程慧玲，陳佳云a，朱春艷，韓璐營，努爾斯曼古麗·阿布都艾尼，付東鵬，吳彩勝*

1.廈門大學(xué) 藥學(xué)院，福建 廈門 361002；2.佳木斯大學(xué) 藥學(xué)院，黑龍江 佳木斯 154007

大黃素(1，3，8-三羥基-6-甲基蒽醌，emodin)是一種天然的蒽醌類化合物，存在于多種中藥中，如掌葉大黃RheumpalmatumL.、虎杖PolygonumcuspidatumSieb.et Zucc.和何首烏PolygonimultiflorumThunb.?，F(xiàn)代研究表明，大黃素具有抗炎、抗癌、抗菌、利尿、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)、免疫抑制等多種藥理活性，可用于治療關(guān)節(jié)炎、胰腺炎、阿爾茨海默病、動(dòng)脈粥樣硬化、慢性阻塞性肺病等疾病[1-5]。但是大黃素也存在一些不良反應(yīng)，會(huì)造成脂質(zhì)過氧化、DNA氧化和蛋白質(zhì)損傷[6]，在高濃度或長期服用時(shí)，可能會(huì)導(dǎo)致肝、腎、生殖損傷[7]。

近年來，大黃素在細(xì)胞和分子水平的生物學(xué)效應(yīng)研究取得了較大進(jìn)展，在臨床上有廣泛應(yīng)用，可與其他藥物配伍使用，常用來增加化學(xué)藥物治療的敏感性[8]。但其體內(nèi)研究相對(duì)較少，特別是針對(duì)其血漿暴露物質(zhì)的研究少有開展，主要是肝微粒體或者尿、膽汁樣品中的檢測(cè)。Xu等[9]利用超高壓液相色譜-飛行時(shí)間質(zhì)譜，在鼠肝微粒體孵育體系中找到大黃素Ⅰ相代謝物14個(gè)。Wu等[10]借助液相色譜聯(lián)合三重四級(jí)桿質(zhì)譜，在口服大黃素的大鼠尿液和膽汁中共找到35個(gè)代謝物，并推斷葡萄糖醛酸結(jié)合是大黃素主要的代謝途徑。一般認(rèn)為，藥物發(fā)揮作用，主要是入體的化學(xué)物質(zhì)，也就是血漿中的暴露物質(zhì)。為了更好地揭示大黃素的藥效作用物質(zhì)基礎(chǔ)，探究其潛在的藥物-藥物相互作用，本研究運(yùn)用高效液相色譜-高分辨質(zhì)譜法(HPLC-HRMS)采集大黃素入體成分的質(zhì)譜數(shù)據(jù)集；采用高分辨提取離子色譜法(HR-EIC)提取大黃素可預(yù)知代謝產(chǎn)物；采用改進(jìn)的多重質(zhì)量虧損過濾法(MMDF)識(shí)別大黃素的不可預(yù)知代謝物；識(shí)別和鑒定口服大黃素后大鼠血漿中的暴露成分，為后續(xù)大黃素的開發(fā)利用提供參考。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

雄性Wistar大鼠3只，清潔級(jí)，體質(zhì)量180～220 g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，生產(chǎn)許可證編號(hào)：SCXK(滬)2017-0005，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 試藥

大黃素(批號(hào)：HE152868RG1，純度>95%，寶雞辰光生物有限公司)；色譜純甲醇、乙腈及美國化學(xué)學(xué)會(huì)標(biāo)準(zhǔn)(ACS)級(jí)甲酸均購自Thermo Fisher Scientific公司；分析純氯化鈉(廣州市金華大化學(xué)試劑有限公司)；超純水由Milli-Q型凈水系統(tǒng)自行制備。

1.3 儀器

Q Exactive型液質(zhì)聯(lián)用儀、Metworks 1.3.0.200軟件、Xcalibur 3.0.63.3化學(xué)工作站數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)(Thermo Fisher Scientific公司)；D3024R型離心機(jī)[大龍興創(chuàng)實(shí)驗(yàn)儀器(北京)有限公司]。

2 方法

2.1 大黃素溶液配制

準(zhǔn)確稱取大黃素50.00 mg，加入0.9% NaCl溶液10 mL，超聲助溶5 min，即得質(zhì)量濃度為5 mg·mL-1的大黃素溶液。

2.2 給藥與取樣

雄性Wistar大鼠3只，給藥前禁食24 h，自由飲水，眼眶取血收集空白血樣。大鼠以50 mg·kg-1的劑量灌胃給予大黃素溶液，給藥后分別于0.5、1.5、3.0、6.0、9.0、12.0、24.0 h取血[11]，置于含有1%肝素鈉的離心管中，以4500 r·min-1、4 ℃離心10 min(離心半徑8.5 cm)，取上清液，-20℃冰箱保存。

2.3 樣品前處理

分別取各時(shí)間點(diǎn)血漿樣品150 μL(每只大鼠取50 μL)置于離心管中，加入3倍量的甲醇-乙腈(1∶1)，渦旋30 s混合均勻，以4000 r·min-1、4 ℃離心10 min(離心半徑8.5 cm)，取上清液至離心管中，37 ℃氮吹。在吹干的樣品中加入70%甲醇100 μL復(fù)溶，超聲處理5 min，渦旋混勻，以12 000 r·min-1、4 ℃離心10 min(離心半徑8.5 cm)，取上清液待分析。

2.4 分析條件

2.4.1色譜條件 色譜柱為ACQUITY UPLC CSH C18(50 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流動(dòng)相為0.3%甲酸(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～1 min，5%～20%B；1～2 min，20%～40%B；2～5 min，40%～60%B；5～8 min，60%～80%B；8.0～9.2 min，80%～95%B；9.2～10.0 min，95%B；10.0～10.1 min，95%～5%B；10.1～15.0 min，5%B)；流速為0.3 mL·min-1；柱溫為35 ℃；進(jìn)樣量為3 μL；檢測(cè)波長為270 nm。

2.4.2質(zhì)譜條件 電噴霧離子源(ESI)，負(fù)離子檢測(cè)模式；噴霧電壓：3.8 kV；毛細(xì)管溫度：260 ℃；鞘氣(N2)流速為40 arb；輔助氣(N2)流速為10 arb；掃尾氣(N2)流速為2 arb；套管透鏡(Tube Lens)電壓為120 V；掃描質(zhì)量數(shù)為m/z100～1000；采用Full MS-ddMS2方式進(jìn)行掃描。

2.5 數(shù)據(jù)處理

在Thermo Xcalibur 3.0.63.3化學(xué)工作站數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)中，利用高分辨提取離子流(HREIC)，對(duì)檢測(cè)樣品中可預(yù)測(cè)的代謝產(chǎn)物進(jìn)行識(shí)別鑒定。采用Metworks 1.3.0.200軟件對(duì)一級(jí)高分辨質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行處理，基于質(zhì)量虧損數(shù)，設(shè)置不同的過濾模板：1)以母藥為模板化合物，質(zhì)量虧損為±0.05；2)以母藥為模板化合物，質(zhì)量虧損為±0.09；3)以母藥和4個(gè)暴露量較高的可預(yù)測(cè)代謝物為模板化合物，設(shè)定相對(duì)窄的范圍，質(zhì)量數(shù)為±100，質(zhì)量虧損過濾范圍為±0.025，從而識(shí)別出大黃素血漿樣品中的不可預(yù)測(cè)代謝產(chǎn)物；4)文獻(xiàn)調(diào)研，補(bǔ)充代謝物；5)結(jié)合質(zhì)譜碎片數(shù)據(jù)及裂解規(guī)律，推斷出代謝產(chǎn)物的可能結(jié)構(gòu)式，過程見圖1。

圖1 代謝物鑒定流程

3 結(jié)果

3.1 HREIC分析結(jié)果

利用HREIC分析所采集的高分辨一級(jí)數(shù)據(jù)，結(jié)合Metworks 1.3.0.200所提供的可預(yù)測(cè)代謝途徑，找到10個(gè)代謝物，主要為大黃素或其同分異構(gòu)體經(jīng)磺化、葡萄糖醛酸化或羥基化得來的。記錄大黃素及10個(gè)代謝物在不同時(shí)間點(diǎn)的峰面積，制作體內(nèi)經(jīng)時(shí)變化熱圖(見圖2)。通過對(duì)比，發(fā)現(xiàn)代謝物在12 h血漿中的暴露量相對(duì)較高，因此選取12 h血漿樣品圖譜進(jìn)行MMDF處理。通過比較其暴露強(qiáng)度和準(zhǔn)分子離子峰信息，確定了代謝物M9、M11、M15、M18和大黃素作為MMDF操作的模板，其高分辨準(zhǔn)分子離子峰分別為[M-H]-m/z461.073，445.077，285.040，349.002，269.044。

圖2 大黃素和10個(gè)代謝產(chǎn)物的體內(nèi)經(jīng)時(shí)變化熱圖

3.2 MMDF分析結(jié)果

傳統(tǒng)質(zhì)量虧損過濾技術(shù)(MDF)主要采用母藥(或者母藥的核心結(jié)構(gòu)單位)作為模板化合物。若使用±0.05作為過濾范圍(見圖3A)，有可能丟失一些結(jié)構(gòu)變化較大的代謝產(chǎn)物。而將過濾范圍擴(kuò)大至±0.09時(shí)(見圖3B)，則產(chǎn)生大量干擾峰，由于內(nèi)源性物質(zhì)的含量高，因此代謝物的豐度降低，影響代謝產(chǎn)物的分析。

注：A.采用母藥作為過濾模板，±0.05作為過濾范圍；B.采用母藥作為過濾模板，±0.09作為過濾范圍；C.采用母藥及4個(gè)代謝物作為過濾模板，窄范圍過濾(質(zhì)量數(shù)范圍：±100，質(zhì)量虧損過濾范圍：±0.025)；藍(lán)色峰為大黃素；綠色峰為MMDF處理后新挖掘的代謝產(chǎn)物；紅色峰為假陽性峰；黃色峰為MMDF處理前已找到的代謝產(chǎn)物。圖3 不同過濾參數(shù)搜尋代謝物的效果對(duì)比

本研究采用改進(jìn)的MMDF技術(shù)，通過增加體內(nèi)高暴露量的4個(gè)不同相對(duì)分子質(zhì)量代謝物作為模板化合物，使用±0.025進(jìn)行窄范圍過濾(見圖3C)。結(jié)果表明，該策略不僅大大減少了假陽性結(jié)果，而且能夠發(fā)掘出更多的代謝產(chǎn)物，具有更好的實(shí)際運(yùn)用價(jià)值。

3.3 代謝物結(jié)構(gòu)鑒定

根據(jù)二級(jí)質(zhì)譜圖，結(jié)合MMDF處理前后得出的一級(jí)數(shù)據(jù)以及文獻(xiàn)調(diào)研數(shù)據(jù)，共從大鼠血漿樣本中鑒定了18個(gè)代謝物(見圖4)，其中有12個(gè)首次在血漿樣品中發(fā)現(xiàn)，有3個(gè)(M4、M13和M16)未在其他文獻(xiàn)中報(bào)道[10，12-14]。同時(shí)，MMDF處理方式也存在一定的局限性，如M1、M3無法找到，需通過文獻(xiàn)調(diào)研進(jìn)行補(bǔ)充。母藥大黃素和代謝產(chǎn)物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)和結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果見表1。通過DAS(3.0版)軟件計(jì)算大黃素和各代謝產(chǎn)物的曲線下面積(AUC)，分析體內(nèi)暴露量(見圖5)，M9(大黃素+Glu A)為體內(nèi)暴露量最高的代謝物，M6(大黃素+Glu A+SO3)、M7(大黃素+Glu A)、M16[大黃酸(異構(gòu)體)+O+SO3]、M11(大黃素+O+Glu A)和M15(大黃素+SO3)次之，可推測(cè)大黃素進(jìn)入體內(nèi)后主要代謝途徑為葡萄糖醛酸結(jié)合、磺酸化等結(jié)合反應(yīng)，也有部分進(jìn)行羥基化等氧化還原反應(yīng)(見圖6)。

注：綠色表示MMDF處理后找到的代謝物；紅色表示MMDF處理前找到的代謝物；藍(lán)色表示文獻(xiàn)調(diào)研找到的化合物。圖4 大黃素和代謝產(chǎn)物的HREIC圖

注：AUC為各時(shí)間點(diǎn)峰面積×h。圖5 大黃素和代謝產(chǎn)物的體內(nèi)暴露量

圖6 大黃素的體內(nèi)代謝途徑

表1 大黃素及其代謝產(chǎn)物的質(zhì)譜數(shù)據(jù)和結(jié)構(gòu)鑒定結(jié)果

續(xù)表1

4 討論

目前，隨著各種串聯(lián)高分辨質(zhì)譜的發(fā)展，使用一個(gè)簡單、普適的采集方法自動(dòng)獲得生物樣品中藥物入體成分的質(zhì)譜數(shù)據(jù)集已經(jīng)成為成熟的通用檢測(cè)方法。但由于儀器自動(dòng)采集的質(zhì)譜數(shù)據(jù)中包含大量無效的質(zhì)譜數(shù)據(jù)，如何在后處理中高效而全面地識(shí)別出藥物入體成分的相關(guān)信息，已成為運(yùn)用串聯(lián)高分辨質(zhì)譜進(jìn)行藥物吸收、分布、代謝、排泄(ADME)研究的首要關(guān)鍵問題[15]。在過去的十余年間，各種質(zhì)譜數(shù)據(jù)集挖掘技術(shù)被先后開發(fā)出來，以滿足體內(nèi)代謝產(chǎn)物識(shí)別和鑒定的需要，包括HREIC、MDF、中性丟失過濾(NLF)和產(chǎn)物離子過濾(PIF)等。HREIC可有效檢測(cè)可預(yù)測(cè)代謝物。MDF能根據(jù)代謝物質(zhì)量虧損的情況及核心結(jié)構(gòu)的相似性來搜尋未知代謝物[16]。MMDF在MDF的基礎(chǔ)上增加了更多的過濾模板，可對(duì)任何代謝物的類似結(jié)構(gòu)進(jìn)行搜索，使分析結(jié)果更具全面性[17]。但模板化合物的增多勢(shì)必會(huì)增加無效數(shù)據(jù)的量，因此需要縮小質(zhì)量范圍及虧損范圍來有效減少干擾峰的產(chǎn)生，使分析效率大大提升。

已有研究表明，細(xì)胞色素P450 1A2、2C19和3A4介導(dǎo)大黃素氧化[18]，UDP-葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶2B7(UGT2B7)介導(dǎo)大黃素葡萄糖醛酸化。UGT2B7和多藥耐藥蛋白2(MRP2)的偶聯(lián)導(dǎo)致大黃素生物利用度低下[19]，產(chǎn)生毒代動(dòng)力學(xué)性別差異[20]?？梢姶簏S素的藥效和毒性與其代謝轉(zhuǎn)化存在密切關(guān)系。本研究利用HPLC-HRMS采集數(shù)據(jù)，通過HREIC、MMDF分析及文獻(xiàn)調(diào)研全面識(shí)別和鑒定了大黃素的血漿暴露代謝產(chǎn)物，共發(fā)現(xiàn)18個(gè)體內(nèi)代謝物，其中3個(gè)為首次發(fā)現(xiàn)。研究表明，大黃素主要代謝途徑為葡萄糖醛酸化、磺化、羥基化等，確定大黃素的主要代謝位點(diǎn)，可為后續(xù)大黃素的深度研究開發(fā)提供參考。本研究所建立的高分辨質(zhì)譜分析方法方便快捷，適用于藥物代謝產(chǎn)物的分析研究，可為藥物體內(nèi)分析提供技術(shù)保障。