蘇孟勤

近年來，兒科手術(shù)的開展越來越廣泛，嬰幼兒接觸各類麻醉藥物的機(jī)會(huì)也不斷增加。兒童對(duì)手術(shù)的配合性較差，手術(shù)時(shí)首選的麻醉方式是全身麻醉，氯胺酮、咪達(dá)唑侖、異丙酚等全麻藥物用于嬰幼兒全身麻醉雖然能夠取得確切的鎮(zhèn)靜效果，但也會(huì)對(duì)處于發(fā)育期的神經(jīng)功能造成損害并可能影響成年后的神經(jīng)功能[1-3]。異丙酚是全身麻醉中常用的短效靜脈麻醉藥物，具有起效快、蘇醒時(shí)間短、持續(xù)輸注后無蓄積效應(yīng)等優(yōu)勢，用于麻醉誘導(dǎo)及維持、重癥監(jiān)護(hù)病房鎮(zhèn)靜等均能取得理想的效果。但是，異丙酚是否適用于嬰幼兒手術(shù)的全身麻醉、對(duì)發(fā)育期的中樞神經(jīng)系統(tǒng)是否產(chǎn)生毒性作用仍缺乏足夠的數(shù)據(jù)支持。海馬對(duì)學(xué)習(xí)、記憶以及認(rèn)知等神經(jīng)功能的發(fā)育具有重要意義，糖原合成酶激酶-3β(GSK-3β)/β-連環(huán)素信號(hào)(β-catenin)已經(jīng)在老年小鼠中被證實(shí)能夠通過影響海馬神經(jīng)元的凋亡來造成神經(jīng)功能的損害[4-5]?；谝陨险J(rèn)識(shí)，本研究以新生大鼠為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，探討了異丙酚是否通過GSK-3β/β-catenin通路影響大鼠認(rèn)知功能及海馬神經(jīng)元凋亡。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠：7日齡，體質(zhì)量8～15 g，購自上海斯萊克實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(滬)2017-0005。飼養(yǎng)環(huán)境：溫度為25 ℃、濕度為40%～50%。主要試劑：異丙酚購自意大利阿斯利康公司，GSK-3β抑制劑SB216763購自美國Sigma公司，TUNEL凋亡試劑盒購自美國ROCHE公司，GSK-3β、β-catenin、Bax、Bcl-2、Caspase-3一抗均購自美國CST公司。主要儀器：Morris水迷宮購自上海吉量科技公司，熒光顯微鏡及照相系統(tǒng)購自日本Nikon公司，Western blot電泳儀、顯影儀購自上海天能公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 動(dòng)物分組及給藥 30只實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為3組：對(duì)照組、異丙酚組、異丙酚+SB216763組，每組10只。對(duì)照組給予1 mL生理鹽水溶解腹腔注射，每天1次，連續(xù)7天；異丙酚組給予75 mg/kg異丙酚(1 mL生理鹽水溶解)腹腔注射，每天1次，連續(xù)7天；異丙酚+SB216763組先給予10 mg/kg SB216763尾靜脈注射液，而后給予75 mg/kg異丙酚腹腔注射，每天1次，連續(xù)7天。

1.2.2 水迷宮測試 干預(yù)結(jié)束后2周，進(jìn)行Morris水迷宮測試，水迷宮直徑110 cm，高度50 cm，被2條通過圓心且互相垂直的假想線分為4個(gè)象限，在一個(gè)象限內(nèi)的水面下1 cm放置直徑10 cm的平臺(tái)。第1～5天進(jìn)行定位航行實(shí)驗(yàn)，每只大鼠每天進(jìn)行4次，每次間隔時(shí)間90 s，在第5天時(shí)記錄大鼠在90 s內(nèi)找到平臺(tái)的時(shí)間，即逃逸潛伏期，及尋找平臺(tái)路徑的長度；第6天進(jìn)行空間探索實(shí)驗(yàn)，撤出平臺(tái)并記錄大鼠在90 s內(nèi)在平臺(tái)所在象限內(nèi)探索的時(shí)間以及穿越平臺(tái)所在位置的次數(shù)。

1.2.3 細(xì)胞凋亡率測定 完成水迷宮測試后處死大鼠，解剖得到海馬后將一半海馬組織放入4%多聚甲醛中固定，而后在冰凍切片機(jī)上進(jìn)行連續(xù)切片，厚度20 μm，裱于經(jīng)明膠處理的玻片后用TUNEL試劑盒進(jìn)行染色并在熒光顯微鏡的高倍鏡下觀察，綠色熒光的細(xì)胞為凋亡細(xì)胞，隨機(jī)取10個(gè)視野并對(duì)凋亡細(xì)胞數(shù)目及細(xì)胞總數(shù)進(jìn)行計(jì)數(shù)，計(jì)算細(xì)胞凋亡率=凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)。

1.2.4 GSK-3β/β-catenin通路基因及凋亡基因的Western blot檢測 取1.2.3中解剖得到的另一半海馬組織，液氮冷凍后制備勻漿液，提取總蛋白，用BCA法對(duì)總蛋白定量后取50μg總蛋白進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、抗體孵育，最后在顯影儀中進(jìn)行顯影，以β-actin為內(nèi)參對(duì)基因的相對(duì)表達(dá)水平進(jìn)行定量分析。

2 結(jié)果

2.1 3組間Morris水迷宮測試結(jié)果比較 異丙酚組逃逸潛伏期和尋找平臺(tái)路徑長度長于對(duì)照組，探索時(shí)間和穿越平臺(tái)次數(shù)均短于對(duì)照組；異丙酚+SB216763組逃逸潛伏期和尋找平臺(tái)路徑長度短于異丙酚組，探索時(shí)間和穿越平臺(tái)次數(shù)均長于異丙酚組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1 3組間Morris水迷宮測試結(jié)果的比較

2.2 3組間海馬GSK-3β和β-catenin表達(dá)水平比較 與對(duì)照組相比，異丙酚組海馬GSK-3β表達(dá)水平顯著升高，β-catenin表達(dá)水平顯著降低；與異丙酚組比較，異丙酚+SB216763組海馬GSK-3β表達(dá)水平顯著降低，β-catenin表達(dá)水平顯著升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表2和圖1。

圖1 Western blot檢測3組海馬中GSK-3β、β-catenin的表達(dá)水平。

表2 3組間海馬GSK-3、β-catenin表達(dá)水平比較

2.3 3組間海馬神經(jīng)元凋亡率比較 對(duì)照組、異丙酚組、異丙酚+SB216763組海馬神經(jīng)元凋亡率分別為2.15±0.52%、13.37±2.31%、4.85±0.88%。3組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。異丙酚組、異丙酚+SB216763組及對(duì)照組的凋亡率依次降低，組間比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見圖2。

圖2 TUNEL試劑盒檢測3組海馬的神經(jīng)元凋亡率

2.4 3組間海馬Bax、Bcl-2、Caspase-3表達(dá)比較 異丙酚組海馬Bax、Caspase-3表達(dá)水平高于對(duì)照組，Bcl-2表達(dá)水平低于對(duì)照組；異丙酚+SB216763組海馬Bax、Caspase-3表達(dá)水平低于異丙酚組，Bcl-2表達(dá)水平高于異丙酚組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表3和圖3。

表3 3組間海馬Bax、Bcl-2、Caspase-3表達(dá)的比較

圖3 Western blot檢測3組海馬中Bax、Bcl-2、Caspase-3的表達(dá)水平。

3 討論

多種全身麻醉藥物對(duì)嬰幼兒處于發(fā)育期的中樞神經(jīng)功能具有損傷作用，異丙酚是常用的全麻藥物，用于兒科手術(shù)的安全性仍未明確。本研究以7日齡大鼠為對(duì)象的Morris水迷宮測試結(jié)果顯示，多次腹腔注射異丙酚后大鼠的各項(xiàng)Morris水迷宮測試結(jié)果均明顯變差，海馬中GSK-3β的表達(dá)增多、β-catenin的表達(dá)減少；而在注射異丙酚前給予GSK-3β抑制劑SB216763尾靜脈注射能夠使各項(xiàng)Morris水迷宮測試結(jié)果得到改善。GSK-3β對(duì)β-catenin具有抑制作用，GSK-3β受抑制后β-catenin的降解減少并發(fā)生蓄積[6-7]。本研究結(jié)果表明異丙酚能夠造成新生大鼠的神經(jīng)功能發(fā)生損害，并且引起GSK-3β表達(dá)增多，增加GSK-3β對(duì)β-catenin的降解是異丙酚產(chǎn)生神經(jīng)損害作用的分子途徑。

神經(jīng)元凋亡是麻醉藥物引起神經(jīng)功能損害的重要途徑[8-9]，本研究通過TUNEL法對(duì)海馬中神經(jīng)元凋亡的分析結(jié)果發(fā)現(xiàn)，多次腹腔注射異丙酚后7日齡大鼠的海馬神經(jīng)元凋亡率明顯增加，而GSK-3β抑制劑能夠使海馬神經(jīng)元的凋亡率下降。線粒體途徑凋亡是細(xì)胞凋亡的重要機(jī)制之一，Bcl-2能夠抑制線粒體途徑凋亡，Bax能夠促進(jìn)線粒體途徑凋亡，兩者最終作用于Caspase-3并通過Caspase-3的活性來介導(dǎo)細(xì)胞凋亡[10-11]。本研究對(duì)海馬中凋亡基因的結(jié)果發(fā)現(xiàn)：多次腹腔注射異丙酚后7日齡大鼠海馬中Bcl-2的表達(dá)減少、Bax及Caspase-3的表達(dá)增加，而GSK-3β抑制劑能夠使海馬中Bcl-2的表達(dá)增多，Bax及Caspase-3的表達(dá)減少。以上結(jié)果表明異丙酚能夠通過GSK-3β/β-catenin通路來促進(jìn)海馬神經(jīng)元發(fā)生線粒體途徑凋亡。