趙玉洋，呂朝耕，何雅莉，郝校鵬，周利，楊健*

1.中國中醫(yī)科學院 中藥資源中心 道地藥材國家重點實驗室培育基地，北京 100700；2.河南中醫(yī)藥大學 藥學院，河南 鄭州 450008

鐵皮石斛藥材為蘭科植物鐵皮石斛DendrobiumofficinaleKimura et Migo的干燥莖[1]，食用及藥用歷史悠久，具有益胃生津、滋陰清熱作用，在民間被稱為“救命仙草”，《道藏》中尊其為“中華九大仙草”之首[2]?，F(xiàn)代研究表明，其主要成分包括多糖、黃酮、有機酸、石斛酚及多種無機元素[3-5]，具有增強免疫、抗疲勞、抗氧化、降血糖、降血壓、抗肝損傷、抗腫瘤等作用[6-7]。隨著人工栽培鐵皮石斛技術(shù)的成熟推廣，目前安徽、浙江、云南、廣東、廣西、福建等地均已實現(xiàn)鐵皮石斛的規(guī)模生產(chǎn)，但不同產(chǎn)地鐵皮石斛在產(chǎn)品質(zhì)量及市場價格等方面均存在較大差異。隨著道地性保護、地理標識和原產(chǎn)地保護制度的建立和完善，鐵皮石斛產(chǎn)地溯源的需求日益凸顯，而植物樣本中無機元素含量可以在一定程度上反映出其生境地理環(huán)境的信息[8]。因此，開展鐵皮石斛中無機元素的檢測及其與樣品產(chǎn)地的相關(guān)性分析研究具有積極的意義。

電感耦合等離子體質(zhì)譜(inductively coupled plasma-mass spectrometry，ICP-MS)法因其具有高靈敏度和準確性而被廣泛應(yīng)用于食品、中藥、水土環(huán)境等樣本中痕量元素的含量檢測[9-12]。本研究采用微波消解-ICP-MS技術(shù)，結(jié)合多元統(tǒng)計分析方法，對我國6個省11個不同產(chǎn)地的鐵皮石斛無機元素進行檢測分析，以期為鐵皮石斛藥材的質(zhì)量控制及產(chǎn)地溯源相關(guān)的地理標志保護等提供依據(jù)。

1 材料

1.1 藥材

11個不同產(chǎn)地鐵皮石斛樣品于2015年10月—2016年11月采集(見表1)，每個產(chǎn)地7個批次。樣品經(jīng)中國中醫(yī)科學院中藥資源中心金艷副研究員鑒定為蘭科植物鐵皮石斛DendrobiumofficinaleKimura et Migo的干燥莖。經(jīng)MM400型混合球磨儀粉碎后過60目篩，干燥條件下貯存?zhèn)溆谩?/p>

表1 鐵皮石斛采樣地和樣品信息

1.2 儀器與試劑

ICAP-Q型電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(美國Thermo Fisher科技公司)；MARS6型微波消解儀(美國CEM公司)；AUW120D型電子天平(日本島津公司)；MM400型混合球磨儀(德國Retsch公司)；DST-1000型酸純化器(美國Savillex公司)；Mill-Q型超純水機(德國Millipore公司)；混合對照品溶液Muti-element Solution 1和Muti-element Solution 2(美國SPEX Certi Perp公司，批號：XPNCN-17-100)；內(nèi)標溶液為10 μg·mL-1的Rh溶液稀釋1000倍(鋼研納克檢測技術(shù)股份有限公司，批號：NCS141058-2017)；由酸純化器二次純化的分析級硝酸(德國Merck公司)；分析級過氧化氫溶液(天津市大茂化學試劑廠)。

2 方法與結(jié)果

2.1 ICP-MS條件

射頻功率為15 500 W，采樣深度為5.0 mm；輔助氣和載氣均為氬氣，流速分別為0.8、1.05 L·min-1；冷氣流流速為14.0 L·min-1；霧化器類型為同心霧化器；霧化室溫度為2 ℃；掃描方式為STD模式；采集點和重復次數(shù)均為3次。

2.2 溶液制備

2.2.1混合對照品溶液制備 精密量取各混合對照品溶液適量，用2%硝酸溶液稀釋，制成各元素質(zhì)量濃度均為10 μg·mL-1的混合對照品儲備液，4 ℃貯存?zhèn)溆茫罄m(xù)進一步稀釋成適當質(zhì)量濃度的混合對照品溶液。

2.2.2供試品溶液制備 精確稱取鐵皮石斛藥材粉末0.1 g，置于聚四氟乙烯微波消解罐中，分別加入過氧化氫溶液1 mL和硝酸5 mL，密閉消解罐，置于微波消解儀中消解，消解程序：6 min升溫至100 ℃ 保持3 min；7 min升溫至160 ℃ 保持4 min；6 min升溫至190 ℃ 保持30 min。消解完全后，待樣品稍冷卻，將消解內(nèi)罐置電熱板上180 ℃趕酸至剩余1 mL，自然冷卻，用超純水定容至10 mL，混勻，過0.45 μm微孔濾膜，即得待測供試品溶液。分別精密量取上述供試品溶液1 mL至10 mL(K、Ca、Mg)或100 mL(Na)量瓶中，以超純水定容，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，即得Na元素和K、Ca、Mg元素供試品溶液。按相同方法制備空白對照溶液。

2.3 方法學考察

2.3.1線性關(guān)系考察 分別精密量取混合對照品儲備液適量，加2%硝酸溶液稀釋，分別配成K、Ca、Na、Mg質(zhì)量濃度為20、50、100、200、500、1000、2000 ng·mL-1的溶液；Zn、Mn、Rb、Fe質(zhì)量濃度分別為1、2、5、10、50、100、200、500 ng·mL-1溶液；Li、V、Cr、Co、Ni、Cu、Ga、As、Sr、Cd、Cs、Ba、La、Nd、Tl、Pb質(zhì)量濃度分別為0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、50.0 ng·mL-1系列混合對照品溶液。按2.1項下條件進樣檢測，以質(zhì)量濃度為橫坐標，計數(shù)比率為縱坐標，繪制標準曲線(見表2)。將混合對照品溶液逐步稀釋，直至各元素信號值為空白溶液信號值的3倍和10倍左右，此時各元素的質(zhì)量濃度即分別為該元素的檢測限(LOD)和定量限(LOQ)。

表2 24種無機元素的標準曲線及線性范圍

2.3.2精密度考察 精密吸取同一混合對照品溶液，按照2.1項下條件分別連續(xù)進樣6次，計算各元素響應(yīng)信號值RSD。結(jié)果顯示，各元素響應(yīng)信號值RSD均小于3%，表明儀器精密度良好。

2.3.3穩(wěn)定性考察 取同一份鐵皮石斛供試品溶液，分別于0、2、4、8、12、18、24 h按2.1項下條件進樣測定，記錄各元素響應(yīng)信號值，計算不同時間點間各元素計數(shù)比率值的RSD。結(jié)果各元素RSD值均小于3.5%，表明供試品溶液在24 h內(nèi)能穩(wěn)定性良好。

2.3.4重復性考察 取同一鐵皮石斛樣品0.1 g，平行操作6份，測定并計算各元素含量。結(jié)果顯示，6份樣品中各元素含量的RSD在1.69%～8.85%，重復性良好，可以滿足檢測要求。

2.3.5加樣回收率試驗 取已知各元素含量的鐵皮石斛樣品0.1 g，加入各元素對照品儲備液適量，平行操作3份，采用與鐵皮石斛樣品相同的操作步驟和實驗條件進行加標回收實驗，測定并記錄各元素響應(yīng)信號值。結(jié)果顯示，各元素的平均加樣回收率為85.5%～122.3%，RSD均小于12%，表明在痕量分析的要求下，各元素回收率良好，表明該方法有效可行。

2.4 鐵皮石斛樣品檢測

精密稱取77批不同來源的鐵皮石斛樣品，按2.2.2項下方法制備供試品溶液，按照2.1項下條件進行含量測定。結(jié)果見表3。

表3結(jié)果表明，在測定的24種無機元素中，K元素平均含量最高，各產(chǎn)地樣品中質(zhì)量分數(shù)均在6000 mg·kg-1以上，最高達到15 724.80 mg·kg-1；各產(chǎn)地樣品中Ca和Mg元素質(zhì)量分數(shù)分別達到5000、1000 mg·kg-1以上；除浙江天臺樣品中Na元素質(zhì)量分數(shù)達到1 386.40 mg·kg-1外，各產(chǎn)地樣品中Na元素質(zhì)量分數(shù)為200～400 mg·kg-1。此外，各鐵皮石斛樣品中Li、V、Cr、Co、Ni、Ga、As、Cd、La和Pb 10種無機元素的含量較低，均小于0.1 mg·kg-1。

表3 不同產(chǎn)地鐵皮石斛中24種元素的含量(n=7) mg·kg-1

就不同產(chǎn)地樣品間比較，Na、Mn、Cu、Zn、Sr、Ba 6種元素在不同樣品間含量變異系數(shù)較大，達到69.7%以上。進一步分析發(fā)現(xiàn)，Na元素含量差異主要由浙江天臺樣品遠高于其他產(chǎn)地樣品引起；Mn含量差異主要來源于廣西容縣和貴州施秉樣品，其質(zhì)量分數(shù)分別達到40.85、20.85 mg·kg-1，至少高出其他產(chǎn)區(qū)樣品含量一倍以上。Cu、Zn、Sr、Ba4種元素則表現(xiàn)出相對一致的規(guī)律，浙江5個產(chǎn)地樣品中的含量普遍低于除云南樣品外的其他各產(chǎn)地樣品，其中浙江樣品中Zn質(zhì)量分數(shù)僅為3～8 mg·kg-1，其他產(chǎn)區(qū)樣品達到35～80 mg·kg-1，相差達10倍以上；浙江樣品Cu元素質(zhì)量分數(shù)為0.87～2.07 mg·kg-1，其他產(chǎn)地為2.48～15.79 mg·kg-1；浙江樣品Sr和Ba質(zhì)量分數(shù)分別為0.82～1.44、0.55～1.16 mg·kg-1，其他產(chǎn)地樣品為1.92～6.12、1.13～4.66 mg·kg-1。此外，Li、Cr、Fe、Ga、As、Cd、Tl 7種元素含量變異系數(shù)均在15%以下，表明鐵皮石斛中這些元素含量較為穩(wěn)定，與產(chǎn)地環(huán)境變化相關(guān)性較低。就總元素質(zhì)量分數(shù)看，安徽霍山樣品最高，達26 060.10 mg·kg-1；其次是浙江天臺平橋鎮(zhèn)樣品，質(zhì)量分數(shù)為24 480.50 mg·kg-1，廣西容縣樣品的元素質(zhì)量分數(shù)也大于20 000 mg·kg-1；其他產(chǎn)地樣品間差異較小，約為15 000 mg·kg-1左右。總體就元素含量分析來看，不同產(chǎn)地鐵皮石斛樣品間表現(xiàn)出了一定差異，特別是Cu、Zn、Sr、Ba 4種元素可能作為區(qū)分浙江產(chǎn)鐵皮石斛與除云南外的其他產(chǎn)地樣品的指標?；诖?，后續(xù)研究進一步采用多元統(tǒng)計分析方法嘗試進行不同產(chǎn)地鐵皮石斛鑒別。

2.5 基于元素分析的不同產(chǎn)地鐵皮石斛主成分分析(PCA)

基于鐵皮石斛樣品中24種無機元素含量，對6個省份11個產(chǎn)地鐵皮石斛進行PCA，見圖1。結(jié)果表明，各產(chǎn)地樣品總體可實現(xiàn)分別聚類，其中浙江省內(nèi)各產(chǎn)地樣品可聚為一類，但與云南廣南樣本存在重疊；雖然同屬廣西省，但容縣和西林產(chǎn)鐵皮石斛樣本間距離較遠。但浙江省內(nèi)武義、樂清、天臺3地間距離均在200 km左右，而容縣和西林距離達到約700 km，這種地理距離的巨大差異可能是導致容縣與西林樣品間存在較大差異的原因。浙江樣品與云南樣品的重疊，表明云南與浙江產(chǎn)鐵皮石斛間確實存在一定相似性。作為鐵皮石斛的兩大規(guī)模產(chǎn)區(qū)，市場上云南產(chǎn)鐵皮石斛與浙江產(chǎn)鐵皮石斛價格相差可以達到數(shù)十倍以上，因此常有以云南產(chǎn)鐵皮石斛冒充浙江產(chǎn)鐵皮石斛的情況。此外，浙江省內(nèi)樣品間，浙江武義的2批樣品和浙江樂清的2批樣本分別可以實現(xiàn)聚類，種表明元素分析在大產(chǎn)地總體鑒別基礎(chǔ)上，對浙江省內(nèi)不同產(chǎn)地樣品間同樣具有一定鑒別能力。載荷圖(見圖1B)結(jié)果顯示，24種無機元素對石斛樣品產(chǎn)地區(qū)分的貢獻情況，其中距離坐標軸中心越遠的元素對分類結(jié)果的貢獻率越大，Ni、La、Ba、Zn、Sr、Mn、Ca、Mg、Cs、Cu、Nd、Rb 12種元素可能為不同產(chǎn)地鐵皮石斛聚類分布的特征貢獻因子。

注：A.PCA得分圖；B.載荷圖。圖1 鐵皮石斛樣品中24種無機元素的PCA得分圖和載荷圖

2.6 基于元素分析的不同產(chǎn)地鐵皮石斛聚類分析

基于明氏距離(Minkowski distance)進行相似性度量，分別以全部24種無機元素和PCA中得到的12種主要特征貢獻因子元素，對6個省份11個產(chǎn)地鐵皮石斛樣品進行聚類分析，見圖2。

由圖2A可知，以全部24種無機元素未能實現(xiàn)較好的聚類，浙江省內(nèi)各產(chǎn)地樣品未能聚為一類，且與廣西和貴州樣品距離相近，特別是浙江樂清大荊鎮(zhèn)樣品與其他樣品距離較遠。由圖2B可知，基于12種主要特征貢獻因子元素的聚類分析，在類間距離等于2.5時，即實現(xiàn)了浙江省5個小產(chǎn)區(qū)(浙江樂清大荊鎮(zhèn)、浙江樂清雁蕩鎮(zhèn)、浙江武義泉溪鎮(zhèn)、浙江武義白姆鄉(xiāng)和浙江天臺平橋鎮(zhèn))鐵皮石斛樣品的準確聚類。在更大類間距離上可以看到廣東和云南樣品與其他產(chǎn)地樣品差異較大，特別是與PCA結(jié)果相比，云南樣品與浙江樣品實現(xiàn)了區(qū)分。上述結(jié)果表明，無機元素含量測定結(jié)合多元統(tǒng)計分析對不同產(chǎn)地來源的鐵皮石斛樣品表現(xiàn)出一定的溯源潛力，特別是能夠?qū)φ憬a(chǎn)鐵皮石斛進行有效的判定。

注：A.基于24種元素含量的聚類分析；B.基于12種主要特征貢獻因子元素的聚類分析。圖2 不同產(chǎn)地鐵皮石斛樣品聚類分析譜系圖

3 結(jié)語

本研究建立了利用微波消解-ICP-MS技術(shù)的鐵皮石斛中24種無機元素含量測定方法，所建立方法準確、可靠。進一步應(yīng)用所建立方法對不同產(chǎn)地鐵皮石斛樣品進行測定，并結(jié)合多元統(tǒng)計分析方法嘗試進行不同產(chǎn)地鐵皮石斛樣品的產(chǎn)地溯源鑒別。PCA結(jié)果顯示，除浙江和云南樣品存在重疊外，各產(chǎn)地樣品可分別聚類，同時Ni、La、Ba、Zn、Sr、Mn、Ca、Mg、Cs、Cu、Nd和Rb 12種元素表現(xiàn)為不同產(chǎn)地鐵皮石斛樣品聚類的主要特征貢獻因子，進一步利用上述12種元素進行基于明氏距離的聚類分析，結(jié)果表明，無機元素含量測定結(jié)合多元統(tǒng)計分析對不同產(chǎn)地來源的鐵皮石斛樣品表現(xiàn)出一定的溯源潛力，特別是能夠?qū)φ憬a(chǎn)鐵皮石斛進行有效判定。本研究可為鐵皮石斛藥材的質(zhì)量控制及產(chǎn)地溯源相關(guān)的地理標志保護等提供技術(shù)支持和數(shù)據(jù)參考。