蔣鈺婕，王君哲，趙佳男，許盛寶

(西北農(nóng)林科技大學(xué)農(nóng)學(xué)院，陜西楊凌 712100)

芒作為小麥穗部器官的組成之一，是小麥長(zhǎng)期進(jìn)化和適應(yīng)環(huán)境的結(jié)果[1]。但由于芒不利于收割和儲(chǔ)藏，經(jīng)過數(shù)千年的人類選擇，馴化的小麥(硬粒小麥和普通小麥)出現(xiàn)了短芒甚至無芒[2]。然而，芒的存在也有利于小麥的生長(zhǎng)發(fā)育，同葉一樣，芒也是光合作用的重要器官[2-4]，由于芒的光合面積大，處于光照的最佳位置，距離籽粒近，對(duì)于促進(jìn)籽粒灌漿和提高粒重具有重要的作用[5]；芒中非綠色組織的細(xì)胞，尤其是表皮細(xì)胞的細(xì)胞壁增厚，有利于減少水分的蒸發(fā)[6]，在干旱條件下，芒對(duì)小麥有較明顯的增產(chǎn)作用[7]。因此，芒對(duì)小麥適應(yīng)干旱脅迫、促進(jìn)籽粒灌漿和提高粒重均有重要意義[8-9]。

麥芒根據(jù)長(zhǎng)度和形態(tài)，可以分為長(zhǎng)芒、短芒、無(頂)芒、勾曲芒、短曲芒、長(zhǎng)曲芒等多種形式[10]，主要由五個(gè)基因(A、B1、B2、B3和Hd)及多個(gè)微效基因共同決定[10]，其中，A基因促進(jìn)芒的伸長(zhǎng)，Hd基因促進(jìn)鉤芒的形成，B1、B2和B3可抑制芒的發(fā)育，且B1的抑制作用最強(qiáng)，B2其次，B3最弱[11]。B1可以使穗中下部完全無芒，只有頂部少量芒，位于5A染色體長(zhǎng)臂末端，目前已克隆了候選基因TraesCS5A02G542800[12-13]；B2可以使整個(gè)穗部的芒長(zhǎng)變短，定位在6B染色體 4.84 Mb的物理區(qū)間內(nèi)[11]；B3控制頂部的芒長(zhǎng)，但目前定位還不清楚；Hd也會(huì)對(duì)芒長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用，可通過與B1、B2的組合來產(chǎn)生不同類型的芒[14]，定位于4A染色體上[15]。由此可見，芒長(zhǎng)發(fā)育具有位置效應(yīng)，而且芒長(zhǎng)表型是由多基因互作的結(jié)果。中國(guó)春作為普通小麥的模式品種，是一個(gè)典型的無芒小麥品種。前人發(fā)現(xiàn)，當(dāng)中國(guó)春的缺體系染色體3BS[16]、4AS[14]和6BL[14]分別缺失后，頂部都出現(xiàn)了芒；當(dāng)染色體5AL缺失后，中部有芒伸出，表明目前已知的芒長(zhǎng)基因并不全面，還有很多與芒長(zhǎng)相關(guān)的基因尚未發(fā)現(xiàn)，從而限制了對(duì)芒長(zhǎng)發(fā)育的分子基礎(chǔ)與芒長(zhǎng)基因的互作研究[14]。

SNP芯片技術(shù)作為一種高通量、低成本的基因自動(dòng)分型檢測(cè)方法，目前已被廣泛用于小麥等多倍體作物的遺傳研究[17]、小麥連鎖圖譜的構(gòu)建[18]、種群結(jié)構(gòu)分析[19]和小麥基因定位[20]。用SNP芯片結(jié)合傳統(tǒng)的集群分離分析法 (bulked segregation analysis，BSA)，可快速檢測(cè)2個(gè)不同表現(xiàn)型構(gòu)建的混合池間的遺傳差異，發(fā)現(xiàn)與目標(biāo)性狀顯著關(guān)聯(lián)的差異SNP的染色體富集區(qū)域，在富集區(qū)域內(nèi)開發(fā)標(biāo)記，可進(jìn)行SNP基因分型[21]；再結(jié)合競(jìng)爭(zhēng)性等位基因特異性PCR(kompetitive allele specific PCR，KASP)，可實(shí)現(xiàn)基因的精細(xì)定位和進(jìn)一步SNP分型[22-23]。

本研究利用小麥無芒品種中國(guó)春和有芒品種MK147構(gòu)建F2分離群體與重組自交系群體，用F2代分離群體中無芒與有芒株系分別構(gòu)建DNA極端性狀混合池，利用Wheat660K SNP芯片進(jìn)行基因分型，并對(duì)其結(jié)果進(jìn)行BSA分析，對(duì)群體中有關(guān)芒長(zhǎng)的QTL進(jìn)行初步定位；用KASP標(biāo)記進(jìn)行QTL驗(yàn)證和精細(xì)作圖，并開發(fā)與之緊密連鎖的分子標(biāo)記，以期為分析芒形成的遺傳機(jī)制和分子標(biāo)記輔助選擇育種奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

中國(guó)春(Chinese Spring， CS)是測(cè)序完成的模式小麥品種，MK147是由國(guó)際農(nóng)業(yè)研究中心(International Center for Agricultural Research，ICARDA)引進(jìn)的小麥耐熱性品系[25-26]。本研究利用這兩個(gè)普通小麥品種(系)作為親本進(jìn)行雜交，獲得F1，自交得到F2分離群體，通過單粒傳法，得到了MK147/CS組合的F5代重組自交系(RIL)群體。親本中的CS屬于無芒材料，盡管CS一直被認(rèn)為是無芒的小麥，但其實(shí)頂部有很短的芒(頂部芒長(zhǎng)<0.6 cm)，因此，本研究用頂部芒長(zhǎng)小于0.6 cm作為無芒的標(biāo)準(zhǔn)。MK147屬于長(zhǎng)芒材料(芒長(zhǎng)>4 cm)。F2群體及親本于2016年10月至2017年6月種植于西北農(nóng)林科技大學(xué)北校區(qū)試驗(yàn)地(陜西楊凌)。RIL群體及親本于2018年10月至2019年6月種植于西北農(nóng)林科技大學(xué)曹新莊試驗(yàn)地(陜西楊凌)。F2和RIL群體均按單粒播種的方式種植，RIL群體的每個(gè)株系種植成株行，行長(zhǎng)2.0 m，行間距0.25 m，株距0.15 m，試驗(yàn)設(shè)置3次重復(fù)，田間管理按當(dāng)?shù)卮筇锍Ｒ?guī)標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行。

1.2 表型測(cè)定

于小麥蠟熟期，F(xiàn)2群體每個(gè)單株隨機(jī)選取三個(gè)穗，RIL群體每個(gè)株系隨機(jī)選取3個(gè)主莖穗，使用直尺分別測(cè)量小麥穗部上、中、下三部分的芒長(zhǎng)；每個(gè)部分隨機(jī)選取3個(gè)芒，取平均值作為該部分的平均芒長(zhǎng)，用于表型及遺傳分析。

1.3 DNA提取及混池構(gòu)建

根據(jù) F2分離群體的表型鑒定結(jié)果，從群體中隨機(jī)選取15個(gè)無芒單株和15個(gè)有芒單株構(gòu)建極端池。分別取新鮮嫩綠的葉片，使用CTAB法提取DNA[27]，用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)DNA濃度，再等量混合形成無芒池和長(zhǎng)芒池。

1.4 SNP芯片分型及BSA分析

用Wheat660K SNP芯片(https://wheat.pw.usda.gov/ggpages/topics/Wheat660_SNP_array_developed_by_CAAS.pdf)進(jìn)行混池SNP分型檢測(cè)(北京博奧晶典生物技術(shù)有限公司)。利用Excel 2019軟件處理SNP分型數(shù)據(jù)，剔除無多態(tài)性及低質(zhì)量的SNP，篩選得到親本及無芒、長(zhǎng)芒池間純合且有差異的SNP。參照中國(guó)春IWGSC.Ref.V1.0(http://www.wheat genome.org/) ，將差異SNP側(cè)翼序列與基因組進(jìn)行BLAST，獲得SNP的物理位置信息。參考Wu等[24]的方法，設(shè)計(jì)Perl腳本計(jì)算目標(biāo)染色體上每Mb中SNP數(shù)量進(jìn)行滑窗統(tǒng)計(jì)，根據(jù)標(biāo)記密度評(píng)估可能的目標(biāo)區(qū)間。

1.5 KASP-SNP標(biāo)記開發(fā)及初定位結(jié)果驗(yàn)證

根據(jù)SNP物理位置的分布和密度，使用在線平臺(tái)PolyMarker網(wǎng)站(http://polymarker.tgac.ac.uk/)對(duì)候選SNP進(jìn)行KASP設(shè)計(jì)，從中挑選出染色體特異的標(biāo)記。在KASP標(biāo)記正向引物5′ 端分別加上FAM或HEX熒光的接頭序列，其中FAM接頭序列為5′-GAAGGTGACCAAGTTCATGCT-3′，HEX接頭序列為5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGATT-3′，引物由上海生工生物工程有限公司合成。將KASP標(biāo)記在群體中進(jìn)行單倍型分析，若能將SNP的不同基因型區(qū)分開，說明該標(biāo)記具有特異性，可以用來進(jìn)行分子輔助選擇。定位區(qū)間左側(cè)標(biāo)記SNP-1537引物序列為：1537F_FAM：CGTGTCAAAAGTTCTGACGAC；1537F_HEX：CGTGTCAAA-AGTTCTGACGAA；1537R：GTATCGTCT- CGTTGCACAGT。右側(cè)標(biāo)記SNP-4195引物序列為：4195F_FAM：GTGAAGTACAAGGATGAGGTGAAA；4195F_HEX：GTGAAGTACAAGGATGAGGTGAAG；4195R:CTCCCACATCTTGACGAGCA。

2 結(jié)果與分析

2.1 群體中芒長(zhǎng)的遺傳分析

CS為無芒品種，與有芒品系MK147雜交，F(xiàn)1代全部表現(xiàn)為有芒，但均為短芒，芒長(zhǎng)顯著短于有芒親本(圖1A)，表明CS中無芒性狀受半顯性單基因控制。芒在穗的不同位置長(zhǎng)度不同，其中MK147中部最長(zhǎng)，下部最短；而雜交F1代上部最長(zhǎng)，下部最短(圖1B)。

在F2群體中芒長(zhǎng)呈現(xiàn)連續(xù)的變化(圖2A)。無芒與有芒的株系在F2代中接近1/4的比例(表1)，表明群體中的無芒性狀可能是由一個(gè)基因控制。在RIL群體中，以頂部芒長(zhǎng)小于0.6 cm作為無芒標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)無芒株系有58個(gè)、有芒株系有62個(gè)，比例接近1∶1的比例(圖2B)，進(jìn)一步說明了群體中的無芒性狀由單基因控制。

2.2 混合池構(gòu)建結(jié)果和BSA分析

在MK147/CS的混池中篩選到8 904個(gè)有差異的SNP標(biāo)記(圖3A)。其中4 281個(gè)差異SNP集中分布在4A染色體上(圖3B)，且差異SNP與總SNP的比例在4A染色體上最高，表明群體中控制芒長(zhǎng)的QTL位于4A染色體。通過對(duì)4A染色體上每Mb中SNP數(shù)量進(jìn)行滑窗統(tǒng)計(jì)，發(fā)現(xiàn)4A上的差異SNP大部分富集在37～105 Mb和446～468 Mb區(qū)間，表明4A染色體上有兩個(gè)候選位點(diǎn)(圖3C)。

2.3 定位區(qū)間的驗(yàn)證與縮小

根據(jù)Wheat660K 芯片在兩個(gè)富集區(qū)間的SNP序列信息，開發(fā)了58個(gè)KASP標(biāo)記，將這些標(biāo)記在MK147/CS雜交的F2代群體458個(gè)株系中進(jìn)行基因型檢測(cè)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無芒性狀與37～105 Mb區(qū)間連鎖更為緊密，定位于KASP標(biāo)記SNP-1537與SNP-4195之間0.81 cM的遺傳區(qū)間，對(duì)應(yīng)于中國(guó)春參考基因組(IWGSC.Ref. V1.0)4A染色體上9.23 Mb(100.56～109.79 Mb)的物理距離(圖4)，利用標(biāo)記SNP-1537與SNP-4195對(duì)RIL群體的無芒和有芒株系進(jìn)行基因型檢測(cè)(圖5)，其中，標(biāo)記SNP-1537檢測(cè)了121個(gè)株系，基因型和表型一致的達(dá)91.74%；標(biāo)記SNP-4195檢測(cè)了137個(gè)株系，基因型和表型一致的達(dá)94.89%。因此，再次驗(yàn)證了群體中芒抑制基因位點(diǎn)位于4A染色體上，并將其命名為Awn-4A.1，同時(shí)發(fā)現(xiàn)兩個(gè)與Awn-4A.1緊密連鎖的KASP標(biāo)記SNP-1537和SNP-4195。

3 討 論

芒長(zhǎng)基因在生產(chǎn)上既有應(yīng)用價(jià)值，也是研究小麥基因互作的一個(gè)重要表型。杜 斌等[10]研究發(fā)現(xiàn)，影響芒長(zhǎng)的位點(diǎn)由多個(gè)基因共同控制。中國(guó)春中不同染色體的缺失均造成其無芒表型發(fā)生改變，表明還有許多與芒長(zhǎng)相關(guān)的基因參與芒的發(fā)育，從而限制了對(duì)芒長(zhǎng)這一性狀發(fā)育的分子基礎(chǔ)與互作機(jī)制的研究[14]。

圖1 親本和F1代芒長(zhǎng)表現(xiàn)(A)及芒長(zhǎng)統(tǒng)計(jì)(B)

A:F2群體；B：RIL群體。

表1 F2群體芒長(zhǎng)的遺傳分析及卡方檢驗(yàn)結(jié)果

A：親本與F2混池差異SNP的重疊關(guān)系；B：篩選的SNP在染色體上的分布，折線表示差異SNP與總SNP數(shù)的比例；C：4A染色體差異SNP的物理位置和密度，框表示SNP顯著富集的區(qū)域。

本研究中發(fā)現(xiàn)的位于4A染色體上控制芒長(zhǎng)的位點(diǎn)，是對(duì)全穗芒長(zhǎng)的抑制，且表現(xiàn)為半顯性，這與前人報(bào)導(dǎo)的五個(gè)芒長(zhǎng)基因(A、B1、B2、B3和Hd)的表現(xiàn)都不同[11-15]，可能是一個(gè)新的芒長(zhǎng)位點(diǎn)；Sourdille等[14]和宮 希等[15]研究發(fā)現(xiàn)，定位于4A染色體上的Hd也會(huì)對(duì)芒長(zhǎng)產(chǎn)生抑制作用，但控制鉤芒的形成[14-15]，與本研究中的芒長(zhǎng)表型不同，可能不是同一個(gè)基因。因此，推測(cè)在中國(guó)春4A染色體上可能存在與Hd不同的另外一個(gè)基因來調(diào)控芒長(zhǎng)，在抑制芒發(fā)育的過程中，可能一起發(fā)揮作用。

芒長(zhǎng)是由多基因共同控制，這些基因間存在著復(fù)雜的相互作用。本研究鑒定到的位點(diǎn)定位于4A染色體上0.81 cM的遺傳區(qū)間，對(duì)應(yīng)中國(guó)春(IWGSC.Ref.V10)參考基因組9.23 Mb的物理位置，區(qū)間內(nèi)含有多個(gè)候選基因，為進(jìn)一步精細(xì)定位與克隆基因提供了基礎(chǔ)。目前還未研究該位點(diǎn)與其他已知芒長(zhǎng)位點(diǎn)的互作效應(yīng)，但該位點(diǎn)能夠抑制全穗芒長(zhǎng)，因此，推測(cè)該位點(diǎn)可能在芒發(fā)育調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中處于較為核心的位置，深入研究將有助于建立芒發(fā)育基因的調(diào)控主線，以及逐步解析小麥芒長(zhǎng)的基因互作機(jī)制。

A：F2群體控制芒長(zhǎng)QTL的遺傳圖譜；B：F2群體與控制芒長(zhǎng)QTL的物理圖譜；C：F2群體關(guān)鍵重組體的標(biāo)記基因型及子代驗(yàn)證表型。

紅色點(diǎn)表示基因型與CS一致，藍(lán)色點(diǎn)表示基因型與MK147一致。