陳桂林，徐 姍，吳紫娟，吳 祎

江蘇常州市第二人民醫(yī)院藥劑科，江蘇常州 213000

腸缺血/再灌注是由急性腸系膜缺血、嚴(yán)重感染、創(chuàng)傷性休克和手術(shù)過程引起的病理生理過程[1- 2]，其發(fā)展可導(dǎo)致多器官功能障礙和全身炎癥反應(yīng)綜合征，是外科患者發(fā)病和死亡的重要原因[3- 4]。雖然在再灌注過程中恢復(fù)血流和再充氧對其拯救至關(guān)重要，但它會引發(fā)一系列事件，可能導(dǎo)致額外的細(xì)胞損傷，稱腸缺血再灌注損傷(intestinal ischemia reperfusion injury，IIRI)，而且常超出最初的缺血損傷。過度損傷是多種因素造成的，包括炎癥細(xì)胞因子釋放[5]、氧自由基形成[6]、損傷組織中性粒細(xì)胞浸潤[7]。腸缺血/再灌注可增加腸道通透性，破壞黏膜屏障功能[8- 9]。受損的腸黏膜屏障可能導(dǎo)致腸上皮通透性增加，因此逆轉(zhuǎn)腸上皮通透性的增加對腸缺血/再灌注的保護(hù)和改善具有重要意義。丹酚酸B(salvianolic acid B，SAB)為唇形科植物丹參的根及根莖提取而得，由3分子丹參素與1分子咖啡酸縮合而成，具有活血化瘀、通經(jīng)活絡(luò)之功效，本研究評估了SAB對腸缺血/再灌注大鼠模型腸道的保護(hù)性效應(yīng)。

材料和方法

材料24周齡健康雄性SD大鼠48只，體質(zhì)量225～275 g，購自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院實驗動物中心，合格證號：SCXK-(軍)2012- 0004；飼養(yǎng)于常州市第二人民醫(yī)院實驗中心屏障系統(tǒng)動物房，在12 h光/暗循環(huán)控制條件下進(jìn)行，溫度(25±3)℃，相對濕度55%～60%。組織勻漿機(jī)(無錫沃信儀器制造有限公司)；丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量測定試劑盒、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性測定試劑盒、白細(xì)胞介素interleukin(IL)- 1β ELISA試劑盒和HE染色試劑盒(上海碧云天公司)，核因子κB(nuclear factor kappa-B，NF-κB)RT-PCR試劑盒、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor α，TNF-α)RT-PCR試劑盒、IL- 1β RT-PCR試劑盒、IL- 6 RT-PCR試劑盒、Trizol試劑、NF-κB ELISA試劑盒、TNF-αELISA試劑盒和IL- 6 ELISA試劑盒[西格瑪奧德里奇(上海)貿(mào)易有限公司]。

IIRI大鼠模型的建立及分組SD大鼠禁食12 h，在實驗前一晚可自由飲水。肌肉注射氯胺酮(90 mg/kg)麻醉動物，成功后腹腔鏡中線開腹尋找腸系膜上動脈，采用無損傷動脈夾將腸系膜上動脈夾閉60 min，閉塞血管環(huán)達(dá)到阻斷內(nèi)臟循環(huán)的目的，然后將動脈夾除去，使腸系膜上動脈恢復(fù)，再灌注4 h。阻斷成功標(biāo)志是遠(yuǎn)端腸系膜血管搏動消失且腸壁顏色漸蒼白。再灌注成功的標(biāo)志是遠(yuǎn)端腸系膜血管搏動恢復(fù)，腸管顏色由蒼白轉(zhuǎn)變?yōu)榉奂t。在手術(shù)干預(yù)之間，縫合中間切口，并用保鮮膜覆蓋，以減少液體損失。保持一個適當(dāng)?shù)穆樽砥矫?，在手術(shù)過程中將大鼠放在恒溫37°C的加熱墊上。再灌注后，收集整個小腸。本研究經(jīng)江蘇常州市第二人民醫(yī)院實驗動物倫理委員會審核。

采用隨機(jī)數(shù)字表法將48只大鼠隨機(jī)分為以下4組(n=12)：(1)IIRI組：手術(shù)尋找腸系膜上動脈，阻隔血流60 min后解除，再灌注4 h；(2)SAB+IIRI組：術(shù)前先采用SAB以40 mg/kg經(jīng)腹腔注射預(yù)處理1周后，同IIRI組手術(shù)操作；(3)陰性對照組：經(jīng)開腹手術(shù)但不結(jié)扎腸系膜上動脈；(4)SAB+陰性對照組：術(shù)前先采用SAB以40 mg/kg經(jīng)腹腔注射預(yù)處理1周后，經(jīng)開腹手術(shù)但不結(jié)扎腸系膜上動脈。

標(biāo)本制備模型建立成功24 h后，將所有大鼠經(jīng)腹腔注射麻醉后，從尾靜脈取得血液樣本，收集于肝素抗凝管中以分離血漿。于大鼠回腸處切取部分回腸腸管(5 cm左右)，一部分以10%多聚甲醛固定以行組織病理學(xué)分析，一部分留存為做腸道通透性檢驗的樣本，剩余部分加入PBS進(jìn)行制備組織液勻漿。

MDA含量測定按照MDA含量測定試劑盒說明書進(jìn)行測定，具體為：將回腸組織勻漿在4℃條件下3 000 r/min(r=15 cm)離心10 min，轉(zhuǎn)移上清液至1.5 ml離心管中；實驗設(shè)置標(biāo)準(zhǔn)孔、空白孔、對照孔、測定孔，其混合體系如表1所示(劑量體積均為1 ml)。將上述混合體系充分混勻，95℃孵育40 min后流水冷卻，4000 r/min(r=15 cm)離心20 min，在532 nm條件下測定其上清液的OD值。MDA含量計算公式：MDA 含量(nmol/ml)=[(測定孔OD值-對照孔OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)孔OD值-空白孔OD值)] ×標(biāo)準(zhǔn)品濃度(1×105μmol/L)×稀釋倍數(shù)。

表1 MDA含量測定的試劑混合體系Table 1 Reagent mixture system for MDA content determination

MDA：丙二醛
MDA：malondialdehyde

SOD活性測定SOD活性按照試劑盒說明書進(jìn)行測定，其混合體系如表2所示，具體為：充分混勻后，37℃水浴40 min，各加入2 ml顯色劑進(jìn)行混合，室溫靜置10 min，550 nm條件下使用蒸餾水調(diào)零，測得各孔OD值。計算公式如下：SOD活性(U/ml)=[(對照孔OD值-測定孔OD值)/對照孔OD值]/50%×反應(yīng)體系稀釋倍數(shù)(3.33/0.03)×樣本測定前稀釋倍數(shù)。

RT-PCR法檢測炎癥因子轉(zhuǎn)錄水平采用Trizol試劑提取各組大鼠回腸組織RNA，按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作合成cDNA，經(jīng)過RT-PCR反應(yīng)體系，以β-actin為內(nèi)參，分別對各組實驗大鼠回腸組織勻漿中相關(guān)炎癥因子NF-κB、TNF-α、IL- 1β、IL- 6的相對表情況進(jìn)行測定。利用NCBI軟件進(jìn)行引物設(shè)計，引物設(shè)計結(jié)果如表3所示。

表2 SOD活性測定的試劑混合體系Table 2 Reagent mixture system for SOD activity determination

SOD：超氧化物歧化酶
SOD：superoxide dismutase

表3 引物設(shè)計結(jié)果Table 3 Primer design

NF-κB：核因子κB；TNF-α：腫瘤壞死因子-α；IL：白細(xì)胞介素
NF-κB：nuclear factor kappa-B；TNF-α：tumor necrosis factor alpha-α；IL：interleukin

ELISA法檢測炎癥因子的分泌水平標(biāo)準(zhǔn)品稀釋、加樣，用封板膜封板后置37℃溫育30 min，將30倍(48T的20倍)濃縮洗滌液用蒸餾水30倍(48T的20倍)稀釋后備用，洗滌，每孔加入酶標(biāo)試劑50 μl，空白孔除外，溫育，洗滌，每孔先加入顯色劑A 50 μl，再加入顯色劑B 50 μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色15 min，終止反應(yīng)，以空白孔調(diào)零，450 nm波長依序測量各孔的吸光度(OD值)。

腸道組織學(xué)檢測將腸組織剩余部分固定在10%緩沖多聚甲醛中1周，石蠟包埋，HE切割染色，3名獨立調(diào)查員盲法進(jìn)行組織學(xué)評估，取平均評分進(jìn)行分析。損傷采用半定量分級方案進(jìn)行分類，根據(jù)黏膜損傷類型和黏膜下?lián)p傷類型，對各部位進(jìn)行數(shù)值評分。

統(tǒng)計學(xué)處理采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件，計量資料的方差齊性檢驗采用單因素方差分析，等級資料采用多個獨立樣本非參數(shù)檢驗進(jìn)行總體比較，組間比較采用兩獨立樣本非參數(shù)檢驗，P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

MDA含量檢測結(jié)果陰性對照組、IIRI組、SAB+IIRI組和SAB+陰性對照組的MDA含量分別為(1.35±0.11)、(2.63±0.18)、(1.89±0.21)和(1.44±0.15)nmols/mg，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=15.865，P=0.002)；其中，IIRI組高于陰性對照組(P=0.005)，SAB+IIRI組低于IIRI組(P=0.012)。

SOD活性檢測結(jié)果陰性對照組、IIRI組、SAB+IIRI組和SAB+陰性對照組的SOD活性分別為(6.13±1.22)、(4.89±0.14)、(5.62±0.67)和(5.99±0.72)U/mg蛋白，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=12.126，P=0.006)；其中，IIRI組低于陰性對照組(P=0.006)，SAB+IIRI組高于IIRI組(P=0.017)。

回腸內(nèi)炎癥因子轉(zhuǎn)錄水平

TNF-α：陰性對照組、IIRI組、SAB+IIRI組和SAB+陰性對照組的光密度分別為83.41±7.21、158.21±11.57、134.33±10.20和84.76±9.14(P=0.001)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=25.127，P=0.001)；其中，IIRI組高于陰性對照組(P=0.003)，SAB+IIRI組低于IIRI組(P=0.009)(圖1)。

IL- 1β：陰性對照組、IIRI組、SAB+IIRI組和SAB+陰性對照組的光密度分別為43.21±6.89、80.04±12.15、57.42±9.01和46.91±7.95，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F= 28.269，P=0.001)；其中，IIRI組高于陰性對照組(P=0.026)，SAB+IIRI組低于IIRI組(P=0.005)(圖1)。

IL- 6：陰性對照組、IIRI組、SAB+IIRI組和SAB+陰性對照組的光密度分別為51.12±3.60、90.69±9.87、63.94±12.13和49.38±11.32，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=14.362，P=0.007)；其中，IIRI組高于陰性對照組(P=0.015)，SAB+IIRI組低于IIRI組(P=0.003)(圖1)。

NF-κB：陰性對照組、IIRI組、SAB+IIRI組和SAB+陰性對照組的光密度分別為67.25±6.19、140.43±12.33、88.47±9.25和71.08±11.27，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F= 20.428，P=0.002)；其中，IIRI組高于陰性對照組(P=0.007)，SAB+IIRI組低于IIRI組(P=0.015)(圖1)。

IL：白細(xì)胞介素；TNF-α：腫瘤壞死因子-α；NF-κB：核因子κB
IL：interleukin；TNF-α：tumor necrosis factor alpha-α；NF-κB：nuclear factor kappa-B
圖1RT-PCR法檢測各組大鼠回腸內(nèi)炎癥因子轉(zhuǎn)錄水平
Fig1RT-PCR of inflammatory factor transcription levels in the ileum of rats in each group

回腸內(nèi)炎癥因子分泌水平

TNF-α：陰性對照組、IIRI組、SAB+IIRI組和SAB+陰性對照組的TNF-α水平分別為(125.75±14.25)、(158.21±11.67)、(185.96±15.29)和(195.36±15.24)μg/ml，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=30.256，P=0.002)；其中，IIRI組高于陰性對照組(P=0.002)，SAB+IIRI組高于IIRI組(P=0.006)。

IL- 1β：陰性對照組、IIRI組、SAB+IIRI組和SAB+陰性對照組的IL- 1β水平分別為(59.68±9.85)、(120.25±19.68)、(78.96±14.21)和(75.96±12.26)μg/ml，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=30.217，P=0.002)；其中，IIRI組高于陰性對照組(P=0.002)，SAB+IIRI組低于IIRI組(P=0.006)。

IL- 6：陰性對照組、IIRI組、SAB+IIRI組和SAB+陰性對照組的IL- 6水平分別為(85.96±9.68)、(125.56±15.26)、(89.62±25.27)和(59.82±25.63)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=18.652，P=0.001)；其中，IIRI組高于陰性對照組(P=0.008)，SAB+IIRI組低于IIRI組(P=0.002)。

NF-κB：陰性對照組、IIRI組、SAB+IIRI組和SAB+陰性對照組的NF-κB水平分別為(99.59±12.52)、(185.26±25.98)、(125.20.47±12.58)和(101.25± 15.95)μg/ml，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=17.415，P=0.001)；其中，IIRI組高于陰性對照組(P=0.026)，SAB+IIRI組低于IIRI組(P=0.005)。

SAB預(yù)處理對各組大鼠小腸通透性功能的影響

菊粉：陰性對照組、IIRI組、SAB+IIRI組和SAB+陰性對照組的Papp分別為(12.66±1.21)、(12.03±1.57)、(10.56±1.20)和(13.02±1.11)cm/s，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=9.985，P=0.021)；其中，IIRI組低于陰性對照組(P=0.015)，SAB+IIRI組低于IIRI組(P=0.011)。

右旋糖酐：陰性對照組、IIRI組、SAB+IIRI組和SAB+陰性對照組的Papp分別為(6.05±1.67)、(5.38±1.21)、(5.72±1.60)和(6.14±2.10)cm/s，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=8.693，P=0.036)；其中，IIRI組低于陰性對照組(P=0.011)，SAB+IIRI組高于IIRI組(P=0.012)。

RPC：陰性對照組、IIRI組、SAB+IIRI組和SAB+陰性對照組的RPC水平分別為(2.09±0.21)、(2.23±0.18)、(1.84±0.19)和(2.12±0.22)，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F=8.420，P=0.041)；其中，IIRI組高于陰性對照組(P=0.031)，SAB+IIRI組低于IIRI組(P=0.020)。

回腸病理組織學(xué)變化結(jié)果陰性對照組大鼠回腸組織切片顯示出正常的黏膜，Chiu組織學(xué)得分為(0.11±0.14)分；IIRI組大鼠回腸組織切片顯示腸絨毛完全暴露，固有層存在大量中性粒細(xì)胞浸潤和大量壞死，Chiu組織學(xué)得分為(3.65±0.42)分；SAB+IIRI組大鼠回腸組織切片顯示腸黏膜發(fā)生小面積水腫、壞死及些許絨毛剝脫現(xiàn)象，Chiu組織學(xué)得分為(2.14±0.37)分；SAB+陰性對照組大鼠回腸組織切片結(jié)果顯示為正常組織學(xué)形態(tài)，Chiu組織學(xué)得分為(0.09±0.11)分，明顯高于陰性對照組(P=0.001)；SAB+IIRI組明顯低于IIRI組(P=0.001)。

討 論

IIRI是外科常見的組織器官損傷之一，在嚴(yán)重感染、創(chuàng)傷、休克等情況下，以及腸梗阻、腹主動脈瘤手術(shù)、體外循環(huán)、小腸移植術(shù)等手術(shù)的病理生理過程中起重要作用。IIRI不僅可引起腸道局部損傷，且可因腸黏膜屏障被破壞而引起腸內(nèi)細(xì)菌、內(nèi)毒素向腸外組織和器官移位，從而導(dǎo)致全身炎性反應(yīng)綜合征、多臟器功能不全綜合征和多臟器功能衰竭發(fā)生。

SAB是從丹參(丹參根)中分離得到的一種天然酚酸，為丹參中含量最豐富、生物活性最強(qiáng)的成分，也是一種廣泛應(yīng)用于各種心血管疾病、神經(jīng)疾病和肝病治療的中藥[10]。李祥等[11]研究發(fā)現(xiàn)，SAB可激活PI3K/Akt信號通路，誘導(dǎo)NF-κB核因子相關(guān)因子Nrf2、血紅素加氧酶1和谷氨酸-l-半胱氨酸連接酶催化亞基表達(dá)，通過Nrf2介導(dǎo)的作用保護(hù)對乙酰氨基酚誘導(dǎo)的肝損傷和多巴胺能神經(jīng)元。多項研究顯示，SAB具有減輕氧化應(yīng)激、減輕炎癥和疼痛、抑制細(xì)菌生長、調(diào)節(jié)屏障功能障礙等作用，在體內(nèi)和體外均具有抗氧化活性[12- 14]。

本研究建立了IIRI模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，IIRI組的右旋糖酐水平明顯低于陰性對照組和SAB+IIRI組，葡聚糖凝膠水平明顯高于陰性對照組和SAB+IIRI組；IIRI組的菊粉水平明顯低于陰性對照組，高于SAB+IIRI組；SAB預(yù)處理能改善大鼠回腸組織腸黏膜的水腫、壞死和絨毛剝脫現(xiàn)象，SAB+陰性對照組的Chiu組織學(xué)得分明顯高于陰性對照組，SAB+IIRI組Chiu組織學(xué)得分明顯低于IIRI組；提示IIRI可以破壞腸黏膜屏障，SAB預(yù)處理對腸黏膜屏障具有保護(hù)作用。此外本研究還顯示，IIRI組的MDA含量明顯高于陰性對照組和SAB+IIRI組，SOD活性明顯低于陰性對照組和SAB+IIRI組；IIRI組的TNF-α、IL- 1β、IL- 6和NF-κB的轉(zhuǎn)錄和分泌水平均明顯高于陰性對照組和SAB+IIRI組，說明IIRI可誘發(fā)腸道的氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)水平，SAB預(yù)處理可改善兩者反應(yīng)。綜上，本研究結(jié)果顯示，SAB的預(yù)處理能夠減輕IIRI，這種保護(hù)性效應(yīng)可能是通過減輕腸道的氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)來實現(xiàn)。

圖2大鼠回腸腸道組織學(xué)表現(xiàn)(HE，×300)
Fig2Histological findings of ileum in different groups(HE，×300)