小麥的節(jié)水抗旱性相關。Zhang等[14]在小麥氮素利用效率相關性狀的QTL研究中，在7D染色體上定位到控制籽粒氮累積量和地上部氮累積量的QTL，與本文中的QC3有1個共同的標記D-1230051，說明QC3可能存在一類基因，通過提高小麥萌發(fā)期的氮利用效率，從而提高抗旱能力。上述分析表明，QC2和QC3不但分別與小麥的耐鹽性和節(jié)水抗旱性相關，且與小麥的營養(yǎng)元素利用效率相關，可作為小麥萌發(fā)期節(jié)水抗旱和耐鹽分子標記輔助選擇的重要位點加以利用。