王虹，蘇暢，張文嫻，劉雪婷，呂浩鋒，王鐵杰，魏鋒，馬雙成，王淑紅*

1.深圳市藥品檢驗(yàn)研究院，廣東 深圳 518057；2.中國食品藥品檢定研究院 中藥民族檢定所，北京 100050

鉤吻是兩廣地區(qū)的地方習(xí)用藥材[1-2]，為馬錢科植物鉤吻Gelsemiumelegans(Gardn.et Champ.) Benth.的干燥根和莖，具有消腫拔毒、祛風(fēng)止痛的功效。因其為毒性藥材，故又名斷腸草，在民間多以外敷，用于消腫止痛[3]。北美鉤吻G.sempervirens(L.) J.St.-Hil.原產(chǎn)于北美，通過園藝引入中國，同為毒性植物[4]。由于北美鉤吻與鉤吻為馬錢科鉤吻屬僅有的2個(gè)近緣物種，且兩者為戶外常見的品種，容易被采挖帶來誤食風(fēng)險(xiǎn)。五指毛桃為?？浦参锎秩~榕FicushirtaVahl.的干燥根，味甜，性平，具有益氣健脾、祛痰化濕，是華南地區(qū)習(xí)用藥食同源的中藥材[5]。近年來，將鉤吻的根誤認(rèn)為是五指毛桃而導(dǎo)致的中毒案件時(shí)有發(fā)生[6-7]，但目前尚無用于區(qū)分五指毛桃與鉤吻屬植物的分子鑒別方法。本研究采用DNA條形碼鑒定技術(shù)，選取內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)2(ITS2)與psbA-trnH 2種序列對(duì)鉤吻、北美鉤吻及易混品種五指毛桃進(jìn)行測(cè)序和分子鑒定，為鉤吻屬植物的鑒別及確保五指毛桃的藥食兩用安全性提供參考。

1 材料

1.1 藥材

本研究收集的鉤吻、北美鉤吻和五指毛桃藥材樣本均經(jīng)中國食品藥品檢定研究院張繼主任藥師鑒定，樣品信息見表1。另從GenBank數(shù)據(jù)庫下載鉤吻ITS2序列3條、psbA-trnH序列4條，北美鉤吻ITS2序列1條、psbA-trnH序列1條，五指毛桃ITS2序列3條、psbA-trnH序列1條，序列信息見表2。

表1 鉤吻、北美鉤吻和五指毛桃樣品信息

表2 鉤吻、北美鉤吻和五指毛桃GenBank來源序列信息

1.2 試劑

植物基因組DNA提取試劑盒(天根生化科技有限公司)；2×TaqPCR Master Mix(北京艾德萊生物科技有限公司)；引物合成與測(cè)序由上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司負(fù)責(zé)。

1.3 儀器

VERITI聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)儀(ABI公司)；Nanodrop 2000型核酸蛋白分析儀(Thermo公司)；PowerPac Basic型電泳系統(tǒng)(Bio-Rad公司)；GBOX F3型凝膠成像系統(tǒng)(Syngene公司)。

2 方法

2.1 總DNA提取

將植物葉片或藥材用無水乙醇擦拭表面消毒，室溫放置直至乙醇充分散盡后，用液氮研磨至細(xì)粉。稱取細(xì)粉100 mg，采用植物基因組DNA提取試劑盒提取基因組DNA，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2 PCR擴(kuò)增與測(cè)序

采用ITS2和psbA-trnH條形碼通用引物[8]進(jìn)行模板DNA質(zhì)量的考察和DNA條形碼鑒別，引物序列見表3。PCR反應(yīng)體積25 μL，包含2×TaqPCR Master Mix 12.5 μL，引物(2.5 μmol·L-1)各1.0 μL，總DNA 2.0 μL，用滅菌超純水補(bǔ)足反應(yīng)體積。ITS2擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃，5 min；94 ℃，30 s，56 ℃，30 s，72 ℃，45 s(循環(huán)40次)；72 ℃延伸10 min。psbA-trnH條形碼的擴(kuò)增程序?yàn)?4 ℃，5 min；94 ℃，1 min，55 ℃，1 min，72 ℃，1.5 min(循環(huán)30次)；72 ℃延伸7 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)上海美吉醫(yī)藥科技有限公司測(cè)序。

表3 引物序列

2.3 分子生物學(xué)數(shù)據(jù)分析

采用Codon Code Aligner軟件對(duì)測(cè)序峰圖和序列進(jìn)行校對(duì)、拼接并去除正反向引物序列。ITS2序列需登陸ITS2 Database網(wǎng)站(http：//its2.bioapps.biozentrum.uni-wuerzburg.de)去除各樣品序列兩端5.8 S和28 S區(qū)。采用BankIt工具在GenBank數(shù)據(jù)庫(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/submit/)中提交ITS2與psbA-trnH序列。采用BioEdit軟件進(jìn)行ITS2和psbA-trnH基因的多序列比對(duì)，查看并分析堿基變異位點(diǎn)。采用MEGA 5.1軟件的Kimura 2-parameter(K2P)雙參數(shù)模型計(jì)算進(jìn)行種間、種內(nèi)遺傳距離分析，并基于鄰接(neighbor-joining，NJ)法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

3 結(jié)果

3.1 psbA-trnH序列特征

堿基序列分析結(jié)果表明，鉤吻的psbA-trnH序列長度為540～546 bp，GC占比為26%～27%，具有4種單倍型；北美鉤吻的psbA-trnH序列與鉤吻存在明顯差異，長度僅為286 bp，GC占比為32%～33%，具有2種單倍型；五指毛桃基原植物粗葉榕樣本得到的psbA-trnH序列長度為440 bp，GC占比為24%，只有1種單倍型(見表4)。K2P參考模型計(jì)算的種內(nèi)和種間的遺傳距離結(jié)果表明，鉤吻、北美鉤吻和五指毛桃的psbA-trnH序列平均遺傳距離分別為0.005 606、0.003 506和0，種內(nèi)變異較小；但五指毛桃的psbA-trnH序列堿基序列與鉤吻和北美鉤吻具顯著差異，同時(shí)鉤吻和北美鉤吻的最大種內(nèi)遺傳距離小于最小種間遺傳距離(見表4)。但五指毛桃根類藥材樣本(Fh01、Fh02)未成功擴(kuò)增出psbA-trnH序列，這可能是因?yàn)樵撐锓N的根部不含有葉綠體，因此無法得到葉綠體psbA-trnH基因序列。因此psbA-trnH序列可作為鉤吻和北美鉤吻鑒定首選DNA條形碼。

3.2 ITS2序列特征

堿基序列分析結(jié)果表明，鉤吻的ITS2序列長度為228～230 bp，GC占比為72%～73%，具有3種單倍型，種內(nèi)變異位點(diǎn)較少；北美鉤吻ITS2序列長度為228～229 bp，GC占比為69%～70%，具有2種單倍型；K2P參考模型計(jì)算的種內(nèi)和種間遺傳距離結(jié)果表明，鉤吻、北美鉤吻和五指毛桃的ITS2序列的種內(nèi)的平均遺傳距離分別為0.002 937、0.018 200和0.008 016，種內(nèi)變異較?。坏逯该业腎TS2堿基序列與鉤吻和北美鉤吻具有顯著差異，同時(shí)鉤吻和北美鉤吻的最大種內(nèi)遺傳距離小于最小種間遺傳距離(見表4)，表明ITS2序列既可作為鉤吻與北美鉤吻的DNA鑒別條形碼，也可以作為區(qū)分五指毛桃與鉤吻屬植物的DNA鑒定條形碼。

表4 鉤吻、北美鉤吻ITS2和psbA-trnH序列分析

3.3 系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建與聚類分析

基于ITS2序列和psbA-trnH序列采用鄰接法分別建立系統(tǒng)進(jìn)化樹，并以此進(jìn)行鉤吻、北美鉤吻和五指毛桃的聚類分析。結(jié)果顯示，鉤吻和北美鉤吻在2個(gè)系統(tǒng)進(jìn)化樹中均聚集成為第一分支，五指毛桃聚為另一分支，此外鉤吻和北美鉤吻又分別聚為兩級(jí)分支，這說明采用2種DNA條形碼序列建立的進(jìn)化樹均能將鉤吻屬植物與五指毛桃進(jìn)行有效區(qū)分(見圖1～2)。

圖1 基于ITS2序列構(gòu)建鉤吻、北美鉤吻與五指毛桃NJ樹

圖2 基于psbA-trnH序列構(gòu)建鉤吻、北美鉤吻與五指毛桃NJ樹

但在ITS2系統(tǒng)進(jìn)化樹中，鉤吻存在不明顯的分支亞群，且支持率較低(支持率為60%、93%)；而鉤吻在psbA-trnH系統(tǒng)進(jìn)化樹中無分支亞群，且支持率為100%。這可能是在不同DNA條形碼序列中，鉤吻屬植物的種內(nèi)變異和種間差異的結(jié)果不同導(dǎo)致。從聚類分析結(jié)果的穩(wěn)定性方面分析，psbA-trnH序列更優(yōu)于ITS2序列。

4 討論

DNA條形碼技術(shù)具有快速、準(zhǔn)確等特點(diǎn)，在物種鑒定領(lǐng)域迅猛發(fā)展。對(duì)于樣本量少、性狀相近的中藥品種，DNA條形碼技術(shù)具有極大優(yōu)勢(shì)，目前已成為中藥傳統(tǒng)鑒定方法的重要補(bǔ)充[9-10]。陳士林課題組以大量的藥用植物及其相關(guān)物種作為研究對(duì)象，對(duì)7個(gè)候選DNA條形碼進(jìn)行篩選和深入分析，最終確定以ITS2為主的藥用植物鑒定的條形碼原則[11]，目前已收載于《中華人民共和國藥典》2015年版四部“中藥材DNA條形碼分子鑒定法指導(dǎo)原則”及一些著作中[8，12]，對(duì)中藥DNA條形碼的標(biāo)準(zhǔn)化做出了卓越的貢獻(xiàn)。ITS2區(qū)在薔薇科、蕓香科、菊科等大部分藥材品種中具有較高的鑒定成功率，這是由于ITS2區(qū)在這些物種間具有較快的進(jìn)化速率，因此產(chǎn)生較多的種間差異位點(diǎn)[13-16]。本研究結(jié)果表明，ITS2區(qū)和psbA-trnH區(qū)序列均可作為鉤吻屬植物鑒定的DNA條形碼，但psbA-trnH區(qū)在鉤吻屬植物中堿基序列長度、種間變異位點(diǎn)數(shù)量均具有顯著差異，同時(shí)系統(tǒng)進(jìn)化樹聚類結(jié)果穩(wěn)定性更強(qiáng)，因此psbA-trnH序列比ITS2序列更適合作為鉤吻屬植物鑒別的DNA條形碼。psbA-trnH基因是葉綠體psbA和trnH基因之間的一段非編碼區(qū)，進(jìn)化速度較快，雖然目前作為中藥基原鑒定的備選DNA條形碼，但也有研究表明，其對(duì)于石斛屬植物也具有良好的鑒別能力[17]，同時(shí)對(duì)于忍冬屬植物和連翹屬植物的鑒別甚至優(yōu)于ITS2條形碼，甚至還可對(duì)連翹藥材的產(chǎn)地進(jìn)行鑒別，表明對(duì)于某些中藥品種可將psbA-trnH作為主要鑒別條形碼。

鉤吻和北美鉤吻是具有多個(gè)種內(nèi)變異位點(diǎn)的近緣植物，若采用序列相似度或序列變異位點(diǎn)作為鑒別指標(biāo)，若物種進(jìn)化出新的變異位點(diǎn)，可能會(huì)造成檢驗(yàn)人員的困擾。采用DNA條形碼系統(tǒng)進(jìn)化樹進(jìn)行評(píng)價(jià)，聚類結(jié)果更直觀，因此更適合質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的結(jié)果表述，可作為中藥DNA條形碼方法的另一種結(jié)果表述形式。本研究還發(fā)現(xiàn)，鉤吻與北美鉤吻的psbA-trnH序列長度存在顯著差異，因此無需進(jìn)行PCR產(chǎn)物的測(cè)序，可直接采用瓊脂糖凝膠電泳的方法根據(jù)DNA條帶分子量進(jìn)行快速鑒定。

鉤吻屬植物因其花朵繁盛、花香清幽，是戶外常見的花卉園藝植物[18-21]。但鉤吻屬植物含有吲哚類生物堿，也是毒性植物。其中鉤吻在我國屬于區(qū)域性使用的藥材，但因其應(yīng)用范圍較小，且多以外用，因此尚未在藥用領(lǐng)域發(fā)現(xiàn)質(zhì)量安全問題。但鉤吻作為劇毒的中藥材，因其花與金銀花相似、根與五指毛桃相似，故常因誤認(rèn)采挖食用而導(dǎo)致中毒事件，造成了嚴(yán)重后果。鉤吻屬另一物種北美鉤吻也為劇毒植物，因此具有較高的安全風(fēng)險(xiǎn)[22]。本研究采用ITS2和psbA-trnH條形碼建立了鉤吻、北美鉤吻、五指毛桃的鑒別方法，為藥食同源的有毒易混品的鑒別提供了新思路，為保障食用和用藥安全提供了有效手段。