何軍剛，強(qiáng)正澤，馬冬妮，馮曉莉，李成義

甘肅中醫(yī)藥大學(xué)，甘肅 蘭州 730000

目前，有關(guān)植物次生代謝產(chǎn)物的機(jī)制研究是分子生物學(xué)研究的熱點(diǎn)領(lǐng)域之一。其主要是對(duì)野生植物資源中的優(yōu)異基因進(jìn)行鑒定和途徑解析，通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(qRT-PCR)技術(shù)檢測(cè)其表達(dá)量，此時(shí)首先需要確定一個(gè)表達(dá)穩(wěn)定的內(nèi)參基因[1]。肌動(dòng)蛋白(actin)是真核生物細(xì)胞中最豐富的蛋白質(zhì)之一，是細(xì)胞骨架的重要微絲組分，參與細(xì)胞分裂、內(nèi)吞、信號(hào)傳導(dǎo)等細(xì)胞內(nèi)多種生命運(yùn)動(dòng)[2]。Actin基因具有高度保守以及表達(dá)量穩(wěn)定的特點(diǎn)，常被當(dāng)作基因表達(dá)檢測(cè)的內(nèi)參基因[3]。相關(guān)研究已從金銀花LonicerajaponicaThunb[4]、太子參Pseudostellariaheterophylla(Mig.)Pax.ex Pax.et Hoffm.[3]、浙貝母FritillariathunbergiiMig.[5]、山藥DioscoreaoppositeThunb.[6]、當(dāng)歸Angelicasinensis(Oliv.) Diels[7]、甘草GlycyrrhizauralensisFisch.[8]等植物中克隆出了actin基因，該基因在此類植物中均呈現(xiàn)高度保守。

紅芪Hedysari Radix為豆科植物多序巖黃芪HedysarumpolybotrysHand.-Mazz.的干燥根，是甘肅省的特產(chǎn)藥材。其功效與黃芪相似，中醫(yī)臨床常用于治療氣虛下陷、癰疽瘡瘍、久潰不斂等證[9]。現(xiàn)代藥理研究表明，紅芪具有抗癌、抗氧化、抗炎、抗病毒等藥理作用。此外，紅芪還可以提高周圍神經(jīng)再生期間擴(kuò)增[10-11]、增強(qiáng)放射敏感性[12]、延緩肺纖維化[13]、防治肝纖維化[14]及抗骨質(zhì)疏松[15]。長(zhǎng)期以來(lái)，對(duì)紅芪的研究主要集中在對(duì)其活性成分的分析和分離中，但是關(guān)于紅芪actin基因的研究尚未見報(bào)道。本研究主要通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)技術(shù)和T-載體PCR克隆技術(shù)，首次克隆出了紅芪的actin基因片段，為深入研究紅芪其他優(yōu)異功能基因的表達(dá)以及調(diào)控提供參考。

1 材料

1.1 試藥

紅芪種子于2019年3月購(gòu)于甘肅隴南武都區(qū)紅芪種植農(nóng)戶，經(jīng)甘肅中醫(yī)藥大學(xué)李成義教授鑒定為多序巖黃芪HedysarumpolybotrysHand.-Mazz.的種子，剝?nèi)デv膜，挑選種粒均勻飽滿、沒(méi)有蟲害破洞的種子作為培育材料。將種子用2%次氯酸滅菌浸泡5 min，然后用75%的濃硫酸浸泡4 min打破休眠，再用流水沖洗30 min，最后將處理過(guò)的種子擺放在潤(rùn)濕濾紙的培養(yǎng)皿上，放在人工植物培養(yǎng)箱中發(fā)芽(溫度25 ℃，濕度65%～80%，光照8 h·d-1)。待到種子發(fā)芽，將其移栽至裝有蛭石和珍珠巖(5∶1)混合基質(zhì)的花盆中，用不含瓊脂的MS培養(yǎng)基溶液灌溉以保證其養(yǎng)分。以生長(zhǎng)7周的幼苗作為提取RNA的實(shí)驗(yàn)材料。

植物總RNA小量抽提試劑盒(Magen生物有限公司)；cDNA合成試劑盒、核酸染料Gelview、PCR擴(kuò)增試劑盒、50×TAE Buffer、快捷型瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒、DNA Marker DL5000(北京Bio Teke有限公司)；T-載體PCR克隆試劑盒、感受態(tài)細(xì)胞、SOC培養(yǎng)基(TaKaRa公司)；Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑預(yù)混液、SYBR Green?Premix ProTaqHS qPCR Kit(湖南艾科瑞生物工程有限公司)；其他試劑均為分析純，購(gòu)于Biosharp公司；引物由寶生物工程(大連)有限公司合成。

1.2 儀器

Nano Drop 2000c型超微量分光光度計(jì)(上海土森視覺科技有限公司)；EC250-90型凝膠電泳儀(北京六一生物科技有限公司)；ChemiDoc XRS+型凝膠成像分析系統(tǒng)(北京龍躍生物科技發(fā)展有限公司)；FTC-8000型PCR儀(加拿大楓嶺生物技術(shù)有限公司)。

2 方法

2.1 紅芪總RNA的提取和cDNA的合成

取生長(zhǎng)7周的紅芪幼苗100～150 mg，置于液氮中迅速研磨成細(xì)粉末，按照植物總RNA小量抽提試劑盒說(shuō)明書步驟提取總RNA，吸取RNA 1.5 μL在超微量分光光度計(jì)上檢測(cè)其質(zhì)量分?jǐn)?shù)和純度，將剩余的RNA分裝置于200 μL的無(wú)酶離心管中，置于-80 ℃冰箱保存。取RNA 5 μL用1%非變性瓊脂糖凝膠電泳鑒定其完整性。cDNA模板的合成參照說(shuō)明書步驟進(jìn)行，產(chǎn)物在-20 ℃保存。

2.2 引物設(shè)計(jì)與合成

在美國(guó)國(guó)家生物信息中心(NCBI)網(wǎng)上找到甘草(G.uralensisFisch.，EU190972)、大豆[Glycinemax(L.) Merr.，NM_001358094]、紅車軸草(TrifoliumpratenseL.，AY372368)、蒺藜苜蓿(MedicagotruncatulaL.，XM_024774779)、檸條錦雞兒(CaraganakorshinskiiKom.，F(xiàn)J485727)等豆科植物actin基因CDS序列進(jìn)行同源比對(duì)，找出高度保守區(qū)段，利用Primer 6.0軟件設(shè)計(jì)引物。引物序列為actin-F：5′-ATGGTTGGG ATGGGTCAAAAGG-3′；actin-R：5′-TGTT GGAAGGTGCTGAGGGATG-3′。推測(cè)其片段長(zhǎng)度950 bp左右。

2.3 RT-PCR擴(kuò)增

以上述反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為PCR擴(kuò)增模板，50 μL反應(yīng)體系包括2×SuperTaqPCR MasterMix 25 μL、上下游引物各5 μL(10 μmol·L-1)、cDNA模板15 μL。反應(yīng)程序：95 ℃起始模板變性3 min；95 ℃變性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸1 min，33個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。反應(yīng)結(jié)束得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)過(guò)1%非變性瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像分析系統(tǒng)檢測(cè)目的片段位置，然后用快捷型瓊脂糖DNA 回收試劑盒回收片段。

2.4 陽(yáng)性克隆的篩選與鑒定

根據(jù)T-載體PCR產(chǎn)物克隆試劑盒說(shuō)明書，將回收片段與pMD19-T Vertor連接，加入等量的Solution I 16 ℃反應(yīng)30 min，然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至JM109感受態(tài)細(xì)胞100 μL中，冰浴30 min，42 ℃熱擊42 s，再冰浴1 min，加入SOC培養(yǎng)基890 μL，37 ℃振蕩60 min，并接種到含有氨芐青霉素的LB瓊脂平板培養(yǎng)基上，37 ℃過(guò)夜。次日早上隨機(jī)挑取白色菌落7株，進(jìn)行菌落PCR鑒定陽(yáng)性克隆，用1%非變性瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增結(jié)果，挑選陽(yáng)性菌株用無(wú)菌水稀釋，送至西安擎科澤西生物科技有限責(zé)任公司進(jìn)行測(cè)序。

2.5 Actin基因表達(dá)特性分析

用qRT-PCR技術(shù)分析紅芪actin基因在根、莖、葉中的相對(duì)表達(dá)水平。取用MS營(yíng)養(yǎng)液處理過(guò)的7周齡紅芪的根、莖、葉，分別提取總RNA，通過(guò)Evo M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA。設(shè)計(jì)qRT-PCR引物為actin-F：5′-CAACCCAAAGGCCA ACAGA-3′，actin-R 5′-CACACCATCACCA GAGTCCAA-3′。25 μL反應(yīng)體系為2×SYBR?Green ProTaqHS Premix 12.5 μL，上下游引物各0.5 μL，cDNA模板1 μL，無(wú)酶水10.5 μL。反應(yīng)程序：95 ℃，30 s；95 ℃，5 s，60 ℃，30 s，循環(huán)40次；熔解階段設(shè)置成FTC-8000 PCR儀默認(rèn)值。數(shù)據(jù)分析采用FTC-8000型PCR儀系統(tǒng)軟件和Excel 2016。

3 結(jié)果與分析

3.1 RNA純度檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)采用7周紅芪幼苗提取的總RNA，使用超微量紫外分光光度計(jì)測(cè)得A260/A280值為2.03(A表示吸光度)，經(jīng)1%非變性瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示，28 S RNA和18 S RNA條帶清晰可見(見圖1)，沒(méi)有雜帶，并且前者的熒光強(qiáng)度約為后者的2倍，則說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)提取的總RNA純度較高，可以用于后續(xù)RT-PCR。

注：M.Marker；1.總RNA。圖1 紅芪幼苗總RNA電泳圖

3.2 紅芪actin基因核心片段的克隆

以紅芪幼苗總RNA為模板，通過(guò)RT-PCR成了1條長(zhǎng)度約為950 bp的條帶(見圖2)，并且上下沒(méi)有雜帶，推測(cè)該片段就是所要的目的基因，還有待進(jìn)一步鑒定。

注：M.Marker；1～2.RT-PCR產(chǎn)物。圖2 紅芪actin基因核心片段RT-PCR產(chǎn)物電泳圖

3.3 陽(yáng)性克隆鑒定

將回收的目的片段與T載體連接后，次日挑選7株菌落采用通用引物進(jìn)行擴(kuò)增，經(jīng)1%非變性瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，5株菌落的條帶位置在約950 bp，與RT-PCR擴(kuò)增的位置一致，將這5個(gè)陽(yáng)性克隆菌液送至西安擎科澤西生物科技有限責(zé)任公司進(jìn)行測(cè)序，序列見圖3。

圖3 Actin基因片段的核苷酸序列及推測(cè)的氨基酸序列

3.4 序列分析

經(jīng)過(guò)測(cè)序得到了一段946 bp的actin基因片段序列，編碼284個(gè)氨基酸。將該序列在GenBank進(jìn)行Blast比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該序列與甘草、花苜蓿、紅車軸草的核苷酸同源性分別高達(dá)95.44%、94.42%、94.20%，將推測(cè)的紅芪actin氨基酸序列與其他10種不同植物的進(jìn)行多重比對(duì)，非保守氨基酸共12個(gè)(見圖4)，相似性高達(dá)97%以上。結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)所克隆的基因片段是紅芪的actin基因片段，進(jìn)一步驗(yàn)證了actin具有高度保守性。

3.5 紅芪actin基因在不同部位中的表達(dá)

通過(guò)qRT-PCR法檢測(cè)紅芪actin基因在根、莖、葉不同部位中的Ct值，每個(gè)樣品重復(fù)4次，Ct值為18～19，利用Excel 2016進(jìn)行Ct值數(shù)據(jù)分析，計(jì)算各樣品Ct值的標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)，SD越小，基因穩(wěn)定性越好，若SD>1，則認(rèn)為該基因不穩(wěn)定[16-17]。本實(shí)驗(yàn)所克隆的actin基因，在根、莖、葉不同部位中的Ct值的SD分別為0.07、0.16和0.08，遠(yuǎn)小于1，說(shuō)明該基因在紅芪的不同部位中表達(dá)穩(wěn)定，可以作為研究紅芪其他優(yōu)良基因的內(nèi)參基因。紅芪actin基因的熔解曲線(見圖4)和不同組織中的Ct值柱狀圖(見圖5)顯示，該基因熔解曲線有良好的特異性，表現(xiàn)為單一峰，無(wú)非特異性熒光峰；且actin基因在紅芪不同部位中表達(dá)量差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

圖4 Actin基因溶解曲線

圖5 Actin基因在紅芪不同部位的表達(dá)量

4 討論

Actin是由375～377個(gè)氨基酸組成的單一多肽鏈的球狀蛋白[18]，廣泛存在于高等植物的各種組織細(xì)胞中，如根毛、莖韌皮部、葉表皮細(xì)胞、葉鞘細(xì)胞、花粉、卷須等，并且在維持植物細(xì)胞的正常生長(zhǎng)、分化和繁殖等方面都具有重要意義[19]。Actin基因是由多基因家族編碼的，因而形成了多種肌動(dòng)蛋白異型體[20]。Hightowe等[21]研究表明，大豆與玉米肌動(dòng)蛋白間存在8%～10%的氨基酸取代，而大豆肌動(dòng)蛋白異型體之間僅存在6%～9%的氨基酸取代，因此，植物肌動(dòng)蛋白具有高度的保守性。大量研究表明，actin基因無(wú)論是核苷酸序列還是其編碼的氨基酸序列都具有高度的保守性和同源性。本實(shí)驗(yàn)所克隆的紅芪actin基因與其他植物的核苷酸序列相似性在90%以上，其編碼的氨基酸序列的相似性在97%以上，這將進(jìn)一步證實(shí)了actin基因是一種高度保守的管家基因。

近年來(lái)紅芪在藥用和保健品中的應(yīng)用受到越來(lái)越多的重視，對(duì)其品質(zhì)的要求也在不斷提高。目前研究發(fā)現(xiàn)，紅芪的主要活性成分屬于異黃酮類化合物，該類化合物在治療心血管疾病、骨質(zhì)疏松及神經(jīng)退行性疾病方面具有良好的效果[22]。然而在紅芪異黃酮類化合物合成機(jī)制及一些功能基因表達(dá)和調(diào)控的深入研究中往往需要內(nèi)參對(duì)照。目前在NCBI網(wǎng)上數(shù)據(jù)庫(kù)中未能搜索到紅芪actin基因的序列。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，紅芪actin基因在各部位中的Ct值穩(wěn)定，保守性高，因此紅芪actin基因可以作為研究其他優(yōu)異基因表達(dá)的內(nèi)參基因。本研究結(jié)果為紅芪其他異黃酮合成酶基因的表達(dá)研究及紅芪次生代謝產(chǎn)物與基因表達(dá)的相關(guān)性闡述提供了參考。