應(yīng)珂，王建方，查慧軍，鄭亞純，金漢臺，姚建標(biāo)*

1.浙江康恩貝制藥股份有限公司/浙江省中藥制藥技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310052；2.浙江康恩貝中藥有限公司，浙江 麗水 323400

復(fù)方魚腥草合劑是由魚腥草、黃芩、板藍(lán)根、連翹、金銀花經(jīng)提取、濃縮、醇沉、配制等步驟制備而成，具有清熱解毒的功效，用于外感風(fēng)熱所致的急喉痹、急乳蛾，癥見咽部紅腫、咽痛；急性咽炎、急性扁桃體炎見上述證候者[1]?，F(xiàn)代臨床研究表明，復(fù)方魚腥草合劑可用于小兒急性上呼吸道感染[2-3]、手足口病[4-5]、流行性腮腺炎[6]、兒童皰疹性咽峽炎[7]等疾病的治療。

復(fù)方魚腥草合劑的執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)是國家食品藥品監(jiān)督管理局頒布的國家藥品標(biāo)準(zhǔn)[WS-10821(ZD-0821)-2002-2012Z]，其中檢驗(yàn)內(nèi)容主要包括對魚腥草、黃芩的薄層鑒別項(xiàng)，相對密度、pH等檢查項(xiàng)，黃芩苷含量測定項(xiàng)，無法對制劑整體質(zhì)量進(jìn)行客觀評價(jià)，目前也沒有相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道相關(guān)方法。

本研究采用HPLC，根據(jù)《中國人民共和國藥典》2015年版通則[8]要求，進(jìn)行多成分指紋圖譜研究，建立復(fù)方魚腥草合劑的指紋圖譜，并對主要的色譜峰進(jìn)行歸屬性研究，采用國家藥典委員會推薦的“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)”(2012.130723版)進(jìn)行相似度評價(jià)，以此建立更全面可控的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，以更有效地控制制劑整體質(zhì)量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Shimadzu LC-20ADXR型高效液相色譜儀；Thermo UPLC-LTQ-Orbitrap型液質(zhì)聯(lián)用儀；MSA225S-1CE-DU型電子天平(德國賽多利斯，d=0.01 mg，max=220 g)；Milli-QA10型純水儀(密里博中國有限公司)；LG10-2.4A型高速離心機(jī)(北京京立離心機(jī)有限公司)。

1.2 試藥

復(fù)方魚腥草合劑(批號分別為A180244、B180155、180207、B180222、A180105，浙江康恩貝中藥有限公司)；復(fù)方魚腥草合劑(批號分別為180308、180305、180122、180414、180125，浙江惠松制藥有限公司)；復(fù)方魚腥草合劑(批號分別為180500501、V171105、180100701、180403102、180502401，浙江國鏡藥業(yè)有限公司)；5-羥甲基糠醛對照品(批號：111626-201610)、苯甲酸鈉對照品(批號：100433-200301)、羥苯乙酯對照品(批號：100847-201604)、槲皮苷對照品(批號：111538-200504)、黃芩苷對照品(批號：110715-201318)、漢黃芩苷對照品(批號：112002-201702)、漢黃芩素對照品(批號：111514-201706)、連翹酯苷A對照品(批號：111810-201707)、連翹苷對照品(批號：110821-200508)、綠原酸對照品(批號：110753-201817)、魚腥草對照藥材(批號：121046-201607)、黃芩對照藥材(批號：120955-201810)、板藍(lán)根對照藥材(批號：121177-201608)、連翹對照藥材(批號：120908-201216)、金銀花對照藥材(批號：121060-201608)均由中國食品藥品檢定研究院提供；連翹酯苷E對照品(成都曼斯特科技有限公司，批號：DST180412-083)；隱綠原酸對照品(上海源葉生物科技有限公司，批號：Y12O8H45678)；甲醇為色譜純；水為超純水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液的制備

取本品，5000 r·min-1離心5 min(離心半徑為8.5 cm)，取上清液，即得。

2.2 單味藥溶液的制備

參照復(fù)方魚腥草合劑制備工藝，分別制備方中各單味藥材的單味藥制劑，即得。

2.3 對照品溶液的制備

精密稱取5-羥甲基糠醛、苯甲酸鈉、羥苯乙酯、槲皮苷、黃芩苷、漢黃芩苷、漢黃芩素、連翹酯苷A、連翹苷、綠原酸對照品適量，分別置量瓶中，加50%甲醇制成0.1 mg·mL-1的溶液，即得。

2.4 指紋圖譜參照峰

所建立的指紋圖譜中，黃芩苷所示峰具有最大的峰面積、適中的保留時(shí)間以及穩(wěn)定的峰形，因此選擇此峰作為參照峰。在后續(xù)研究中，均以此峰作為參照，用來計(jì)算其余峰的相對峰面積及相對保留時(shí)間。

2.5 色譜條件

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(Besil 5 C18-B 250 mm×4.6 mm，5 μm)；以甲醇作為流動相A，以0.1%磷酸溶液作為流動相B，梯度洗脫(0～15 min，20%～30%A；15～40 min，30%～55%A；40～45 min，55%～65%A；45～50 min，65%～80%A；50～55 min，80%A)；檢測波長為210 nm，柱溫為40 ℃，進(jìn)樣量為5 μL，流速為1.0 mL·min-1。

2.6 UPLC-LTQ-Orbitrap分析條件

以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑(Besil 5 C18-B 250 mm×4.6 mm，5 μm)；以甲醇作為流動相A，以0.1%甲酸溶液作為流動相B，梯度洗脫(0～15 min，20%～30%A；15～40 min，30%～55%A；40～45 min，55%～65%A；45～50 min，65%～80%A；50～55 min，80%A)；檢測波長為210 nm，柱溫為40 ℃，進(jìn)樣量為5 μL，流速為1.0 mL·min-1。

電噴霧離子源(ESI)，負(fù)離子模式檢測，加熱溫度為350 ℃，鞘氣流速為12 L·min-1，輔助氣流速為3 L·min-1，吹掃氣流速為0 L·min-1，噴霧電壓為3.20 kV，離子傳輸管溫度為325 ℃。鞘氣和輔助氣均為高純氮?dú)?純度≥99.99%)，碰撞氣為高純氦氣；采用傅里葉變換高分辨全掃描方式，質(zhì)量掃描范圍m/z50～1200；多級質(zhì)譜采用數(shù)據(jù)依賴式掃描，誘導(dǎo)碰撞解離(CID)模式，碰撞能為35 V。

2.7 方法學(xué)驗(yàn)證

2.7.1精密度試驗(yàn) 取復(fù)方魚腥草合劑(批號：A180244)樣品，根據(jù)2.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，使用2.5項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣檢測6次，記錄色譜圖，以6針平均值為模板計(jì)算其相似度，結(jié)果各圖譜共有峰與對照指紋圖譜相似度均達(dá)1.000，表明本方法儀器精密度良好。

2.7.2重復(fù)性試驗(yàn) 取復(fù)方魚腥草合劑(批號：A180244)樣品，根據(jù)2.1項(xiàng)下方法制備6份供試品溶液，使用2.5項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，以6份平均值為模板計(jì)算其相似度，結(jié)果各圖譜共有峰的相似度均達(dá)0.999以上，表明本方法重復(fù)性良好。

2.7.3穩(wěn)定性試驗(yàn) 取復(fù)方魚腥草合劑(批號：A180244)樣品，根據(jù)2.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于0、6、12、24 h使用2.5項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，以不同時(shí)間點(diǎn)的平均值為模板計(jì)算其相似度，結(jié)果各圖譜共有峰的相似度均達(dá)1.000，表明供試品溶液在室溫下放置24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 對照指紋圖譜的建立

2.8.1對照模板及相似度 選取15批復(fù)方魚腥草合劑樣品，根據(jù)2.1項(xiàng)下方法分別制備供試品溶液，使用2.5項(xiàng)下色譜條件測定，將所得色譜圖導(dǎo)入到“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)”(2012.130723版)，使用平均數(shù)法生成復(fù)方魚腥草合劑指紋圖譜的對照模板，見圖1。

圖1 復(fù)方魚腥草合劑對照指紋圖譜

取15批復(fù)方魚腥草合劑樣品，根據(jù)2.1項(xiàng)下方法分別制備供試品溶液，使用2.5項(xiàng)下色譜條件測定，將所得色譜圖與對照模板一同導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)”(2012.130723版)，以對照模板作為參照圖譜，設(shè)相似度為1.000，計(jì)算15批復(fù)方魚腥草合劑的相似度，結(jié)果見表1、圖2。

表1 復(fù)方魚腥草合劑樣品相似度測定結(jié)果

圖2 復(fù)方魚腥草合劑樣品相似度測定色譜圖

經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，此15批復(fù)方魚腥草合劑的指紋圖譜相似度均大于0.95，表明本方法穩(wěn)定、可行，所得到的復(fù)方魚腥草合劑的指紋圖譜相似度良好。

2.8.2共有峰歸屬 取15批復(fù)方魚腥草合劑樣品，以及根據(jù)2.1～2.3項(xiàng)下方法分別制備的供試品溶液、單味藥溶液對照品溶液，使用2.5項(xiàng)下色譜條件下測定，將所得色譜圖進(jìn)行對比。結(jié)合質(zhì)譜數(shù)據(jù)，確定了16個(gè)共有峰，并對其進(jìn)行歸屬。

對成分進(jìn)行分析，5-羥甲基糠醛可能來源于輔料煉蜜；苯甲酸鈉和羥苯乙酯為添加的輔料；通過對照品比對，歸屬于魚腥草的為槲皮苷；歸屬于黃芩的為黃芩苷、漢黃芩苷和漢黃芩素；歸屬于連翹的為連翹酯苷E、連翹酯苷A和連翹苷；歸屬于金銀花的為綠原酸和隱綠原酸；樣品中無歸屬于板藍(lán)根的化合物，16個(gè)化合物的歸屬見圖3、表2。

表2 復(fù)方魚腥草合劑HPLC指紋圖譜共有峰的指紋與歸屬

3 討論

本實(shí)驗(yàn)建立了復(fù)方魚腥草合劑的HPLC指紋圖譜，并且鑒定了16個(gè)共有峰，通過對照品確認(rèn)了其中9個(gè)峰的化學(xué)本質(zhì)，分別為綠原酸、隱綠原酸、苯甲酸鈉、連翹脂苷A、槲皮苷、羥苯乙酯、黃芩苷、漢黃芩苷、漢黃芩素。同時(shí)測定了15批復(fù)方魚腥草合劑的指紋圖譜，其相似度高，表明此方法可以作為復(fù)方魚腥草合劑質(zhì)控的依據(jù)。

該指紋圖譜的共有峰中，5-羥甲基糠醛可能來源于輔料煉蜜，防腐劑苯甲酸鈉和羥苯乙酯響應(yīng)均較大，且屬于輔料，擬在合成對照指紋圖譜中扣除上述3個(gè)色譜峰。另外，由于黃芩藥材中的黃芩苷含量較高，峰響應(yīng)較強(qiáng)，對指紋圖譜的建立影響較大。故在建立對照指紋圖譜模板時(shí)，扣除5-羥甲基糠醛、苯甲酸鈉、羥苯乙酯和黃芩苷色譜峰。

考慮到本制劑中主要成分為酚酸類和黃酮類，選擇使用酸溶液作為水相。本方法考察了不同濃度的甲酸水溶液、磷酸水溶液作為水相，結(jié)果顯示，0.1%磷酸水溶液有較好的洗脫和分離能力，故選擇其為水相。同時(shí)比較了甲醇和乙腈2種有機(jī)相，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，甲醇可以較好地洗脫和分離樣品，故選擇甲醇為有機(jī)相。

復(fù)方魚腥草合劑由5種中藥組合而成，物質(zhì)成分較為復(fù)雜，所以采用光電二極管陣列檢測器(PDA)在200～400 nm對復(fù)方魚腥草合劑的供試品溶液進(jìn)行紫外掃描檢測，結(jié)果供試品在210 nm檢測波長下色譜峰信息量較大，各成分較穩(wěn)定，分離效果較好，且魚腥草中特征性成分槲皮苷響應(yīng)較大，故選擇210 nm作為測定波長[9]。此外，本實(shí)驗(yàn)比較了3種不同的色譜柱(Besil 5 C18-B、Kromasil C18、資生堂Capcellpak C18，規(guī)格均為250 mm×4.6 mm，5 μm)和不同柱溫對特征峰分離度的影響，最終確定為Besil 5 C18-B，柱溫40 ℃。

指紋圖譜是一種能較為全面地呈現(xiàn)出樣品復(fù)雜性的方法[10]，近年來被廣泛應(yīng)用于中藥研究的質(zhì)量控制和評價(jià)[11-12]，具有整體性、模糊性、專屬性等特點(diǎn)[13]。結(jié)果表明，3個(gè)廠家15批復(fù)方魚腥草合劑HPLC指紋圖譜相似度均大于0.95，具有較好的一致性。綜上所述，本研究建立了復(fù)方魚腥草合劑的HPLC指紋圖譜，該方法樣品處理簡便、色譜條件簡單、結(jié)果準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可以作為復(fù)方魚腥草合劑質(zhì)量控制的方法之一。