陳革豫，朱周靜，田航周，劉思雨，康翰林，王琪玉，王征

1.陜西國際商貿(mào)學(xué)院/陜西省中藥綠色制造技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西 咸陽 712046；2.陜西中醫(yī)藥大學(xué)/陜西省中藥資源產(chǎn)業(yè)化協(xié)同創(chuàng)新中心，陜西 咸陽 712083

“美容美白”是每個(gè)時(shí)代亙古不變的話題，尤其在當(dāng)下，尋找中藥美白活性成分，開發(fā)毒副作用較小且美白功效明確的美白產(chǎn)品逐漸成為中藥美白的研究熱點(diǎn)[1-7]。于靜等[1]經(jīng)翻閱古籍并查閱了104部中醫(yī)中藥著作，共查出用于美白的外用古方119個(gè)，白芷是歷代醫(yī)家喜用的美白中藥之一，但這些美容方劑的現(xiàn)代應(yīng)用頗少，究其原因，主要是其美白機(jī)制尚不清楚，具體的美白活性成分尚不明確，另外，這些美白中藥中部分毒性成分的存在阻礙了其在化妝品中的應(yīng)用[8]。酪氨酸酶是黑色素生成的關(guān)鍵酶，近年來，對于酪氨酸酶抑制劑的研究也較為多見[2，4]，其對延緩褐變和抑制黑色素形成具有重大意義[9-10]?；诖耍狙芯窟x取了白芷、白術(shù)、白附子3種出現(xiàn)頻次較高的中藥，比較了其對酪氨酸酶的抑制作用，試圖追蹤中藥美白活性成分，以揭示中藥美白的作用機(jī)制以及物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 方法原理

在一定條件下，L-多巴能在酪氨酸酶的作用下生成多巴醌，該物質(zhì)在475 nm處有最大吸收峰，而底物L(fēng)-多巴和酪氨酸酶吸收較小。若將中藥提取物加入其中，如果中藥提取物能夠抑制酪氨酸酶的活性，勢必會(huì)影響多巴醌的生成。測定加入中藥提取物前后多巴醌的生成情況，就可以判定中藥提取物對酪氨酸酶的抑制作用強(qiáng)弱。多巴醌生成減少越多，說明中藥提取物對酪氨酸酶的抑制作用越強(qiáng)，這樣可以比較中藥提取物對酪氨酸酶的抑制作用。對酪氨酸酶抑制作用強(qiáng)的中藥就可能作為美白的關(guān)鍵中藥。以此為指引進(jìn)一步分析就可以追蹤到中藥美白的活性成分。

2 材料

2.1 儀器

UV-2600型紫外-可見分光光度計(jì)[龍尼柯(上海)儀器有限公司]；GT10-1型高速臺(tái)式離心機(jī)、DT5-2型低速臺(tái)式離心機(jī)(北京時(shí)代北利離心機(jī)有限公司)。

2.2 試藥

L-多巴(上海源葉生物科技有限公司，純度：99%)；磷酸二氫鈉(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；磷酸氫二鈉(天津市河?xùn)|區(qū)紅巖試劑廠)；所用試劑均為分析純；水為二次蒸餾水。

藥材購買于北京同仁堂西安西大街分店，經(jīng)陜西國際商貿(mào)學(xué)院醫(yī)藥學(xué)院雷國蓮教授鑒定均為正品藥材(符合《中華人民共和國藥典》2015年版規(guī)定)。白芷Angelicadahurica(Fisch.ex Hoffm.)Benth.et Hook.f.產(chǎn)地四川；白術(shù)AtractylodesmacrocephalaKoidz.產(chǎn)地浙江；白附子TyphoniumgiganteumEngl.產(chǎn)地河南。所有藥材先用蒸餾水洗去塵土，80 ℃烘干6 h備用。

3 方法與結(jié)果

3.1 中藥提取物的制備

各中藥提取物中浸出物含量應(yīng)符合《中華人民共和國藥典》2015年版中的相關(guān)規(guī)定。

3.1.1中藥水提液的制備 準(zhǔn)確稱取各中藥10.00 g，加水150 mL，浸泡30 min，大火煎煮至沸，改用文火微沸30 min，用4層紗布濾過，得濾液。濾渣再加水100 mL，煎煮2次，每次20 min，合并3次濾液。濃縮至約50 mL，靜置，次日8000 r·min-1高速離心(離心半徑為10 cm)30 min，取上清液定容于50 mL的量瓶中，制成相當(dāng)于生藥0.2 g·mL-1的溶液待用，用時(shí)稀釋10倍，相當(dāng)于生藥0.02 g·mL-1。

3.1.2中藥醇提液的制備 準(zhǔn)確稱取各中藥10.00 g，加入適量70%的乙醇，50 ℃超聲1 h，趁熱濾過，取濾液，倒入量筒中，量取體積，加入3倍量的無水乙醇，沉淀24 h。然后將提取物放入離心機(jī)4500 r·min-1(離心半徑為16 cm)離心30 min，取上清液，放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中，50 ℃蒸至無醇味，定容至50 mL量瓶中，制成相當(dāng)于生藥0.2 g·mL-1的溶液待用，用時(shí)稀釋10倍，相當(dāng)于生藥0.02 g·mL-1。

3.2 L-多巴的制備

精密稱取L-多巴0.148 g，加入pH 6.8的磷酸鹽緩沖液(PBS)定容至100 mL，備用。分別取上述配制好的L-多巴1、2、3、4、5、6 mL定容至10 mL量瓶中，備用。

3.3 酪氨酸酶的制備

參照文獻(xiàn)[3]方法，進(jìn)行酪氨酸酶的制備。新鮮土豆去皮，洗凈，切塊，稱取土豆10 g，待用。研缽洗凈，取pH 6.8的PBS 10 mL，全部放入冰箱中-20 ℃冷凍30 min，取出，將冷凍好的土豆和冷凍過的PBS放在一起，搗碎，于離心機(jī)中4500 r·min-1(離心半徑為16 cm)離心10 min，取上清液，定容至100 mL量瓶中，即得酪氨酸酶溶液，現(xiàn)配現(xiàn)用。

3.4 吸收波長的考察

精密量取pH 6.8的PBS 1 mL、L-多巴1 mL、純化水1 mL、酪氨酸酶溶液1 mL于試管中，常溫反應(yīng)40 min，得反應(yīng)液，對該反應(yīng)液、L-多巴及酪氨酸酶溶液這3種溶液進(jìn)行全波長掃描，測定吸光度(A)。結(jié)果見圖1。在本實(shí)驗(yàn)條件下，L-多巴和酪氨酸酶反應(yīng)后在475 nm處有最大吸收峰，而此時(shí)L-多巴和酪氨酸酶本身的吸收均較小，故選擇475 nm為檢測波長。

圖1 L-多巴、酪氨酸酶反應(yīng)前后的紫外吸收光譜

3.5 反應(yīng)時(shí)間的考察

精密量取pH 6.8的PBS 1 mL、L-多巴1 mL、純化水1 mL、酪氨酸酶溶液1 mL于試管中，考察反應(yīng)不同時(shí)間(10、20、30、40、50、60 min)，反應(yīng)物在475 nm處的A，結(jié)果見圖2。表明當(dāng)反應(yīng)時(shí)間為40 min時(shí)，A最大，故選擇常溫反應(yīng)40 min。

圖2 酪氨酸酶催化氧化L-多巴反應(yīng)時(shí)間的考察

3.6 精密度試驗(yàn)

精密吸取pH 6.8的PBS 1 mL、L-多巴1 mL、純化水1 mL、酪氨酸酶溶液1 mL于試管中，按照實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行測定，分別測量6次，記錄A，其RSD為0.42%，表明該方法的精密度良好。

3.7 重復(fù)性試驗(yàn)

精密吸取6份同質(zhì)量濃度的白芷水提液1 mL，按3.4項(xiàng)下的方法操作，分別記錄其3、4組的A，其RSD分別為0.68%、1.53%，表明該方法重復(fù)性良好。

3.8 線性關(guān)系的考察

精密吸取pH 6.8的PBS緩沖液1 mL，不同濃度的L-多巴溶液1 mL、純化水1 mL、酪氨酸酶溶液1 mL于試管中，用紫外分光光度法在475 nm下測定A，以L-多巴溶液的濃度為橫坐標(biāo)X，A為縱坐標(biāo)Y繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。在試驗(yàn)條件下，L-多巴溶液濃度為0.75～4.51 mmol·L-1時(shí)符合比爾定律，線性回歸方程為Y=0.117 9X+0.271，r=0.999 3。

3.9 白芷、白術(shù)、白附子3種中藥提取物對酪氨酸酶抑制作用的比較

如表1所示，精密量取PBS 1 mL、L-多巴1 mL、純化水1 mL、酪氨酸酶1 mL于試管中，常溫下反應(yīng)40 min，于475 nm處測吸收值，記為A1。A1值即為在本實(shí)驗(yàn)方法下加入中藥提取液之前L-多巴在酪氨酸酶的作用下反應(yīng)后所得產(chǎn)物的吸收值。精密量取PBS 1 mL、L-多巴1 mL、純化水2 mL于試管中，常溫下反應(yīng)40 min，于475 nm處測吸收值，記為A2。A2值即為在本實(shí)驗(yàn)方法下L-多巴和酪氨酸酶反應(yīng)前可能產(chǎn)生的吸收值。精密量取PBS 1 mL、L-多巴1 mL、中藥提取液1 mL、酪氨酸酶1 mL于試管中，常溫下反應(yīng)40 min，于475 nm處測吸收值，記為A3。A3值即為在本實(shí)驗(yàn)方法下加入中藥提取液之后L-多巴在酪氨酸酶的作用下反應(yīng)后所得產(chǎn)物的吸收值。精密量取PBS 1 mL、L-多巴1 mL、純化水1 mL、中藥提取液1 mL于試管中，常溫下反應(yīng)40 min，于475 nm處測吸收值，記為A4。A4值即為在本實(shí)驗(yàn)方法下加入中藥提取液之后但未加酪氨酸酶時(shí)可能產(chǎn)生的吸收值。按公式(1)計(jì)算中藥提取液對酪氨酸酶的抑制率(IR)。

表1 酪氨酸酶活性抑制實(shí)驗(yàn)反應(yīng)體系 mL

IR=[(A1-A2)-(A3-A4)]/(A1-A2)]×100%

(1)

3.9.1白芷、白術(shù)、白附子水提液對酪氨酸酶抑制作用的比較 按表1方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分別對未加入中藥提取液及加入白芷、白術(shù)、白附子水提液后酪氨酸酶催化L-多巴的反應(yīng)后產(chǎn)物進(jìn)行全波長掃描，結(jié)果見圖3。結(jié)果表明，加入白芷、白術(shù)和白附子水提液后在475 nm處的A均有所降低，其中白芷水提液加入后降低最多。

圖3 加入中藥水提液前后的紫外吸收光譜

3.9.2白芷、白術(shù)、白附子醇提液對酪氨酸酶抑制作用的比較 按表1方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，分別對未加入中藥提取液及加入白芷、白術(shù)、白附子醇提液后酪氨酸酶催化L-多巴的反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行全波長掃描，結(jié)果見圖4。結(jié)果表明，加入白芷、白術(shù)和白附子醇提液后在475 nm處的A均有所降低，其中白芷醇提液加入后降低最多。

圖4 加入中藥醇提液前后的紫外吸收光譜

3.9.3白芷、白術(shù)、白附子各水提液和醇提液對酪氨酸酶抑制作用的比較 按表1方法分別測定了加入白芷、白術(shù)、白附子水提液和白芷、白術(shù)、白附子醇提液前后酪氨酸酶催化L-多巴的反應(yīng)產(chǎn)物在475 nm處的A，結(jié)果見表2。

表2 各中藥提取液對酪氨酸酶的抑制作用

4 討論與展望

本研究就歷代醫(yī)家喜用的美白中藥白芷、白術(shù)、白附子在同一實(shí)驗(yàn)方法下測定了其各自水提液和醇提液對酪氨酸酶的抑制作用，結(jié)果表明，白芷對酪氨酸酶的抑制作用的確是這三者中最高的。該研究方法簡單易行，可以對比多種中藥提取物對酪氨酸酶的抑制作用，從而篩選出可能具有美白作用的中藥，進(jìn)一步分離可以追蹤到活性較好、安全性較高的天然美白活性成分，為中藥美容美白的研究提供了參考。