陳驍鵬，吳蕓，葉慧

江蘇省泰州市食品藥品檢驗(yàn)所，江蘇 泰州 225300

杜仲來源于杜仲科植物杜仲EucommiaulmoidesOliv.的干燥樹皮，作為藥食兩用中藥，具有補(bǔ)肝腎、強(qiáng)筋骨、安胎的功能[1]，在藥品、保健品中應(yīng)用廣泛，如杜仲降壓片、參杞杜仲丸等[2-4]。京尼平苷酸為杜仲中主要代表性藥效成分，可用于改善阿爾茨海默病患者的記憶能力[5-6]。因該成分屬于環(huán)烯醚萜苷類，在提取精制過程中熱穩(wěn)定性差，長時(shí)間熱處理易分解，目前多以低溫、減壓的方式降低其氧化分解程度[7]。

納濾具有分離過程無熱效應(yīng)、效率高、不產(chǎn)生二次污染等技術(shù)優(yōu)點(diǎn)[8]。為了探索杜仲提取液中京尼平苷酸的濃縮精制工藝，以納濾膜孔徑、pH、跨膜壓力差為影響因子[9-10]，基于單因素考察，以京尼平苷酸截留率為響應(yīng)值，采用Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)建立數(shù)學(xué)模型，優(yōu)化納濾濃縮工藝參數(shù)，進(jìn)而與常規(guī)熱濃縮對(duì)比，為熱敏性環(huán)烯醚萜苷類成分的濃縮精制提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料

1.1 儀器

e2695型高效液相色譜儀、二極管陣列檢測器(PDA)(美國Waters公司)；FL-3206型直流增壓泵(廈門優(yōu)美沃電氣有限公司)；RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(上海亞榮生化儀器廠)；SHB-Ⅲ型循環(huán)水式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào)有限公司)；KH-250B型超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；MS205DU型電子天平(上海梅特勒托利多儀器有限公司)。

1.2 試藥

杜仲藥材購自泰州市中醫(yī)院，批號(hào)：20190610010，經(jīng)江蘇省泰州市食品藥品檢驗(yàn)所葉慧副主任中藥師鑒定為杜仲科植物杜仲EucommiaulmoidesOliv.的干燥樹皮，符合《中華人民共和國藥典》2015年版(一部)相關(guān)項(xiàng)下要求；京尼平苷酸對(duì)照品(中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111828-201001，純度≥98%)；聚酰胺納濾膜(孔徑分別為150、400、650 Da，星達(dá)膜科技有限公司)；甲醇為色譜純；水為純化水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 京尼平苷酸的含量測定

2.1.1色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) Kromasil C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇-水-乙酸(24∶75∶1)[11]；檢測波長：240 nm；柱溫：25 ℃；流速：1 mL·min-1；進(jìn)樣量：10 μL。

2.1.2京尼平苷酸對(duì)照品溶液制備 精密稱取京尼平苷酸對(duì)照品0.010 60 g，置于10 mL量瓶中，加流動(dòng)相溶液稀釋至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為1.06 mg·mL-1的京尼平苷酸對(duì)照品溶液。

2.1.3杜仲提取液制備 取杜仲飲片，加入10倍體積純化水，提取2次，每次1 h，0.45 μm微孔濾膜濾過，合并濾液，得杜仲提取液，用于單因素考察、響應(yīng)面法優(yōu)化以及工藝對(duì)比。

2.1.4線性關(guān)系考察 分別取京尼平苷酸對(duì)照品溶液0.10、0.20、0.50、1.00、2.00 mL，分別置于10 mL的量瓶中，流動(dòng)相稀釋并定容至刻度，高效液相色譜儀檢測，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，對(duì)照品溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)(X)，得線性回歸方程：Y=12 827X-6 560.1，r=0.999 4。京尼平苷酸質(zhì)量濃度為10.6～212.0 μg·mL-1線性關(guān)系良好。

2.1.5精密度試驗(yàn) 取質(zhì)量濃度為21.2 μg·mL-1的京尼平苷酸對(duì)照品稀釋溶液，重復(fù)進(jìn)樣6次，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件檢測，計(jì)算京尼平苷酸峰面積積分值的RSD為1.35%。

2.1.6穩(wěn)定性試驗(yàn) 取杜仲提取液10 μL，分別于0、1、2、4、8、12、24 h進(jìn)樣，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件檢測，計(jì)算京尼平苷酸峰面積積分值RSD為1.67%，結(jié)果表明，杜仲提取液中京尼平苷酸在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.1.7重復(fù)性試驗(yàn) 按2.1.3項(xiàng)下處理，平行制備5份杜仲提取液溶液，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件檢測，京尼平苷酸質(zhì)量濃度的RSD為2.87%，表明方法重復(fù)性良好。

2.1.8加樣回收率試驗(yàn) 精密吸取杜仲提取液(京尼平苷酸質(zhì)量濃度為152.0 μg·mL-1)6份，分別精密加入京尼平苷酸對(duì)照品適量，按2.1.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行定量測定，計(jì)算得平均回收率分別為98.70%，RSD為2.45%。

2.2 納濾濃縮操作方法

采用耐壓管路依次連接增壓泵、壓力表、納濾膜套件、壓力調(diào)節(jié)閥，取杜仲提取液置于儲(chǔ)液罐中，調(diào)節(jié)增壓泵轉(zhuǎn)速提供納濾分離壓力，分別收集納濾液及截留液，采用HPLC檢測，計(jì)算分析杜仲提取液中京尼平苷酸的截留率。

2.3 減壓濃縮操作方法

取杜仲提取液，采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器減壓濃縮，由原體積2.0 L濃縮至200.0 mL，分別考察70、75、80、85、90 ℃加熱條件下，京尼平苷酸轉(zhuǎn)移率，分析減壓溫度對(duì)成分影響。

2.4 計(jì)算方法

2.4.1截留率計(jì)算 分別精密吸取杜仲提取液、納濾液，按2.4項(xiàng)下的液相檢測條件，采用HPLC測定并計(jì)算樣品京尼平苷酸濃度，按式(1)計(jì)算京尼平苷酸截留率。

(1)

式中，R為成分的截留率；C1為納濾液中京尼平苷酸的濃度；C0為杜仲提取液中京尼平苷酸的濃度。

2.4.2轉(zhuǎn)移率計(jì)算 分別精密吸取杜仲提取液、減壓濃縮液，按2.4項(xiàng)下的液相檢測條件，采用HPLC測定并計(jì)算樣品京尼平苷酸濃度，按式(2)計(jì)算京尼平苷酸轉(zhuǎn)移率。

(2)

式中，T為成分的轉(zhuǎn)移率；C2為減壓濃縮液中京尼平苷酸的濃度；V0為原溶液體積；V為減壓濃縮液體積。

2.5 單因素考察

2.5.1跨膜壓力差 膜分離的跨膜壓力差與膜分離效率直接相關(guān)，采用膜孔徑400 Da、pH 5.0為固定分離因素，考察跨膜壓力差分別為0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、2.00 MPa時(shí)，京尼平苷酸的截留率變化規(guī)律。從圖1中可以得出，隨著跨膜壓力差的增加，京尼平苷酸截留率呈現(xiàn)出上升的趨勢(shì)，其中壓力差為1.0～1.5 MPa變化相對(duì)明顯，隨著壓力差超過1.5 MPa，京尼平苷酸截留率相對(duì)穩(wěn)定，但是跨膜壓力越大，膜通量越高，也與分離生產(chǎn)效率直接相關(guān)，但是也會(huì)加重濃差極化帶來的膜污染，導(dǎo)致使用壽命縮短[12]，因此選擇跨膜壓力差1.0～1.5 MPa用于納濾分離參數(shù)考察。

圖1 跨膜壓力差對(duì)京尼平苷酸截留率的影響

2.5.2pH 溶液pH與京尼平苷酸存在狀態(tài)相關(guān)，根據(jù)納濾分離的電荷排斥原理，結(jié)合納濾膜的酸堿耐用性，采用膜孔徑400 Da，跨膜壓力差1.0 MPa為固定分離因素，考察pH分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0對(duì)京尼平苷酸截留率的影響。

調(diào)節(jié)杜仲水提液pH，改變目標(biāo)成分京尼平苷酸的解離狀態(tài)，從圖2中可以看出，隨著pH增加，京尼平苷酸截留率也隨之升高，此時(shí)的分離行為是孔徑篩分和電荷排斥共同作用的結(jié)果，也說明溶液中以離子形式存在的京尼平苷酸的比例也逐步增加，其中pH 5.0～7.0時(shí)變化相對(duì)明顯，同時(shí)為了控制堿性溶液環(huán)境下京尼平苷酸水解，選擇pH 5.0～7.0進(jìn)行響應(yīng)面考察。

圖2 pH對(duì)京尼平苷酸截留率的影響

2.6 Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化納濾濃縮工藝

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，采用Design-Expert 8.06軟件，以納濾膜孔徑、pH和跨膜壓力差作為變量，以-1、0、1代表變量水平，進(jìn)行Box-Behnken設(shè)計(jì)三因素三水平試驗(yàn)方案，優(yōu)化京尼平苷酸的納濾濃縮工藝參數(shù)。

2.6.1響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果 根據(jù)Box-Benhnken中心組合設(shè)計(jì)原理[13]，基于單因素試驗(yàn)確定的因素考察范圍，為保障結(jié)果的準(zhǔn)確性，采取平行3次計(jì)算截留率平均值。選取膜孔徑(A)、跨膜壓力差(B)、pH(C)3個(gè)因素，通過三因素三水平的響應(yīng)面分析方法，通過17組試驗(yàn)考察不同組合參數(shù)對(duì)京尼平苷酸納濾截留率的影響規(guī)律。所考察的因素水平及結(jié)果見表1。

表1 京尼平苷酸納濾分離的響應(yīng)曲面因素水平及結(jié)果

利用Design-Expert 8.06軟件，以京尼平苷酸截留率為響應(yīng)值，對(duì)上述3個(gè)因素進(jìn)行二次多項(xiàng)回歸計(jì)算。

R=89.64-10.15A+3.77B+3.49C+2.00AB+1.93AC+1.30BC-6.08A2-2.06B2+0.017C2

(3)

對(duì)該模型進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表2，膜孔徑(A)、跨膜壓力差(B)、pH(C)對(duì)于京尼平苷酸截留率影響差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，同時(shí)AB、AC因素交互作用顯著。該模型回歸F值為60.99，P<0.000 1說明該模型顯著，可根據(jù)響應(yīng)值預(yù)測京尼平苷酸截留率，且試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案正確。該模型多元r=0.987 4，預(yù)測r=0.912 8，調(diào)整r=0.971 2，均接近1.0，說明模型對(duì)試驗(yàn)實(shí)際情況擬合較好。

表2 京尼平苷酸納濾分離響應(yīng)曲面二次回歸模型的方差分析

2.6.2響應(yīng)曲面分析 多元回歸方程式所做的響應(yīng)曲面圖見圖3～5。由此可對(duì)考察因素交互影響京尼平苷酸截留率進(jìn)行分析與評(píng)價(jià)，以確定最佳因素水平范圍。圖3顯示，在pH固定為6.0時(shí)，膜孔徑和跨膜壓力差對(duì)京尼平苷酸截留率的交互影響，在跨膜壓力差不變的前提下，隨著膜孔徑增加，京尼平苷酸截留率呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)，此結(jié)果與膜分離原理中的篩分效應(yīng)相符合。在pH 6.0時(shí)，京尼平苷酸在水提液中以離子態(tài)和分子態(tài)的狀態(tài)共存，而隨著孔徑增大而出現(xiàn)截留率下降，說明此時(shí)分離是以孔徑篩分為前提。

圖3 膜孔徑和跨膜壓力差對(duì)京尼平苷酸截留率交互影響

方差結(jié)果顯示，膜孔徑與pH存在交互作用，在跨膜壓力差固定為1.25 MPa時(shí)，響應(yīng)曲面圖見圖4，在膜孔徑不變的前提下，隨著pH增加，截留率呈現(xiàn)出一定的上升趨勢(shì)，京尼平苷酸結(jié)構(gòu)中的酸性官能團(tuán)逐步離子化，在荷負(fù)電性納濾膜的電荷排斥下[14-15]，京尼平苷酸難以接近膜表面，從而引起截留率升高?？缒毫Σ钆c溶液pH交互作用不明顯，從圖5的響應(yīng)曲面可以看出幾乎呈現(xiàn)平面狀。

圖4 膜孔徑和pH對(duì)京尼平苷酸截留率交互影響

圖5 跨膜壓力差和pH對(duì)京尼平苷酸截留率交互影響

在保障京尼平苷酸截留率的前提下，保障膜分離效率，利用Design-Expert軟件預(yù)測了最佳納濾分離參數(shù)為膜孔徑400 Da，跨膜壓力差1.43 MPa，pH 6.83，結(jié)合實(shí)際分離參數(shù)的可操作性，調(diào)整為膜孔徑400 Da，跨膜壓力差1.40 MPa，pH 6.80。

2.6.3納濾分離工藝驗(yàn)證 根據(jù)響應(yīng)曲面法優(yōu)化出的分離參數(shù)進(jìn)行3次平行分離驗(yàn)證，在分離參數(shù)為膜孔徑400 Da，跨膜壓力差1.40 MPa，pH 6.80時(shí)，杜仲提取液中京尼平苷酸平均截留率為(93.7±1.8)%，與理論截留率為95.0%接近。結(jié)果表明，響應(yīng)曲面法可用于杜仲提取液中京尼平苷酸的濃縮工藝優(yōu)化。

2.7 工藝對(duì)比分析

對(duì)比納濾濃縮和減壓濃縮對(duì)尼平苷酸截留率或轉(zhuǎn)移率的影響，結(jié)果見圖6。隨著減壓濃縮溫度升高，京尼平苷酸轉(zhuǎn)移率呈現(xiàn)出下降趨勢(shì)，其中溫度高于80 ℃時(shí)轉(zhuǎn)移率低于75%，成分損失明顯。而納濾的常溫濃縮優(yōu)勢(shì)相對(duì)明顯。通過常溫化操作熱敏性成分納濾濃縮，可以有效避免因熱處理成分氧化分解帶來的損失。

圖6 濃縮方式對(duì)京尼平苷酸截留率或轉(zhuǎn)移率的影響

3 討論

現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，杜仲含有環(huán)烯醚萜類、木脂素類、苯丙素類、黃酮類、甾類和萜類等成分，其中京尼平苷酸屬于環(huán)烯醚萜類，具有降血壓、抗衰老及抗腫瘤藥理活性，而因環(huán)烯醚萜苷類成分加熱易分解的客觀現(xiàn)狀，探索常溫化的濃縮精制工藝，對(duì)于杜仲藥材的深加工具有明確的實(shí)用價(jià)值。

Box-Behnken響應(yīng)曲面法通過在因素和響應(yīng)值之間構(gòu)建數(shù)學(xué)模型，對(duì)參數(shù)進(jìn)行優(yōu)化分析，所建立的基于納濾分離技術(shù)的杜仲葉常溫濃縮模型，擬合程度高、實(shí)驗(yàn)誤差小，可用于實(shí)際預(yù)測。在進(jìn)行參數(shù)水平摸索時(shí)，溶液pH不僅影響京尼平苷酸在杜仲水提液中的解離狀態(tài)，在堿性條件也會(huì)促進(jìn)氧苷堿的水解，因此需要在成分水解和離子化之間權(quán)衡，在保證離子化帶來的電荷排斥效應(yīng)提高截留率的同時(shí)，也要保障京尼平苷酸的穩(wěn)定性。

在保證京尼平苷酸的穩(wěn)定性、截留率，提升分離效率，優(yōu)化得到的納濾分離參數(shù)為膜孔徑400 Da，跨膜壓力差1.40 MPa，pH 6.80，京尼平苷酸平均截留率為(93.7±1.8)%，與理論截留率為95.0%相近，說明采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化杜仲提取液的濃縮工藝條件可行，且優(yōu)于減壓濃縮的生產(chǎn)效率。