錢桂英，閆秋瑩，蔣家璐，范匯森，譚佳妮，程海波，孫東東*

1.南京中醫(yī)藥大學(xué) 常熟附屬醫(yī)院，江蘇 蘇州 215500；2.國家中醫(yī)藥管理局 名醫(yī)驗(yàn)方評價與轉(zhuǎn)化重點(diǎn)研究室/江蘇省抗腫瘤驗(yàn)方研究與產(chǎn)業(yè)化工程實(shí)驗(yàn)室/江蘇省中醫(yī)藥防治腫瘤協(xié)同創(chuàng)新中心/南京中醫(yī)藥大學(xué) 轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心，江蘇 南京 210023；3.南京中醫(yī)藥大學(xué) 藥學(xué)院，江蘇 南京 210023

消癌解毒方是在傳承發(fā)展國醫(yī)大師周仲瑛“癌毒”學(xué)術(shù)思想基礎(chǔ)上，基于癌毒病機(jī)理論，針對癌毒病機(jī)演變規(guī)律形成的抗腫瘤臨床有效系列驗(yàn)方。全方攻補(bǔ)兼施，結(jié)合不同惡性腫瘤的主要病理因素及具體癌毒的類型，其組成各有區(qū)別，臨證可根據(jù)不同病位相應(yīng)選擇不同的方藥，以取得更好的療效[1-3]。本實(shí)驗(yàn)所用方劑由半枝蓮、預(yù)知子、山慈菇、莪術(shù)、太子參和麥冬組成，臨床上主要用于胃癌治療。方中半枝蓮為君藥，具有清熱解毒、消腫散結(jié)的功效，在臨床治療中與其他藥聯(lián)合使用，發(fā)揮增效減毒作用[4]。

據(jù)文獻(xiàn)報道，天然黃酮類化合物具有廣泛的抗腫瘤活性[5]，是抗癌方劑中的重要活性成分。而本方中半枝蓮、麥冬等也含有多種黃酮類成分，這些成分在消癌解毒方配伍煎煮前后是否發(fā)生變化，是否到達(dá)機(jī)體器官以及如何在體內(nèi)發(fā)生吸收、分布、轉(zhuǎn)移等尚不十分明確，闡釋這些問題對于揭示復(fù)方的物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)制具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)建立超高效液相色譜-串聯(lián)四極桿飛行時間質(zhì)譜法(UPLC-Q-TOF-MS)檢測消癌解毒方水提液中黃酮類成分的方法，同時研究大鼠灌胃給予消癌解毒方水提液后黃酮類成分在體內(nèi)的分布情況，為進(jìn)一步闡釋消癌解毒方中特征化學(xué)成分及其在體內(nèi)的變化分布規(guī)律提供參考。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動物

SPF級雄性SD大鼠，體質(zhì)量(200±20) g，購于南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物中心，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK(蘇)2014-0001，實(shí)驗(yàn)動物使用許可證號：SYXK(蘇)2012-0031。

1.2 試藥

半枝蓮(批號：170501，產(chǎn)地：湖北)、預(yù)知子(批號：170505，產(chǎn)地：河北)、山慈菇(批號：170105，產(chǎn)地：貴州)、莪術(shù)(批號：170310，產(chǎn)地：廣西)、太子參(批號：170425，產(chǎn)地：河北)、麥冬(批號：170115，產(chǎn)地：四川)均購于湖北聚瑞中藥飲片有限公司，經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)陳建偉教授鑒定分別為唇形科植物半枝蓮ScutellariabarbataD.Don的干燥全草、木通科植物木通Akebiaquinata(Thunb.) Decne.的干燥近成熟果實(shí)、蘭科植物杜鵑蘭Gremastraappendiculata(D.Don) Makino的干燥假鱗莖、姜科植物蓬莪術(shù)CurcumaphaeocaulisVal.的干燥根莖、石竹科植物孩兒參Pseudostellariaheterophylla(Miq.)Pax ex Pax et Hoffm.的干燥塊根及百合科植物麥冬Ophiopogonjaponicus(L.f) Ker-Gawl.的干燥塊根；甲醇、乙腈均為質(zhì)譜純，購自美國默克公司；甲酸為質(zhì)譜純，購自CNW公司。

1.3 儀器

CPA225D型電子天平(賽多利斯科學(xué)儀器北京有限公司)；SPE固相萃取小柱(德國CNW公司)；LC-30A型超高效液相色譜系統(tǒng)，配有LC-30AD型二元液相泵、SIL-30AC型自動進(jìn)樣裝置、DGU-20A5R型在線脫氣裝置、CTO-30A型柱溫箱(日本Shimadzu公司)；Triple TOF 5600型高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)，包含電噴霧離子源(ESI)、Analyst TF 1.6及Peak View等質(zhì)譜分析軟件(美國AB Sciex公司)；KH-500DV型數(shù)控超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司)；CentriVap型離心濃縮儀(美國Labconc公司)；超純水系統(tǒng)(美國Millipore公司)。

2 方法

2.1 水煎液供試品制備

按消癌解毒方組方配比，稱取半枝蓮5 g、預(yù)知子2.25 g、山慈菇2.25 g、莪術(shù)2.25 g、太子參3.75 g、麥冬2.5 g，合并后依次加入10、8倍量水，煎煮2、1.5 h，合并2次濾液并濃縮至質(zhì)量濃度為1 g·mL-1(以生藥量計)供化學(xué)成分分析使用，濃縮至質(zhì)量濃度為2.88 g·mL-1(以生藥量計)供大鼠灌胃給藥使用。

量取1 mL濃縮液加入SPE固相萃取小柱，分別采用體積分?jǐn)?shù)為20%、40%、60%、80%、100%的乙腈水溶液作為流動相進(jìn)行洗脫，完整收集不同濃度下的濾液，渦旋混勻，12 000 r·min-1離心5 min(離心半徑7 cm)，離心2次，取上清液即得供試品溶液。

2.2 動物分組與給藥

12只雄性SD大鼠，適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，自由飲食，室溫18～26 ℃，濕度40%～60%，正常晝夜交替。將大鼠隨機(jī)分為2組，分別為對照組和給藥組，每組6只，分別飼養(yǎng)于代謝籠中，實(shí)驗(yàn)前12 h禁食，自由飲水。根據(jù)臨床人用劑量進(jìn)行換算后，給藥組大鼠灌胃給予2.1項下制備的消癌解毒方水提液15.12 g·kg-1，對照組大鼠給予等體積0.9%氯化鈉溶液，每天給藥1次，連續(xù)給藥3 d。

2.3 樣品采集與處理

2.3.1尿液、糞便、血漿樣品的收集與處理 第1次和第2次給藥后，分別收集給藥組和對照組大鼠0～24 h尿液和糞便樣本。尿液樣本使用離心濃縮儀進(jìn)行濃縮干燥，糞便樣本使用恒溫干燥箱40 ℃進(jìn)行干燥。兩者分別加入適量甲醇，超聲提取30 min，尿液和糞便樣品分別進(jìn)行2次、3次離心，5000 r·min-1離心15 min(離心半徑7 cm)，取上清，離心濃縮干燥。末次給藥后，分別于0.5、1.0、1.5 h眼眶取血，血液樣本5000 r·min-1、4 ℃離心10 min(離心半徑7 cm)，獲得血漿樣本。取適量血漿樣本中加入4倍量體積甲醇，超聲提取30 min，提取物5000 r·min-1離心15 min(離心半徑7 cm)，取上清，離心，濃縮干燥。

樣品均用甲醇復(fù)溶，13 000 r·min-1離心10 min(離心半徑7 cm)，離心2次，取上清進(jìn)樣。

2.3.2組織樣品的收集與處理 在收集完血液樣本之后，使用心臟灌注器快速清除組織中的血液，收集心、肝、脾、肺、腎、腦、胃、小腸。稱取適量組織樣本，加入4倍量預(yù)冷0.9%氯化鈉溶液進(jìn)行勻漿。每種組織樣本取6 mL勻漿液，加入8倍量甲醇，超聲提取30 min，5000 r·min-1、4 ℃離心10 min(離心半徑7 cm)，取上清，離心濃縮干燥。取干燥組織樣本復(fù)溶于1 mL甲醇，13 000 r·min-1離心10 min(離心半徑7 cm)，離心2次，取上清進(jìn)樣檢測。

2.4 檢測條件

2.4.1水煎液檢測色譜條件 Agilent C18(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)反相色譜柱，流動相為0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～0.01 min，5%B；0.01～0.5 min，5%～10%B；0.5～20 min，10%～32%B；20～25 min，32%～70%B；25～27 min，70%～100%B；27～28 min，100%B；28～30 min，100%～5%B；30～31 min，5%B)。柱溫40 ℃，流速0.3 mL·min-1，進(jìn)樣量5 μL。

2.4.2生物樣品檢測色譜條件 Agilent C18(100 mm×2.1 mm，1.8 μm)反相色譜柱，流動相為0.1%甲酸水溶液(A)-乙腈(B)，梯度洗脫(0～0.01 min，5%B；0.01～2 min，5%～50%B；2～8 min，50%～54%B；8～10 min，54%～90%B；10～13 min，90%～100%B；13～14 min，100%B；14～17 min，100%～5%B；17～18 min，5%B)。柱溫40 ℃，流速0.3 mL·min-1，進(jìn)樣量5 μL。

2.4.3質(zhì)譜條件 采用ESI，正、負(fù)離子模式下采集數(shù)據(jù)；多反應(yīng)監(jiān)測模式(MRM)；離子噴霧電壓(ISVF)為4 500.00 V(正離子模式)/-4 500.00 V(負(fù)離子模式)；去簇電壓(DP)為60.00 V(正離子模式)/-60.00 V(負(fù)離子模式)；霧化氣(GS1)壓力為378.95 kPa；輔助氣(GS2)壓力為378.95 kPa；氣簾氣(CUR)壓力為378.95 kPa；去溶劑溫度(TEM)550.00 ℃；碰撞能量擴(kuò)展(CES)為10.00 eV。

2.5 數(shù)據(jù)處理

根據(jù)文獻(xiàn)和數(shù)據(jù)庫搜集半枝蓮中黃酮類成分，從Chemical book尋找目標(biāo)化合物結(jié)構(gòu)，利用Peak view質(zhì)譜分析軟件尋找目標(biāo)化合物，參考文獻(xiàn)并根據(jù)二級碎片和結(jié)構(gòu)的匹配度進(jìn)行確證。

3 結(jié)果

3.1 化學(xué)成分分析

消癌解毒方水提液樣品在正、負(fù)離子模式下的基峰總離子流圖(見圖1)顯示，多種化合物被檢測出，并且分離狀況良好。綜合保留時間(tR)、質(zhì)譜特征碎片和裂解途徑等信息，共鑒定出23個黃酮類化合物，其中正黃酮類化合物13個(峰3～5、7、8、10～12、15～19)、二氫黃酮類化合物5個(峰2、6、9、13、14)、黃酮醇類化合物1個(峰1)、高異黃酮類化合物4個(峰20～23)，具體信息見表1。

圖1 消癌解毒方水提液正、負(fù)離子模式下總離子流圖

表1 LC-MS/MS正、負(fù)離子模式下消癌解毒方水煎液中化學(xué)成分鑒定

續(xù)表1

黃酮類化合物主要是指由2苯環(huán)(A環(huán)與B環(huán))通過中間三碳鏈連接而成的化合物，黃酮的質(zhì)譜裂解特征主要是C環(huán)斷裂，得到含有完整A環(huán)和B環(huán)的離子碎片，裂解方式見圖2。高異黃酮與其他黃酮結(jié)構(gòu)稍有不同，高異黃酮C環(huán)與B環(huán)連接處多1個亞甲基，該結(jié)構(gòu)會使其在質(zhì)譜條件下亞甲基處首先發(fā)生斷裂，隨后A環(huán)發(fā)生斷裂。黃酮苷類化合物糖苷鍵較易先斷裂，之后再發(fā)生黃酮母核的斷裂。此外，黃酮類化合物的取代基多為羥基、甲基、甲氧基，其中甲氧基較易斷裂，結(jié)合黃酮類化合物的斷裂規(guī)律，可以推斷出各環(huán)上取代基情況。選取23個黃酮成分中的部分代表性結(jié)構(gòu)進(jìn)行解析。

圖2 黃酮裂解方式

化合物1(tR=5.56 min)在負(fù)離子模式下，根據(jù)母離子m/z609.143 6[M-H]-，得到化學(xué)式為C27H30O16。在MS2中，特征碎片離子為m/z447.091 0[M-H-C6H11O5]-、m/z285.039 5[M-H-C6H11O5-C6H10O5]-，由此推斷其結(jié)構(gòu)中含有1分子鼠李糖，1分子葡萄糖，結(jié)合文獻(xiàn)推測化合物1為黃酮醇苷類成分蘆丁[6]。

化合物14(tR=18.5 min)在負(fù)離子模式下，根據(jù)母離子m/z271.061 5[M-H]-，得到化合物化學(xué)式為C15H12O5。在MS2中，特征碎片離子為m/z151.003 8(1，3A-)、m/z119.051 2(1，3B-)，表明A環(huán)上存在2個羥基，B環(huán)上存在1個羥基，結(jié)合文獻(xiàn)推測化合物14為二氫黃酮成分柚皮素[9]。

化合物20(tR=24.18 min)在負(fù)離子模式下，根據(jù)母離子m/z359.113 0[M-H]-，得到化合物化學(xué)式為C19H20O7。在MS2中，特征碎片離子m/z344.088 6[M-H-CH3]-、m/z329.064 6[M-H-OCH3]-、m/z223.058 5[M-H-(B ring+CH)]-、m/z208.037 0[M-H-(B ring+CH)-CH3]-和m/z169.049 6，表明1，3A-失去1個CO，結(jié)合前面的碎片提示A環(huán)有1個甲氧基、1個甲基、2個羥基，結(jié)合文獻(xiàn)推測化合物20為高異黃酮成分麥冬黃烷酮E[11]。

化合物22(tR=25.76 min)在正離子模式下，根據(jù)母離子m/z343.117 2[M+H]+，得到化合物化學(xué)式為C19H18O6，在MS2中，特征碎片離子為m/z207.065 9、m/z135.044 3，推斷高異黃酮C3-C9鍵斷裂，結(jié)合文獻(xiàn)推測化合物22為高異黃酮成分甲基麥冬黃烷酮A[11]。

化合物1、14、20、22的二級質(zhì)譜見圖3。

圖3 消癌解毒方黃酮類化合物1、14、20、22的二級質(zhì)譜圖

3.2 體內(nèi)原形成分鑒定

結(jié)合從消癌解毒方水煎液中鑒定出的黃酮類化合物質(zhì)譜信息，進(jìn)而分析其給藥后在大鼠體內(nèi)的分布情況。結(jié)果表明，在大鼠心、肝、脾、肺、腎、腸、腦、胃、血漿、尿液和糞便中分別鑒定出5、5、3、3、5、6、6、12、3、2和10個黃酮類成分。其中化合物6-甲氧基柚皮素(13)、柚皮素(14)、4′-羥基漢黃芩素(15)、芹菜素(16)和漢黃芩素(19)在多種樣品中被檢出，6-甲氧基柚皮素在所有樣品中被檢測出，柚皮素和芹菜素在心、肝、腎、腸、腦、胃和糞便中被檢出，4′-羥基漢黃芩素在除血漿和尿液外的其他樣品中被檢測出，漢黃芩素在除血漿樣品外的各樣品中均被檢出。詳細(xì)信息見表2，相應(yīng)的質(zhì)譜圖見圖4。

表2 消癌解毒方黃酮類成分在給藥后大鼠體內(nèi)的分布

注：A.心；B.肝；C.脾；D.肺；E.腎；F.腸；G.腦；H.胃；I.血漿；J.尿液；K.糞便。圖4 各生物樣品在負(fù)離子模式下的總離子流圖

4 討論

當(dāng)前癌癥發(fā)病率和病死率不斷增長，其發(fā)生發(fā)展與環(huán)境、生活方式、經(jīng)濟(jì)水平等因素有關(guān)。目前癌癥的臨床治療以化療為主，但存在化療藥物不良反應(yīng)較多、易產(chǎn)生耐藥性等問題。相對于單獨(dú)化療，消癌解毒方聯(lián)合化學(xué)治療可以取得更好的療效，并降低化療藥物的不良反應(yīng)，提高患者免疫力，提高生活質(zhì)量[12-14]。本方中半枝蓮為君藥，具有清熱解毒、活血化瘀、消腫止痛的功效。半枝蓮水煎液中主要為一些黃酮類化合物[6]。研究顯示，半枝蓮中的4′-羥基漢黃芩素通過破壞磷脂酰肌醇3-激酶(PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信號通路傳導(dǎo)來抑制結(jié)直腸癌血管生成。本實(shí)驗(yàn)中，在半枝蓮及腸組織中均檢測出4′-羥基漢黃芩素成分，說明4′-羥基漢黃芩素能夠到達(dá)病灶部位[15]。半枝蓮中的其他黃酮類化合物，如漢黃芩素、野黃芩苷、芹菜素、木犀草素和黃芩素等同樣具有抗腫瘤活性[16-17]。因此本實(shí)驗(yàn)主要研究對象為半枝蓮中黃酮類成分。

近年來液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)被廣泛應(yīng)用于藥物研究中，該技術(shù)靈敏度和精密度高、選擇性好，能夠快速發(fā)現(xiàn)和表征目標(biāo)成分，結(jié)合數(shù)據(jù)庫能夠準(zhǔn)確鑒定中藥復(fù)方復(fù)雜體系中的化合物[18]。因此，本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用UPLC-Q-TOF-MS技術(shù)對消癌解毒方水提液及大鼠給藥后體內(nèi)相關(guān)部位的黃酮類成分進(jìn)行分析，闡釋某一類成分在進(jìn)入體內(nèi)前后的變化和分布規(guī)律，為下一步研究提供參考和依據(jù)。

本實(shí)驗(yàn)在制備供試品溶液時采用固相萃取技術(shù)，使樣品得到凈化和富集，以期得到藥材中更為全面的黃酮類化合物信息。根據(jù)文獻(xiàn)研究，甲醇沉淀蛋白法更快速簡便，取樣量較少，經(jīng)濟(jì)方便[19-20]。為了更快速、方便地檢測樣品，本研究中生物樣本處理采用甲醇沉淀法。而從檢測結(jié)果來看，血漿中檢測到的原型成分較其他生物樣品少。究其原因，一方面可能是蛋白沉淀法提取血漿樣品效率不高；另一方面可能是中藥成分吸收入血后在體內(nèi)不僅會與血漿蛋白結(jié)合，還會與組織蛋白等高分子物質(zhì)結(jié)合，某些成分與組織的親和力更好，因此這些藥物在組織中的濃度較血漿中高，而血漿中的藥物濃度過低，低于儀器的檢測限，因此無法檢測到。

消癌解毒方中黃酮類化合物的取代基多為羥基、甲基、甲氧基等，根據(jù)黃酮類化合物的質(zhì)譜裂解規(guī)律，可以推斷出各環(huán)上存在何種取代基，該方法對于已知目標(biāo)化合物可實(shí)現(xiàn)快速分析，但因取代基位置無法確定，亦存在一定的局限性，特別是對于多種同分異構(gòu)體的準(zhǔn)確分析還需要結(jié)合其他技術(shù)手段。