霍文杰，丁青，劉曉霞，孫冬梅，黃敏燁，王利偉

廣東一方制藥有限公司，廣東 佛山 528244

桃仁味苦，性甘、平，具有活血祛瘀、潤腸通便、止咳平喘等功效，臨床上用于治療經(jīng)閉痛經(jīng)、癥瘕痞塊、肺癰腸癰、跌撲損傷、腸燥便秘、咳嗽氣喘等癥[1]。桃仁中主要有效成分為脂肪油與苦杏仁苷，其中苦杏仁苷具有抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗?jié)兒椭箍绕酱人幚碜饔?。桃仁配方顆粒是薔薇科植物山桃Prunusdavidiana(Carr.)Franch.或桃P.persica(L.)Batsch 的干燥成熟種子經(jīng)炮制并按標(biāo)準(zhǔn)湯劑的主要質(zhì)量指標(biāo)，經(jīng)現(xiàn)代工藝提取、濃縮、干燥等工序制成的配方顆粒。

《中華人民共和國藥典》(以下簡(jiǎn)稱《中國藥典》)2015年版桃仁中已收載采用HPLC測(cè)定桃仁藥材中苦杏仁苷含量；《廣東省中藥配方顆粒標(biāo)準(zhǔn)(第一冊(cè))》桃仁配方顆粒項(xiàng)下也收載了苦杏仁苷含量測(cè)定方法，兩者苦杏仁苷含量測(cè)定方法一致。此分析方法中所分離的苦杏仁苷色譜峰實(shí)際包含了D-苦杏仁苷與L-苦杏仁苷，當(dāng)采用不同的色譜柱進(jìn)行分析時(shí)，苦杏仁苷色譜峰會(huì)產(chǎn)生雙峰現(xiàn)象，根據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道[2-3]，在高溫煎煮條件下，苦杏仁苷易產(chǎn)生異構(gòu)化，具體表現(xiàn)為D-苦杏仁苷隨著水溫的上升異構(gòu)化產(chǎn)生L-苦杏仁苷。自然界中不存在L-苦杏仁苷，但是在中藥湯劑、中藥配方顆粒中均存在L-苦杏仁苷。不同手性化合物，藥物活性、毒性差異較大。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道[4]，L-苦杏仁苷沒有抗腫瘤作用，因此有必要對(duì)這2種手性化合物進(jìn)行分開測(cè)定，以明確桃仁配方顆粒物質(zhì)基礎(chǔ)。本研究測(cè)定桃仁配方顆粒中D-苦杏仁苷含量更具有針對(duì)性，進(jìn)一步完善桃仁配方顆粒的質(zhì)量控制。

1 材料

1.1 儀器

Vanquish型超高效液相色譜儀(賽默飛世爾科技有限公司)；Waters ACQUITY UPLC HSS T3型色譜柱(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)；ME204E型萬分之一天平、XP26型百萬分之一天平(梅特勒-托利多公司)；Milli-Q Direct型超純水系統(tǒng)(默克股份有限公司)。

1.2 試藥

D-苦杏仁苷對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110820-201607，純度：90.7%)；乙腈、甲醇(默克股份有限公司，色譜純)；磷酸(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，色譜純)；其余試劑均為分析純；水為實(shí)驗(yàn)室超純水系統(tǒng)(默克股份有限公司，Milli-Q Direct)。

10批桃仁配方顆粒(廣東一方制藥有限公司，批號(hào)：TRKL01～TRKL10)。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

以Waters ACQUITY UPLC HSS T3(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)為色譜柱，以乙腈為流動(dòng)相A，以0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相B，梯度洗脫(0～6 min，5%～10%A，6～11 min，10%～18%A，11～20 min，18%～40%A)；流速為0.4 mL·min-1；檢測(cè)波長(zhǎng)為210 nm；進(jìn)樣體積為1 μL；柱溫為20 ℃。

2.2 對(duì)照品溶液

精密稱取D-苦杏仁苷對(duì)照品2.644 mg，置20 mL量瓶中，加70%甲醇制成119.91 μg·mL-1的對(duì)照品溶液。

2.3 供試品溶液制備

分別對(duì)桃仁配方顆粒含量測(cè)定方法的提取溶劑、提取方式及提取時(shí)間進(jìn)行考察，確定含量測(cè)定供試品制備方法。

2.3.1提取溶劑考察 取桃仁配方顆粒適量，研細(xì)，取約0.1 g，精密稱定，平行7組，每組2份，置具塞錐形瓶中，分別精密加入水、甲醇、70%甲醇、50%甲醇、乙醇、70%乙醇、80%乙醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率：250 W，頻率：40 kHz)30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，分別用水、甲醇、70%甲醇、50%甲醇、乙醇、70%乙醇、80%乙醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。結(jié)果表明，上述7種提取溶劑測(cè)得的苦杏仁苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為73.9、75.8、75.5、75.6、72.5、75.5、75.0 mg·g-1，70%乙醇、50%甲醇、70%甲醇、甲醇提取效率相當(dāng)，考慮《中國藥典》2015年版一部桃仁藥材含量測(cè)定提取溶劑為70%甲醇，因此確定桃仁配方顆?？嘈尤受蘸繙y(cè)定提取溶劑為70%甲醇。

2.3.2提取方式考察 取桃仁配方顆粒適量，研細(xì)，取約0.1 g，精密稱定，平行2組，每組2份，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，分別超聲處理(功率：250 W，頻率：40 kHz)30 min，加熱回流30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。結(jié)果表明，2種提取方式測(cè)得的苦杏仁苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為74.6、70.8 mg·g-1，超聲提取比回流提取效率略高，因此桃仁配方顆?？嘈尤受蘸繙y(cè)定采用超聲提取方式。

2.3.3提取時(shí)間考察 取桃仁配方顆粒適量，研細(xì)，取約0.1 g，精密稱定，平行3組，每組2份，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，分別超聲處理(功率：250 W，頻率：40 kHz)15、30、45 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，3種提取時(shí)間測(cè)得的苦杏仁苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為74.9、74.9、74.8 mg·g-1，可發(fā)現(xiàn)超聲時(shí)間對(duì)苦杏仁苷含量影響較小，為了確保充分提取，選取超聲時(shí)間為30 min。

2.3.4供試品溶液制備 取桃仁配方顆粒適量，研細(xì)，取約0.1 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇50 mL，稱定質(zhì)量，超聲處理(功率：250 W，頻率：40 kHz)30 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用70%甲醇補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1專屬性考察 精密吸取桃仁配方顆粒供試品溶液、D-苦杏仁苷對(duì)照品溶液與空白溶劑各1 μL，注入液相色譜儀，進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見圖1。結(jié)果表明，空白溶劑色譜中在與苦杏仁苷相應(yīng)的保留時(shí)間沒有色譜峰，表明提取溶劑對(duì)苦杏仁苷的測(cè)定無干擾，專屬性良好。

注：A.D-苦杏仁苷對(duì)照品溶液；B.供試品溶液；C.空白溶劑；1.D-苦杏仁苷；2.L-苦杏仁苷。圖1 對(duì)照品、供試品、空白溶劑色譜圖

2.4.2峰純度考察 精密吸取桃仁配方顆粒項(xiàng)下供試品溶液、D-苦杏仁苷對(duì)照品溶液各1 μL，注入液相色譜儀，按照2.1項(xiàng)下色譜條件以二極管陣列檢測(cè)器(PDA)在190～400 nm進(jìn)行掃描檢測(cè)，計(jì)算峰純度。結(jié)果表明，供試品溶液中苦杏仁苷未檢測(cè)到雜質(zhì)峰，峰純度匹配值為999，說明在該色譜條件下，苦杏仁苷峰純度符合要求。并且樣品中苦杏仁苷色譜峰光譜指數(shù)與D-苦杏仁苷對(duì)照品光譜指數(shù)吸收曲線一致，在210 nm處有最大吸收，表明該方法能準(zhǔn)確檢測(cè)D-苦杏仁苷色譜峰，無干擾。

2.4.3線性關(guān)系考察 精密稱取D-苦杏仁苷對(duì)照品8.995 mg，置20 mL量瓶中，加70%甲醇溶解，并稀釋至刻度，制成407.92 μg·mL-1的對(duì)照品溶液。

精密吸取對(duì)照品溶液4、3、3、2、1 mL，分別置5、5、10、25、100 mL的量瓶中，加70%甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得，制成D-苦杏仁苷質(zhì)量濃度分別為326.34、244.75、122.38、32.63、4.08 μg·mL-1的對(duì)照品溶液。分別精密吸取上述6個(gè)不同質(zhì)量濃度的對(duì)照品溶液1 μL進(jìn)樣，記錄色譜峰面積。以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，對(duì)照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，苦杏仁苷的回歸方程為Y=0.037 8X-0.012 3，r=0.999 8，表明苦杏仁苷在質(zhì)量濃度為4.08～407.92 μg·mL-1時(shí)，進(jìn)樣濃度與峰面積線性關(guān)系良好。

2.4.4精密度試驗(yàn) 精密吸取2.2項(xiàng)下D-苦杏仁苷對(duì)照品溶液，按照2.1項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣體積為1 μL。計(jì)算峰面積RSD。結(jié)果表明，6次連續(xù)進(jìn)樣峰面積RSD為0.16%，表明儀器精密度良好。

2.4.5重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批次桃仁配方顆粒適量，按2.3.4項(xiàng)下供試品制備方法制備6份供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定含量。結(jié)果表明，6份供試品中苦杏仁苷的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為73.64 mg·g-1，RSD為0.57%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.6加樣回收率試驗(yàn) 對(duì)照品儲(chǔ)備液的制備：取D-苦杏仁苷對(duì)照品適量，精密稱定，加70%甲醇制成1 mg·mL-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液。

分別按對(duì)照品加入量與待測(cè)成分含量之比分別為1.5∶1、1∶1、0.5∶1設(shè)計(jì)高、中、低3組實(shí)驗(yàn)，每組平行3份。取具塞錐形瓶3組，每組平行3份，分別精密加入D-苦杏仁苷對(duì)照品儲(chǔ)備液1.8、3.7、5.5 mL，置具塞錐形瓶中，置氮吹儀下?lián)]干溶劑，再分別稱取桃仁配方顆粒0.05 g，精密稱定，按苦杏仁苷含量測(cè)定方法制備9份供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定，根據(jù)重復(fù)性考察結(jié)果中苦杏仁苷質(zhì)量分?jǐn)?shù)為73.64 mg·g-1計(jì)算準(zhǔn)確度，見表1。結(jié)果表明，桃仁配方顆粒中苦杏仁苷含量測(cè)定分析方法回收率為96.09%～104.51%，符合《中國藥典》2015年版9101藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則要求。

表1 桃仁配方顆?？嘈尤受占訕踊厥章试囼?yàn)(n=9)

2.5 樣品測(cè)定

對(duì)10批桃仁配方顆粒按2.1～2.3項(xiàng)下規(guī)定，進(jìn)行樣品測(cè)定，苦杏仁苷含量測(cè)定結(jié)果見表2。

表2 10批桃仁配方顆粒中苦杏仁苷含量 mg·g-1

3 討論

3.1 苦杏仁苷差向異構(gòu)體的分離優(yōu)化

在現(xiàn)有文獻(xiàn)報(bào)道中桃仁配方顆?？嘈尤受蘸繙y(cè)定方法多采用HPLC，以甲醇-水為洗脫系統(tǒng)，該條件無法將苦杏仁苷中2種同分異構(gòu)體進(jìn)行分離[4]。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，苦杏仁苷在酸性條件下不易產(chǎn)生差向異構(gòu)，D-苦杏仁苷難以轉(zhuǎn)化成L-苦杏仁苷，而在堿性條件下，D-苦杏仁苷穩(wěn)定性差，容易產(chǎn)生差向異構(gòu)，產(chǎn)生自然界不存在的L-苦杏仁苷[5-6]；參考文獻(xiàn)[6]中報(bào)道，單獨(dú)的D-苦杏仁苷以水為溶劑加熱回流時(shí)并不會(huì)產(chǎn)生L-苦杏仁苷，由此可見L-苦杏仁苷是桃仁中D-苦杏仁苷在高溫水環(huán)境下，桃仁中物質(zhì)相互作用的結(jié)果。

本研究中發(fā)現(xiàn)，桃仁配方顆粒中苦杏仁苷2種同分異構(gòu)體在柱溫為20 ℃時(shí)可以達(dá)到較好的分離。并對(duì)比乙腈-0.1%磷酸溶液與乙腈-0.5%冰乙酸溶液2種流動(dòng)相系統(tǒng)對(duì)苦杏仁苷2種同分異構(gòu)體的分離效果，結(jié)果表明，以乙腈-0.1%磷酸溶液為流動(dòng)相系統(tǒng)時(shí)，苦杏仁苷2種差向異構(gòu)體能夠進(jìn)行有效分離。

3.2 討論

在本研究中同時(shí)采用超高效液相色譜串聯(lián)二極管陣列檢測(cè)器法(UPLC-DAD)對(duì)桃仁藥材中苦杏仁苷含量進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果表明，桃仁藥材液相色譜中含有L-苦杏仁苷色譜峰，但是該成分含量較低，按《中國藥典》2015年版桃仁項(xiàng)下苦杏仁苷含量測(cè)定方法測(cè)定時(shí)，測(cè)量誤差較小。但在桃仁配方顆粒中，L-苦杏仁苷與D-苦杏仁苷峰面積約為1∶1，表明L-苦杏仁苷在桃仁配方顆粒中大量存在，若采用原料藥材的含量測(cè)定方法則測(cè)定誤差較大。并且L-苦杏仁苷的臨床藥理藥效的研究尚未明確，因此2種差向異構(gòu)體合并測(cè)定確有不合理之處。該方法測(cè)定桃仁配方顆粒中D-苦杏仁苷含量具有針對(duì)性，可更好地控制桃仁配方顆粒質(zhì)量。