韓立柱，高歡，胡坤霞，汪蕓蘭，唐志書(shū)，宋逍，段璽

1.陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽(yáng) 712046；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué) 附屬醫(yī)院，陜西 咸陽(yáng) 712000

沙棘為胡頹子科酸刺屬的灌木，別名醋柳、黑刺、酸刺。中國(guó)是最早利用沙棘資源的國(guó)家之一。早在公元8世紀(jì)，《四部醫(yī)典》就已出現(xiàn)對(duì)沙棘醫(yī)藥用途的記載[1]。沙棘具有祛痰利肺、養(yǎng)胃健脾、活血祛瘀的藥理功效[2]。沙棘籽油可從沙棘籽中提取，是棕紅色或棕黃色的透明油狀液體，為沙棘有效成分的濃縮物質(zhì)，其中包含維生素E、胡蘿卜素、不飽和脂肪酸、黃酮類、酚類及甾體類等多種活性物質(zhì)[3]，具有抗輻射、抗腫瘤、保護(hù)肝臟、調(diào)血脂、抗疲勞、增強(qiáng)人體免疫力、抗菌等特殊藥理性能，并有促進(jìn)傷口愈合、緩解冠心病和心絞痛等功效，也可用做化妝品美容基料[4-6]。

微乳是由藥物、乳化劑、助乳化劑、油相、水相按照一定比例形成的粒徑為1～100 nm的均相分散系統(tǒng)[7-8]。微乳簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)可以分為3種類型，即水包油型微乳、油包水型微乳以及雙連續(xù)相型微乳[9]。本研究通過(guò)Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化了水滴定法制備沙棘籽油微乳的方法，得到了沙棘籽油微乳的最佳處方組成和制備工藝。該方法制備的沙棘籽油微乳外觀呈澄清或半透明狀液體，提高了沙棘籽油的溶解度和生物利用度，為沙棘籽油微乳的制備工藝優(yōu)化及其開(kāi)發(fā)應(yīng)用提供參考[10]。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Ulti Mate 3000型高效液相色譜儀(賽默飛世爾科技公司)；Zetasizer Nano ZS型粒度分析儀(馬爾文儀器公司)；Vortex-Genie2型漩渦混合器(北京卓信宏業(yè)儀器設(shè)備有限公司)；CJB-DS型磁力攪拌器(上海越眾儀器設(shè)備有限公司)；800型離心機(jī)(上海手術(shù)器械十廠)；SHZ-B型恒溫振蕩器(國(guó)華儀器制造有限公司)；N-1300型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(東京理化器械株式會(huì)社)；600Y型高速多功能粉碎機(jī)(永康市鉑歐五金制品有限公司)；BSA224S型分析天平(賽多利斯科學(xué)儀器有限公司)。

1.2 試藥

維生素E對(duì)照品(批號(hào)：S26A7I20052，純度≥97%)、肉豆蔻酸異丙酯(IPM，批號(hào)：Y17D10S106142)、棕櫚酸異丙酯(IPP，批號(hào)：T18J10T80193)、聚氧乙烯氫化蓖麻油(RH40，批號(hào)：Y18A10S86157)、辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯(批號(hào)：D04M11L109245)均來(lái)源于上海源葉生物有限公司；聚山梨酯-80(天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，分析純)；聚乙二醇-400(PEG400，天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，分析純)；甲醇(賽默飛世爾科技公司，色譜純)；其余試劑為分析純。

沙棘籽為山西呂梁野生沙棘，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院宋逍教授鑒定為胡頹子科植物沙棘HippophaerhamnoidesL.的干燥成熟種子。

2 方法與結(jié)果

2.1 沙棘籽油的提取

沙棘籽挑選去除雜質(zhì)，恒溫干燥箱中干燥，粉碎機(jī)粉碎，過(guò)四號(hào)篩，備用。精密稱取一定量沙棘籽粗粉，加入10倍量的石油醚，80 ℃水浴連續(xù)回流提取6 h，回收溶劑，得棕黃色沙棘籽油液體[11]，備用。

2.2 沙棘籽油維生素E含量測(cè)定

2.2.1色譜條件 色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相：甲醇；檢測(cè)波長(zhǎng)：292 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱溫：30 ℃[12-13]。

2.2.2對(duì)照品溶液的制備 取維生素E對(duì)照品20 mg置于25 mL量瓶中，加無(wú)水乙醇稀釋至量瓶刻度線，超聲20 min混合均勻，再精密移取10 mL的濃溶液置于50 mL的量瓶中，加無(wú)水乙醇稀釋至刻度線，超聲20 min混合均勻。最終得到質(zhì)量濃度為0.16 mg·mL-1的維生素E對(duì)照品溶液。

2.2.3供試品溶液的制備 取沙棘籽油5 g置50 mL錐形瓶中，加入無(wú)水乙醇20 mL，抗壞血酸2 g，在100 ℃加熱條件下使沸騰；將40 g氫氧化鉀溶于50 mL蒸餾水中，取10 mL氫氧化鉀溶液加入至錐形瓶中，回流30 min；待其冷卻至室溫后將其移入分液漏斗中，加入蒸餾水50 mL，100 mL乙醚提取，然后再用50 mL乙醚提取2次，最后將3次提取得到的乙醚液合并，用蒸餾水不斷洗滌直至乙醚呈中性，然后加入無(wú)水硫酸鈉3.01 g，進(jìn)行抽濾，除去其中不溶物，濾液在80 ℃水浴微熱蒸干，將殘?jiān)脽o(wú)水乙醇溶解于10 mL量瓶中并稀釋至刻度線，超聲20 min使其分散均勻，用微孔濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，得供試品溶液。

2.2.4系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 取無(wú)水乙醇、供試品溶液、對(duì)照品溶液各10 μL，按照2.2.1項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。結(jié)果表明，維生素E的保留時(shí)間約為10.22 min，樣品中維生素E與其他組分可以分離完全，無(wú)水乙醇對(duì)維生素E測(cè)定無(wú)影響，理論塔板數(shù)按維生素E色譜峰計(jì)均不低于5000，符合規(guī)定，色譜圖見(jiàn)圖1。

注：A.對(duì)照品溶液；B.供試品溶液；C.溶劑。圖1 維生素E HPLC圖

2.2.5線性關(guān)系考察 取制得的對(duì)照品溶液，加無(wú)水乙醇依次進(jìn)行2倍稀釋，按照2.2.1項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以含量為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，進(jìn)行線性回歸。得到線性回歸方程為Y=53.533X+0.300 4，r=0.999 5。表明維生素E質(zhì)量濃度為0.006 162 5～0.197 200 0 mg·mL-1，線性關(guān)系良好。

2.2.6精密度試驗(yàn) 取2.2.2項(xiàng)下對(duì)照品溶液，在2.2.1項(xiàng)下色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄維生素E的峰面積，并計(jì)算RSD，結(jié)果RSD為2.07%。

2.2.7穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一批供試品溶液，在室溫下放置，分別于0、2、4、8、12、16 h進(jìn)樣10 μL，依法測(cè)定。記錄維生素E的峰面積并計(jì)算RSD，結(jié)果RSD為0.42%，表明樣品溶液在室溫放置16 h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.2.8重復(fù)性試驗(yàn) 分別精密稱取同一批樣品6份，按照2.2.3項(xiàng)下的方法制備，依法測(cè)定峰面積值并用回歸方程計(jì)算含量，結(jié)果維生素E的平均質(zhì)量濃度為0.026 4 mg· mL-1，RSD為0.45%。

2.2.9回收率試驗(yàn) 取6份已知含量的5 g供試品，置于50 mL圓底燒瓶，分別加入與樣品中待測(cè)成分含有量相當(dāng)?shù)膶?duì)照品，按照2.2.3項(xiàng)下方法進(jìn)行供試品制備，依法測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。維生素E的平均回收率為99.87%，RSD為2.93%。

表1 維生素E加樣回收試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

2.3 沙棘籽油溶解度測(cè)定

取2 mL離心管分別加入1 g沙棘籽油和各組乳化劑、助乳化劑、油相1 mL，超聲20 min使其分散均勻，25 ℃振蕩24 h后2000 r·min-1離心15 min(離心半徑為10 cm)，取離心后的上清液1 mL于10 mL棕色量瓶中，加無(wú)水乙醇定容，超聲15 min使其分散均勻，過(guò)微孔濾膜，取續(xù)濾液，于高效液相色譜儀進(jìn)樣，檢測(cè)維生素E的峰面積，計(jì)算沙棘籽油中維生素E在不同基質(zhì)中的溶解度[14]，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 維生素E在不同基質(zhì)中的溶解度 mg·mL-1

2.4 基質(zhì)選擇

2.4.1油相的選擇 以RH40為乳化劑，PEG400為助乳化劑，將RH40與PEG400以質(zhì)量比為2∶1組成的混合乳化劑與IPM、IPP、大豆油這3個(gè)油相按照質(zhì)量比為1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1用磁力攪拌器混合均勻，磁力攪拌的同時(shí)加水滴定至形成澄清透明的微乳，記錄加水量，繪制偽三元相圖，篩選其最優(yōu)油相，結(jié)果見(jiàn)圖2。

圖2 不同油相所得的偽三元相圖

2.4.2乳化劑的選擇 以IPM為油相，以PEG400為助乳化劑，RH40、辛酸癸酸聚乙二醇甘油酯、聚山梨酯80分別與PEG400以質(zhì)量比為2∶1作為混合乳化劑，油相與混合乳化劑按1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1進(jìn)行混合，用加水滴定法，判斷由渾濁變?yōu)槌吻宓呐R界點(diǎn)，記錄此時(shí)的加水量。繪出偽三元相圖，偽三元相圖中積分面積最大即為最優(yōu)乳化劑，結(jié)果見(jiàn)圖3。

圖3 不同乳化劑所得的偽三元相圖

2.4.3助乳化劑選擇 以IPM為油相，以RH40為乳化劑，RH40與無(wú)水乙醇、甘油、PEG400以質(zhì)量比為2∶1作為混合乳化劑，油相與混合乳化劑按1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1進(jìn)行混合，分散均勻，判斷由渾濁變?yōu)槌吻宓呐R界點(diǎn)，記錄此時(shí)的加水量。繪出偽三元相圖，結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖4 不同助乳化劑所得的偽三元相圖

2.4.4質(zhì)量比的選擇 以IPM為油相，以RH40為乳化劑，以PEG400為助乳化劑，乳化劑與助乳化劑分別按照質(zhì)量比為2∶1、3∶1、4∶1混合得混合乳化劑，油相與混合乳化劑按1∶9、2∶8、3∶7、4∶6、5∶5、6∶4、7∶3、8∶2、9∶1進(jìn)行混合，判斷由渾濁變?yōu)槌吻宓呐R界點(diǎn)，記錄此時(shí)的加水量。通過(guò)以上數(shù)據(jù)可以繪出偽三元相圖，結(jié)果見(jiàn)圖5。

圖5 不同乳化劑和助乳化劑質(zhì)量比(Km)繪制的偽三元相圖

2.5 沙棘籽油微乳處方的優(yōu)化

2.5.1Box-Behnken響應(yīng)面法 根據(jù)2.4項(xiàng)下實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇最佳沙棘籽油微乳處方組成，繪制偽三元相圖，可明確各相含量范圍，應(yīng)用Box-Behnken響應(yīng)面法對(duì)實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行設(shè)計(jì)，用RH40(A)、PEG400(B)和IPM(C)的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為自變量，以維生素E含量和微乳粒徑作為響應(yīng)值，用軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行設(shè)計(jì)，確定沙棘籽油微乳的最佳處方用量[15-16]，設(shè)計(jì)結(jié)果見(jiàn)表3。

表3 沙棘籽油微乳Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)

2.5.2模型擬合 按照上述試驗(yàn)安排，稱取實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)比例的IPM、RH40和PEG400混合，用水加至15 mL，此時(shí)微乳為澄清透明，加入過(guò)量的沙棘油，形成淡黃色透明或半透明液體，超聲20 min使其混合均勻，然后以2000 r·min-1離心15 min(離心半徑為10 cm)，取上清液1.0 mL于10 mL棕色量瓶中，加甲醇稀釋定容，測(cè)定維生素E含量；另外將沙棘籽油微乳稀釋，然后使用激光粒度儀測(cè)定粒徑[17]。利用Design Expert 10.0.7軟件對(duì)測(cè)得的維生素E含量和粒徑進(jìn)行二項(xiàng)式擬合，方差分析結(jié)果見(jiàn)表4～5。

表4 沙棘籽油微乳載藥量響應(yīng)面回歸模型方差分析

表5 沙棘籽油微乳粒徑響應(yīng)面回歸模型方差分析

在因素為載藥量時(shí)，得到的二元回歸方程：Y=3.449×10-3+9.762×10-5A+3.680×10-4B+4.661×10-4C-1.725×10-5AB+2.450×10-4AC+1.943×10-4BC-2.061×10-4A2-6.504×10-4B2-5.696×10-4C2，在交互項(xiàng)中C、B2、C2差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，A、B、AB、AC、BC、A2差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，比較F值可知各因素對(duì)響應(yīng)值的影響大小為C>B>A，由顯著性大小可知，此設(shè)計(jì)模型擬合狀態(tài)良好，模型可用于沙棘籽油微乳載藥量實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)。

在因素為粒徑時(shí)，得到的二元回歸方程：Y=82.322-5.386 A-7.747 B+0.341 C+1.000 AB+7.750 AC-2.500 BC-12.175 A2-5.425 B2-27.675 C2，交互項(xiàng)中B、A2、C2差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，A、C、AB、AC、BC、B2差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，由顯著性大小可知，此設(shè)計(jì)模型擬合狀態(tài)良好，可用于分析沙棘籽油微乳最佳處方設(shè)計(jì)。

2.5.3響應(yīng)面優(yōu)化 采用Design Expert 10.0.7軟件繪制IPM、RH40和PEG400的不同比例對(duì)應(yīng)不同響應(yīng)值的效應(yīng)曲面圖，將IPM、RH40和PEG400中的1個(gè)自變量固定，得出其中另外2個(gè)因素對(duì)維生素E含量及粒徑的效應(yīng)曲面圖，得出沙棘籽油微乳最佳處方的各基質(zhì)的量，結(jié)果見(jiàn)圖6～7。

圖6 沙棘籽油微乳載藥量響應(yīng)面和等高線圖

圖7 粒徑響應(yīng)面和等高線圖

2.5.4驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 由響應(yīng)面分析結(jié)果得最佳處方比例為RH40∶PEG400∶IPM∶水(18.735∶6.327∶12.352∶62.586)，進(jìn)一步檢驗(yàn)響應(yīng)面模型的準(zhǔn)確度，將處方條件調(diào)整為RH40添加量19%，PEG400添加量6%，IPM添加量12%，水添加量63%，用磁力攪拌器使得其混合均勻，呈透明或半透明狀水樣液體，在磁力攪拌器攪拌的同時(shí)滴入沙棘籽油，平行3份，得淡黃色沙棘籽油微乳。按照色譜條件測(cè)定維生素E的平均質(zhì)量濃度為0.004 mg·mL-1(RSD=2.45%)，粒徑平均值為81.173 nm(RSD=2.87%)，見(jiàn)圖8。結(jié)果與回歸方程的預(yù)測(cè)值基本接近，證實(shí)了該數(shù)學(xué)模型預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性，故采用響應(yīng)面法優(yōu)化沙棘籽油微乳的制備工藝具有實(shí)踐和理論可行性。

圖8 沙棘籽油微乳粒徑圖

2.6 穩(wěn)定性考察

根據(jù)優(yōu)化后的最佳工藝制備沙棘籽油微乳，以高溫條件(60 ℃)、低溫條件(4 ℃)和離心條件進(jìn)行10 d的快速穩(wěn)定性考察[18]。

2.6.1溫度對(duì)微乳穩(wěn)定性的影響 分別取3批沙棘籽油微乳置于60 ℃和4 ℃環(huán)境中，分別于第1、3、5、7、10天觀察是否有分層現(xiàn)象，測(cè)定其維生素E含量和粒徑，結(jié)果見(jiàn)表6。結(jié)果表明，在高溫和低溫條件下放置，維生素E含量影響無(wú)明顯變化，微乳的粒徑變化不大，表明所制得微乳穩(wěn)定性良好。

表6 沙棘籽油微乳穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

2.6.2離心實(shí)驗(yàn) 取3批沙棘籽油微乳10 mL，置于離心管中，室溫下3000 r·min-1離心30 min(離心半徑為10 cm)，觀察微乳無(wú)分層現(xiàn)象。

3 討論

微乳是一個(gè)自發(fā)形成的各向同性、透明、熱力學(xué)穩(wěn)定的分散體系，體系能否形成微乳，關(guān)鍵取決于水、油、表面活性劑和助表面活性劑的種類和比例。本研究以微乳作為藥物載體，將沙棘籽油制備成沙棘籽油微乳，以外觀、滴入油相中澄清度為指標(biāo)，篩選乳化劑、助乳化劑和油相種類；記錄基質(zhì)的相變點(diǎn)繪制偽三元相圖，研究微乳相及其他狀態(tài)的分布區(qū)域情況，考察不同組分配比時(shí)的性狀變化，乳化劑和助乳化劑質(zhì)量比(Km)篩選時(shí)，隨著Km值的增大，微乳區(qū)域面積呈先增大后減小的趨勢(shì)，當(dāng)質(zhì)量比為3∶1時(shí)所得區(qū)域面積最大，可能是RH40相對(duì)含量增加時(shí)，乳化能力增強(qiáng)，能夠促進(jìn)微乳的形成；當(dāng)質(zhì)量比為4∶1時(shí)，PEG400相對(duì)含量減少，體系增溶能力減弱、黏度增加，不利于微乳的形成；通過(guò)微乳相面積的大小判斷微乳體系的相對(duì)穩(wěn)定程度，確定沙棘籽油微乳最佳基質(zhì)用量范圍。在偽三元相圖的基礎(chǔ)上通過(guò)Box-Behnken響應(yīng)面法進(jìn)一步確定各基質(zhì)的用量，以RH40、PEG400和IPM用量設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，這3種因素對(duì)維生素E含量和粒徑的影響不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系，特別是因素之間存在交互作用的，載藥量和粒徑結(jié)果的二項(xiàng)式擬合結(jié)果均具有顯著性差異，經(jīng)優(yōu)化后得到基質(zhì)的最佳配比；預(yù)測(cè)模型和驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)的結(jié)果基本一致，保證了該制備工藝穩(wěn)定可行，沙棘籽油微乳的含量測(cè)定方法線性、穩(wěn)定性和加樣回收率結(jié)果的RSD均小于3%，表明此方法穩(wěn)定性良好，可用于維生素E的含量測(cè)定。綜上，本研究制備得沙棘籽油微乳工藝過(guò)程較為簡(jiǎn)單、穩(wěn)定可靠，能夠改善沙棘籽油溶解度較低的問(wèn)題，增加其生物利用度，具有較高的臨床應(yīng)用價(jià)值，為沙棘的綜合開(kāi)發(fā)利用提供參考。