趙丹，張湘燕，羅振華，董旋，趙德剛*

1.貴州省人民醫(yī)院 呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科/貴州省呼吸疾病研究所，貴州 貴陽 550002；2.肺臟免疫性疾病診治國家衛(wèi)健委重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550002；3.貴州省人民醫(yī)院 中心實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550002；4.貴州大學(xué) 生物工程研究院/貴州大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，貴州 貴陽 550002

杜仲為杜仲科杜仲屬植物杜仲EucommiaulmoidesOliv.的干燥樹皮，味甘、微辛，性溫，可以降壓，利尿，緩解頭暈、失眠等癥狀，對各種細(xì)菌、真菌具有抑制作用，但具體機(jī)制尚不明確?？咕?antimicrobial peptides，AMPs)，又稱抗微生物肽或肽抗生素，是一類小分子的多肽類物質(zhì)，一般由10～60個氨基酸殘基組成，相對分子質(zhì)量在3000～6000[1]。抗菌肽廣泛分布于動物、植物等生物體內(nèi)，構(gòu)成了機(jī)體防御病原體快速而高效的屏障。本課題組前期研究證實(shí)，轉(zhuǎn)杜仲幾丁質(zhì)酶基因EuCHIT1的番茄可提高對灰霉病的抗性[2]。因此，推斷多肽EuCHIT1是杜仲中的抗菌肽之一。本研究在前期工作的基礎(chǔ)上，利用原核表達(dá)、鎳親和色譜法純化得到抗菌肽EuCHIT1，體外檢測其對白色念珠菌的抑菌作用，并探討其抑菌機(jī)制，為其進(jìn)一步的臨床應(yīng)用提供參考。

1 材料

1.1 菌株及細(xì)胞

白色念珠菌CanidiaalbicansATCC 10231，由貴州省人民醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室羅振華主任惠贈；SD大鼠肺組織WTRL1細(xì)胞購于美國模式菌種收集中心(ATCC)細(xì)胞庫。

1.2 試藥

沙堡氏(4%)葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(廣州市齊云生物技術(shù)有限公司)；氟康唑注射液(批號：2003070512)由辰星藥業(yè)有限公司生產(chǎn)；鄰硝基苯β-D-半乳吡喃糖苷(ONPG)購自上海仁捷生物科技有限公司；細(xì)胞膜熒光探針DiSC3(5)購自美國AAT Bioquest Inc公司；Triton X-100購自北京雷根生物公司；白細(xì)胞介素-1β(IL-1β)、IL-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)試劑盒購自武漢華美生物工程有限公司。

1.3 儀器

F-380型熒光分光光度計(jì)(天津港東科技股份有限公司)；Multiskan FC型酶標(biāo)儀(美國賽默飛公司)。

2 方法

2.1 菌株培養(yǎng)及多肽制備

白色念珠菌接種于沙堡氏(4%)葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)36 h后用于實(shí)驗(yàn)。參照本課題組前期實(shí)驗(yàn)方法[3]，通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增EuCHIT1蛋白的編碼區(qū)，構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化到大腸桿菌EscherichiacoliBL21 (DE3)，經(jīng)異丙基硫代半乳糖苷(IPTG)誘導(dǎo)，采用鎳親和色譜法純化得到可溶性的抗菌肽EuCHIT1。將其溶解在無菌注射液用水中，置于-20 ℃保存。

2.2 抑菌圈檢測

采用二倍最小抑菌濃度(MIC)法，配制質(zhì)量濃度分別為32、64、128、256、512 μg·mL-1的抗菌肽EuCHIT1溶液，各取10 μL依次點(diǎn)在含有細(xì)菌的培養(yǎng)基上。對照組加入等體積滅菌注射用水，陽性對照組加入注射用氟康唑(8 μg·mL-1，臨床治療中可達(dá)到的藥物濃度)[4]，28 ℃培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)后取出培養(yǎng)基，用鋼尺測量每個培養(yǎng)基上的抑菌圈直徑。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取平均值。

2.3 細(xì)胞膜去極化作用測定

取對數(shù)生長期白色念珠菌菌液(1×105CFU·mL-1)200 μL，4000 r·min-1離心5 min(離心半徑為10 cm)，收集菌體，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌3次后，重懸菌液至吸光度(A)值為0.05。分別加入2.2項(xiàng)下5種質(zhì)量濃度EuCHIT1溶液100 μL，以滅菌注射用水作為對照，注射用氟康唑(8 μg·mL-1)作為陽性對照，28 ℃處理60 min后向每組中加入終濃度為0.4 μmol·L-1的DiSC3(5)，室溫振蕩避光孵育15～30 min，取2 mL細(xì)菌懸浮液于石英比色皿中，利用熒光分光光度計(jì)，在激發(fā)波長為622 nm、發(fā)射波長為670 nm條件下測定熒光強(qiáng)度[5]。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.4 細(xì)胞膜通透性測定

取對數(shù)生長期白色念珠菌菌液(1×105CFU·mL-1)200 μL，4000 r·min-1離心5 min(離心半徑為10 cm)，收集菌體，PBS洗滌3次后，重懸菌液至A值為0.05。加入質(zhì)量濃度為32 μg·mL-1的抗菌肽EuCHIT1溶液100 μL，以滅菌注射用水作為對照，0.2% Triton X-100作為陽性對照，28 ℃處理60 min后向每組中加入1.5 mmol·mL-1的ONPG溶液100 μL，37 ℃孵育60 min后每間隔10 min于酶標(biāo)儀測定420 nm 處A值[6]。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5 (1，3)-β-D-葡聚糖及麥角甾醇含量測定

取對數(shù)生長期白色念珠菌菌液(1×105CFU·mL-1)200 μL，4000 r·min-1離心5 min(離心半徑為10 cm)，收集菌體，PBS洗滌3次后，重懸菌液至A值為0.05。加入質(zhì)量濃度為32 μg·mL-1的抗菌肽EuCHIT1溶液100 μL，以滅菌注射用水作為對照，以注射用氟康唑(8 μg·mL-1)作為陽性對照，室溫振蕩孵育15～30 min。通過鱟試驗(yàn)動態(tài)濁度法測定白色念珠菌中(1，3)-β-D-葡聚糖含量[7]；高效液相色譜法檢測麥角甾醇含量[8]。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.6 IL-1β、IL-6、TNF-α測定

取對數(shù)生長期白色念珠菌菌液(1×105CFU·mL-1)200 μL，4000 r·min-1離心5 min，收集菌體，PBS洗滌3次后，重懸菌液至A值為0.05。在WTRL1細(xì)胞中加入含10%胎牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基，置于含5%CO2的37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)生長期WTRL1細(xì)胞，在96孔板內(nèi)加入密度為1×105個/mL的WTRL1細(xì)胞，每孔100 μL，細(xì)胞貼壁后，每孔加入32 μg·mL-1的抗菌肽EuCHIT1溶液100 μL，終質(zhì)量濃度為16 μg·mL-1。以滅菌注射用水作為對照，以注射用氟康唑(8 μg·mL-1)作為陽性對照。5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱36 ℃培養(yǎng)180 min后，裂解液裂解細(xì)胞，按ELISA試劑盒步驟，于酶標(biāo)儀420 nm處測定A值，計(jì)算IL-1β、IL-6、TNF-α含量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié)果

3.1 抗菌肽EuCHIT1的原核表達(dá)與純化

原核表達(dá)、鎳親和色譜法純化得到多肽EuCHIT1，采用Bradford法定量，純度約80%，收率約0.7 mg·L-1，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)定性圖譜顯示EuCHIT1總相對分子質(zhì)量為77 210。

3.2 抑菌圈測定

結(jié)果顯示，隨著抗菌肽EuCHIT1質(zhì)量濃度的增加，對白色念珠菌的抑菌圈寬度逐漸增大，EuCHIT1 32、64、128、256、512 μg·mL-1對白色念珠菌的抑菌圈直徑分別為12.0、16.5、18.0、22.0、25.0 mm。陰性對照滅菌注射用水抑菌圈直徑為0 mm，陽性對照氟康唑抑菌圈直徑為25 mm。

3.3 抗菌肽EuCHIT1對白色念珠菌細(xì)胞膜的去極化作用

與對照組比較，陽性對照氟康唑?qū)?xì)胞膜去極化作用增強(qiáng)；隨著EuCHIT1質(zhì)量濃度的增加，其對細(xì)胞膜的去極化作用逐漸增強(qiáng)(P<0.05)，見表1。

表1 抗菌肽EuCHIT1對白色念珠菌細(xì)胞膜的去極化作用

3.4 抗菌肽EuCHIT1對白色念珠菌細(xì)胞膜通透性影響

與對照組比較，隨著抗菌肽EuCHIT1與白色念珠菌菌液作用時間延長，細(xì)菌細(xì)胞膜通透性逐漸增加，P<0.05。至60 min時，細(xì)胞膜通透性與陽性對照0.2% Triton X-100組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。結(jié)果見表2。

表2 不同濃度EuCHIT1對白色念珠菌細(xì)胞膜通透性的影響

3.5 抗菌肽EuCHIT1對白色念珠菌(1，3)-β-D-葡聚糖及麥角甾醇含量的影響

與對照組比較，抗菌肽EuCHIT1 32 μg·mL-1可顯著降低白色念珠菌中(1，3)-β-D-葡聚糖及麥角甾醇含量(P<0.05)，作用與氟康唑8 μg·mL-1相當(dāng)(見表3)。

表3 EuCHIT1對白色念珠菌(1，3)-β-D-葡聚糖及麥角甾醇含量的影響

3.6 抗菌肽EuCHIT1對感染白色念珠菌的WTRL1細(xì)胞中IL-1β、IL-6及TNF-α水平的影響

與模型組比較，抗菌肽EuCHIT1 16 μg·mL-1可顯著降低WTRL1細(xì)胞IL-6及TNF-α水平(P<0.05)，作用與氟康唑8 μg·mL-1相當(dāng)，與對照組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(見表4)。

表4 EuCHIT1對感染白色念珠菌的WTRL1細(xì)胞中IL-1β、IL-6及TNF-α水平的影響

4 討論

侵襲性真菌感染是臨床常見的感染性疾病之一，但是由于廣譜抗真菌藥物的濫用，導(dǎo)致臨床中真菌耐藥狀況日益加重[9-10]。因此，需要尋找適合臨床使用的新的抗真菌藥物。抗菌肽廣泛存在于動物、植物等生物體中，是宿主對抗外界病原微生物感染而產(chǎn)生的一系列免疫應(yīng)答反應(yīng)產(chǎn)物，研究表明，抗菌肽在感染性疾病的治療中具有重要的應(yīng)用價值[11-12]。杜仲含有木脂素類、環(huán)烯醚萜類、苯丙素類、黃酮類、多糖類等成分及多種抗真菌蛋白[13-15]。由于抗菌肽具有廣譜抗菌、抗被膜病毒、抗寄生蟲、抗腫瘤等作用，且不破壞人體正常細(xì)胞、不易產(chǎn)生耐藥性。因此，抗菌肽在臨床醫(yī)學(xué)、食品加工、日化、農(nóng)業(yè)及飼料添加劑和動物藥品等領(lǐng)域具有廣闊的開發(fā)應(yīng)用前景[16]。

本研究在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，在杜仲中純化得到可溶性的抗菌肽EuCHIT1。在抑菌實(shí)驗(yàn)中，隨著抗菌肽EuCHIT1質(zhì)量濃度升高，抑菌效果增強(qiáng)，表明抗菌肽EuCHIT的抗真菌作用具有明顯的量效關(guān)系。目前研究表明[17]，動植物來源的抗菌肽能起到有效的抗真菌作用，其機(jī)制可能是抗菌肽可以誘導(dǎo)白色念珠菌胞內(nèi)活性氧(ROS)積聚、線粒體膜電位去極化，進(jìn)而引起白色念珠菌線粒體氧化損傷，而線粒體氧化損傷可能與白色念珠菌細(xì)胞的凋亡與壞死相關(guān)。抗菌肽EuCHIT1可導(dǎo)致白色念珠菌細(xì)胞膜的去極化及通透性增加，從而起到抗真菌作用?？咕牡目咕鷻C(jī)制主要是在細(xì)菌質(zhì)膜上形成離子通道，破壞膜勢，引起胞內(nèi)物質(zhì)外泄；同時可與膜吸附結(jié)合、破壞外膜滲透性，從而導(dǎo)致細(xì)菌死亡的研究結(jié)果相似[18-19]。(1-3)-β-D-葡聚糖作為真菌細(xì)胞壁成分之一，其結(jié)構(gòu)和功能破壞可導(dǎo)致胞內(nèi)物質(zhì)泄漏，生理代謝受阻等，進(jìn)而致菌體死亡。因此，(1，3)-β-D-葡聚糖含量已被用作檢測是否存在深部真菌感染的指標(biāo)[20]。麥角甾醇是酵母細(xì)胞中的主要甾醇，主要在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)和脂滴中合成，作為各種膜的基本組成成分，其減少改變了白色念珠菌正常細(xì)胞膜的特性[21]。文獻(xiàn)報道，苦參堿可通過抑制白色念珠菌細(xì)胞膜上真菌甾醇合成過程中的一個關(guān)鍵酶羊毛甾醇14α-去甲基化酶(CYP51)的活性，影響麥角固醇生物合成而發(fā)揮其抗真菌活性[8]。本研究表明，抗菌肽EuCHIT1可降低白色念珠菌(1-3)-β-D-葡聚糖及麥角甾醇含量，作用與氟康唑8 μg·mL-1相當(dāng)。

白色念珠菌感染可導(dǎo)致機(jī)體炎性反應(yīng)，IL-1β、IL-6及TNF-α水平能夠反映機(jī)體的炎性程度。研究表明，氟康唑膠囊可降低患者真菌性外耳道炎的血清中IL-6、C-反應(yīng)蛋白(CRP)和TNF-α水平[22]。本研究結(jié)果提示，抗菌肽EuCHIT1能降低感染了白色念珠菌的SD大鼠WTRL1細(xì)胞中IL-6及TNF-α水平，其與氟康唑在抗真菌感染時能有效改善炎性因子水平結(jié)果相似。

綜上，抗菌肽EuCHIT1對白色念珠菌具有抑菌作用，由于抗菌肽與傳統(tǒng)的抗生素相比，其抗菌機(jī)制不同，細(xì)菌難以對其產(chǎn)生耐藥性，有望成為新一代綠色環(huán)保的抗真菌新藥，具有較好的臨床應(yīng)用前景，但其臨床應(yīng)用療效和具體抑菌機(jī)制尚需進(jìn)一步研究明確。