徐秀蘭，尚興樸，馬麗娟，蘆鈺，王玉璽，邱艷紅，張海軍，吳萍*

1.北京市農林科學院 蔬菜研究中心，北京 100097；2.中國中藥有限公司，北京 100195；3.河北科技師范學院 農學與生物科技系，河北 秦皇島 066004；4.中國農業(yè)大學 植物保護學院，北京 100093

甘草GlycyrrhizauralensisFisch以根和根莖入藥，具有補脾益氣、祛痰止咳、緩急止痛等功效，能調和百草，素有“十方九草”之美譽，是我國市場需求旺盛的中藥[1]。野生甘草多生長于三北地區(qū)[2]，是構成我國北方荒漠植被的重要植物，具備生態(tài)和經濟的雙重價值，對環(huán)境資源保護起著不可替代的作用[3]。甘草不僅廣泛應用于中醫(yī)臨床，其制品甘草浸膏、甘草酸粉鹽等在食品、保健品、化妝品、煙草、輕工等許多行業(yè)也備受青睞，國際市場的需求量日益增長。2016年，我國甘草及制品的進口量為2.8萬t，進口額達37 000萬美元[4]。

甘草病害的發(fā)生及危害一直都是影響甘草產量及其品質最主要的限制因素。據報道，目前我國甘草主要病害包括銹病、根腐病、褐斑病、白粉病、猝倒病和立枯病等真菌性病害[5]。種子藥劑處理是提高播種品質和防治種傳病害最簡單、經濟有效的方法[6]。本研究旨在對甘草種子進行內外部攜帶真菌檢測，并對種傳真菌的致病性進行測試，為甘草種子藥劑處理預防種傳病害提供基礎數據。

1 材料與方法

1.1 材料

CTAB植物基因組DNA快速提取試劑盒(批號：DL114-01，博邁德生物有限公司)；乳酸葡萄糖培養(yǎng)基(aPDA，批號：BCBN5254V，Fluka公司)；乳酸(批號：20180312，福晨化學試劑有限公司)；98%硫酸溶液(批號：20160318，光復科技發(fā)展有限公司)。

Centrifuge 5424 R型高速離心機、Centrifuge 5810 R型高速離心機、MLX-204型瞬時離心機(Eppendorf中國有限公司)；XT5408-GC380TL2型光照培養(yǎng)箱(杭州雪中炭恒溫技術有限公司)；T110型PCR儀(Bio-Rad公司)；LDZF-50KB型滅菌鍋(上海博訊醫(yī)療生物儀器股份有限公司)；ShockMixer-1型脈沖震蕩樣品前處理器(廣東環(huán)凱微生物科技有限公司)。

4個批次來自不同產區(qū)的甘草種子樣品，未經任何加工處理于常溫下在編織袋中保存。樣品為中國中藥有限公司提供，由中國中藥有限公司王繼永研究員鑒定為GlycyrrhizauralensisFisch的種子。4個批次的種子均收獲于2018年。批次A產自新疆維吾爾自治區(qū)焉耆縣；批次B產自新疆維吾爾自治區(qū)阿勒泰地區(qū)；批次C產自內蒙古自治區(qū)赤峰市；批次D產自甘肅省會寧縣。種子樣品扦取參考InternationalRulesforSeedTesting第2章扦樣，在隨機選取的不同種子袋中抽取等量初次樣品，混合后為送檢樣品[7]。

1.2 方法

1.2.1種子外部帶菌檢測 隨機選取4個批次甘草種子各10 g(1000粒)分別放入均質袋內，加入無菌水20 mL拍打60 s，吸取全部懸浮液，12 000 r·min-1離心10 min(離心半徑為16 cm)，除去上清液，加入1 mL無菌水均勻懸浮沉淀，取適量懸浮液進行梯度稀釋，分別稀釋1×10-1、1×10-2、1×10-3、1×10-4，每個稀釋梯度菌懸液吸取100 μL均勻涂布到aPDA培養(yǎng)基上，每個濃度重復3次，置于28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)2～3 d，觀察記錄平板上的菌落總數，根據稀釋倍數和檢測種子數計算種子外部攜帶的孢子負荷量和檢出真菌的分離比例。每個供試種子批次重復4次。

孢子負荷量=3皿菌落總數/0.3 mL×稀釋倍數/1000

(1)

分離比例=(某類真菌菌落個數/菌落總數)×100%

(2)

1.2.2種子內部帶菌檢測 4個批次甘草種子樣品隨機選取100粒種子作為1個重復，用75%乙醇浸泡30 s，1%次氯酸鈉溶液浸泡3 min，然后用無菌水沖洗3次，晾干，將種子均勻擺放在aPDA平板上，每個平板上擺放20粒，共5皿，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)2～3 d，觀察并記錄平板上的菌落總數并拍照，每個供試品種批次設置4個重復。

隨機選取4個批次甘草各100粒，用98%硫酸浸泡50 min，然后用無菌水沖洗3次，晾干。將種子均勻擺放在aPDA平板上，每個平板上擺20粒，共5皿，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)2～3 d，觀察并記錄平板上的菌落總數并拍照，每個供試品種樣品重復4次。根據公式(3)～(4)計算種子帶菌率和分離頻率。

種子帶菌率=(帶菌種子數/檢測種子總數)×100%

(3)

分離頻率=(帶某類菌種子數/帶菌種子數)×100%

(4)

1.2.3真菌形態(tài)學鑒定 將分離到的不同種類的真菌轉移到aPDA培養(yǎng)基上進行純化，然后通過顯微鏡觀察菌絲和孢子的形態(tài)，結合真菌培養(yǎng)性狀和形態(tài)學特征，參考相關工具書和文獻鑒定到屬[8-10]。

1.2.4真菌分子鑒定 收集在aPDA培養(yǎng)基培養(yǎng)4 d的真菌菌絲至1.5 mL離心管中，分別編號，放入液氮中充分冷卻后取出研磨充分。采用核酸快速提取試劑盒，按照操作使用說明提取DNA，提取的DNA質量濃度稀釋到50 ng·μL-1，保存在-20 ℃。

以上述提取總DNA為模板，用真菌通用引物內轉錄間隔區(qū)(ITS)1/ITS4進行PCR擴增[11]。擴增體系為2×mix 2 μL，ITS1 2 μL，ITS4 2 μL，ddH2O 19 μL，檢測樣品 2 μL。PCR擴增程序為95 ℃預變性1 min，95 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，30個循環(huán)，72 ℃延伸10 min，終止溫度在4 ℃。反應結束后取5 μL產物進行瓊脂糖凝膠電泳，PCR產物測序，通過BLAST序列比對，鑒定到屬、種。

1.2.5甘草種子芽率與幼苗發(fā)病率測定 將甘草種子浸泡于98%硫酸 25 ℃處理50 min，至種皮表面破損出現均勻小點，在超凈工作臺上用無菌水洗凈晾干，取100粒播種于滅菌的基質中，設置4次重復，于7、14 d記錄種子發(fā)芽率，同時觀察并記錄幼苗發(fā)病情況。

1.2.6真菌致病性測定 將甘草幼苗每盆移植2株，放入光照(20 ℃，16 h光照，8 h黑暗)培養(yǎng)箱培養(yǎng)，在幼苗生長12 d時進行實驗。將純化的6個真菌菌株(曲霉、鏈格孢、毛霉、尖孢鐮刀菌、芽枝狀枝孢霉、立枯絲核菌)在aPDA培養(yǎng)基上28 ℃培養(yǎng)4～5 d，形成一定大小的菌落。用滅菌的打孔器在菌落靠近邊緣處打取菌餅(Φ=6 mm)，將菌餅貼附于甘草幼苗莖基部，每個菌株處理3株幼苗作為重復。對照組采用無菌的aPDA瓊脂塊(Φ=6 mm)貼附于甘草幼苗莖基部。接種完畢后將甘草幼苗放在光照培養(yǎng)箱中(25 ℃，16 h/8 h、光照/黑暗)繼續(xù)培養(yǎng)，觀察其發(fā)病情況。將上述處理后甘草幼苗的發(fā)病部位用75%酒精消毒，切取片段放入aPDA平板中培養(yǎng)，分離純化后按照1.2.3、1.2.4項下進行形態(tài)學、分子學鑒定。

2 結果與分析

2.1 種傳真菌鑒定

2.1.1種傳真菌形態(tài)學鑒定結果 如圖1所示，根據真菌的形態(tài)和在顯微鏡下菌絲與孢子的形態(tài)初步確定分離得到部分菌株為鏈格孢屬Alternariaspp.、青霉屬Penicilliumspp.和曲霉屬Aspergillusspp.真菌。

注：A.鏈格孢屬Alternaria sp.菌落形態(tài)；B.青霉屬Penicillium sp.菌落形態(tài)；C.曲霉屬Aspergillus sp.菌落形態(tài)；D.鏈格孢屬Alternaria sp.在顯微鏡下(10×20倍)分生孢子與菌絲形態(tài)；E.青霉屬Penicillium sp.在顯微鏡下(10×10倍)分生孢子與菌絲形態(tài)；F.曲霉屬Aspergillus sp.在顯微鏡下(10×10倍)分生孢子與孢子梗形態(tài)。圖1 分離真菌菌落形態(tài)及顯微形態(tài)

2.1.2種傳真菌分子鑒定結果 未能通過形態(tài)鑒定的菌株通過ITS測序在美國國立生物技術信息中心(NCBI)比對序列鑒定菌株有曲霉Aspergillussp.、互隔交鏈孢霉Alternariaalternata、毛霉Mucorsp.、立枯絲核菌Rhizoctoniasolani、芽枝狀枝孢霉Cladosporioides；種子內部攜帶尖孢鐮刀菌Fusariumoxysporum及互隔交鏈孢霉Alternariaalternata(見表1)。

表1 分離菌株ITS序列比對結果

2.2 甘草種子外部攜帶真菌種類

甘草種子外部帶菌檢測結果如表2所示，不同批次的甘草種子外部帶菌量差異較大，在所檢測的4批次中，批次A的外部帶菌量最高，每粒種子的平均孢子負荷量為7.1個，且與其他批次差異顯著。甘草種子外部主要攜帶的真菌有青霉屬Penicilliumspp.、曲霉屬Aspergillusspp.、鏈格孢屬Alternariaspp.、芽枝狀枝孢霉Cladosporiumcladosporioides、毛霉屬Mucorspp.、立枯絲核菌R.solani等。其中，致病菌有立枯絲核菌R.solani和曲霉Aspergillus。

表2 甘草種子外部帶菌檢測結果

2.3 甘草種子內部攜帶真菌種類

甘草種子內部攜帶真菌檢測結果如表3所示，不同批次的甘草種子內部帶菌率差異有統(tǒng)計學意義。批次A的內部帶菌率最高，為25%，與批次B和C差異有統(tǒng)計學意義，與批次D差異無統(tǒng)計學意義，甘草種子內部攜帶的真菌主要有青霉屬Penicilliumspp.、曲霉屬Aspergillusspp.、鏈格孢屬Alternariaspp.和尖孢鐮刀菌F.oxysporum。4個批次甘草種子均攜帶鏈格孢屬Alternariaspp.，批次A和C帶有青霉屬Penicilliumspp.，批次D有曲霉屬Aspergillusspp.。在批次A中還發(fā)現了尖孢鐮刀菌F.oxysporum，其中致病菌有尖孢鐮刀菌F.oxysporum和曲霉Aspergillus。

表3 甘草種子內部帶菌檢測結果 %

2.4 甘草種子外部帶菌量與內部帶菌率的相關性分析

甘草種子外部帶菌量與內部帶菌率相關性分析結果如圖2所示，甘草種子外部帶菌量與內部帶菌率呈正相關關系，甘草種子外部帶菌量越高，種子內部帶菌率就越高；種子外部帶菌量每升高1個/粒，種子內部帶菌率就增加2.965%。此外，3個批次的種子外部、內部均分離得到鏈格孢屬，分析發(fā)現種子外部鏈格孢屬量和內部鏈格孢屬帶菌率具有類似相關性(見圖3)，表明可通過種子外部帶菌量可以推測種子內部帶菌率情況。

圖2 甘草種子外部帶菌量與內部帶菌率的相關性

圖3 甘草種子外部與內部攜帶鏈格孢量的相關性

2.5 未處理和98%硫酸處理過的甘草種子發(fā)芽率比較結果

未處理和用98%硫酸處理過的甘草種子發(fā)芽率(見圖4)。用98%硫酸處理過的比未處理的甘草種子發(fā)芽率高，說明98%硫酸可以幫助打破甘草的種皮機械障礙促進種子發(fā)芽。用98%硫酸處理的甘草種子批次A、B、C、D的發(fā)芽率分別為100%、88%、74%、54%；不做處理的甘草種子批次A、B、C、D的發(fā)芽率分別為46%、10%、12%、12%。經差異性分析得出4個批次的甘草種子經98%硫酸處理后的發(fā)芽率均顯著高于未處理種子。

圖4 未處理和98%硫酸處理過的甘草種子發(fā)芽率(n=400)

2.6 98%硫酸處理對甘草種子幼苗發(fā)病率的影響

未處理和用98%硫酸處理過的甘草種子幼苗發(fā)病率不同(見圖5)，未處理的甘草種子幼苗發(fā)病率較高，其幼苗發(fā)病率分別為61%、11%、33%、40%；用98%硫酸處理大大降低了甘草種子幼苗的發(fā)病率，可以殺死其表面的部分真菌，其幼苗發(fā)病率分別是4%、0%、2.7%、7.1%。

圖5 未處理和98%硫酸處理過的甘草幼苗發(fā)病率(n=400)

2.7 真菌致病性檢測

將純化的真菌菌株(曲霉、鏈格孢、毛霉、尖孢鐮刀菌、芽枝狀枝孢霉、立枯絲核菌)回接到健壯甘草幼苗莖基部上，9 d后發(fā)現回接尖孢鐮刀菌、立枯絲核菌的甘草幼苗發(fā)生枯萎癥狀(見圖6)，將發(fā)病幼苗病變部位用75%乙醇消毒后放在aPDA平板上，2 d后發(fā)現接種立枯絲核菌、尖孢鐮刀菌的培養(yǎng)基上的菌落形態(tài)與所接種真菌的菌落形態(tài)一致。通過16 S ITS序列比對，確認分離菌株為接種菌株。通過接種試驗確認了種傳尖孢鐮刀菌、立枯絲核菌可引起甘草幼苗病害。

注：A.無菌aPDA接種的對照植株；B.立枯絲核菌 Rhizoctonia solani接種植株；C.尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum接種植株；D.立枯絲核菌 Rhizoctonia solani菌落形態(tài)；E.尖孢鐮刀菌Fusarium oxysporum菌落形態(tài)。圖6 甘草種子真菌致病性結果

3 結論與討論

本研究對4個不同批次的甘草種子進行內外部攜帶真菌檢測。結果表明，不同批次的種子帶菌量與真菌種類均有差異。雖然4個批次甘草種子經過了相同的加工與存儲過程，但是由于產自不同地區(qū)，種子的帶菌情況受到發(fā)育過程不同環(huán)境影響而不同。據相關報道，甘草種子攜帶的真菌主要有曲霉菌、青霉菌、根霉菌和鏈格孢菌[11]。本研究發(fā)現甘草種子攜帶的真菌還包括芽枝狀枝孢霉、毛霉屬、立枯絲核菌和尖孢鐮刀菌。甘草種子攜帶的真菌中鏈格孢菌所占的比例最高，同時進行了真菌致病性測定，經過接種幼苗后再分離發(fā)病植物組織，得到尖孢鐮刀菌、立枯絲核菌為致病菌。為進一步確認甘草種子可攜帶的致病真菌，下一步研究可開展相同產區(qū)不同種子批次，不同年份收獲種子批次帶菌檢測分析。

一般情況下，種子內部帶菌檢測采用次氯酸鈉消毒，而后將種子擺放在培養(yǎng)基上培養(yǎng)[12]。本研究由于使用次氯酸鈉消毒后種子培養(yǎng)時有大量細菌生長，干擾檢測，因此采用了98%硫酸處理后的種子進行內部帶菌檢測，消除了細菌的干擾，其攜帶的真菌并沒有被完全消滅，說明98%硫酸未能將甘草種子內部攜帶的真菌完全清除，在適宜的條件下也可用于種子外部消毒。

測定98%硫酸處理和未處理甘草種子的幼苗發(fā)芽率與發(fā)病率時發(fā)現，98%硫酸處理過的甘草幼苗發(fā)芽率顯著升高且發(fā)病率顯著降低，說明98%硫酸處理可以促進種子萌發(fā)并殺死甘草種子表面攜帶的部分真菌，降低甘草幼苗發(fā)病率。尤其是批次A的甘草種子用98%硫酸處理后發(fā)芽率達到100%，98%硫酸處理可使甘草種子種皮破損利于發(fā)芽[13]，發(fā)病率也顯著降低，可以作為推薦甘草種子處理方式。

此外，本研究發(fā)現，甘草種子外部帶菌量和內部帶菌率存在正相關關系，可以通過甘草種子外部帶菌量推測甘草種子內部帶菌率。研究結果可以為甘草種子藥劑處理預防種傳病害提供基礎數據。