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        動物血清的成分及在細胞培養(yǎng)中的作用

        2020-03-03 21:10:31石嘉琛王家敏喬自林
        甘肅畜牧獸醫(yī) 2020年10期
        關(guān)鍵詞:胎牛細胞培養(yǎng)培養(yǎng)基

        石嘉琛,王家敏,喬自林 *

        (1.西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心 甘肅省動物細胞技術(shù)創(chuàng)新中心,甘肅 蘭州 730030;2.西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心 生物工程與技術(shù)國家民委重點實驗室,甘肅 蘭州 730030;3.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)工程學(xué)院,甘肅 蘭州 730030)

        20世紀50年代,研究人員開始將血清作為一種細胞培養(yǎng)基添加物使用,獲得了良好的培養(yǎng)效果。添加血清的培養(yǎng)基的效果與未添加血清的培養(yǎng)基相比,細胞活率更高,生長密度更大,持續(xù)培養(yǎng)時間更長。一些要求較高的細胞需要在培養(yǎng)體系加入自體血清,如大鼠關(guān)節(jié)軟骨細胞[1]、豬耳緣成纖維細胞[2]等。新生牛血清或胎牛血清是細胞培養(yǎng)中常用的生長補充劑,主要是因為它具有高水平的生長刺激因子和低水平的生長因子。使用牛血清作為培養(yǎng)基添加劑在建立原代細胞培養(yǎng)、維持器官/組織外植體和干細胞繁殖的情況下仍然是必要的,因為血清具有促進分化的功能,還具有運輸攜帶激素(如轉(zhuǎn)運蛋白)、礦物質(zhì)和微量元素(如轉(zhuǎn)鐵蛋白)和脂質(zhì)的蛋白質(zhì)的功能,且含有貼附和擴散因子,在維持pH值或直接抑制蛋白酶作用方面也有一定效果,使用血清就不需要為每個細胞系和菌種優(yōu)化培養(yǎng)基,這可節(jié)省大量人力物力,加快研究進程[3]。

        1 血清所含成分對細胞培養(yǎng)的影響

        血清組成成分十分復(fù)雜,包含蛋白質(zhì),多肽,激素等一些細胞生長的有益因子,如白蛋白可作為載體蛋白攜帶小分子物質(zhì),維持細胞生長,還具有緩沖pH的作用。可能污染病毒、支原體等外源微生物的新生牛血清可通過滅能處理進行滅活,但同時可能使血清內(nèi)有利于細胞培養(yǎng)的生物活性物質(zhì)變性降解,從而影響細胞的培養(yǎng)[4]。一項關(guān)于胎牛血清組成的研究表明,隨著時間的增加,幾種細胞外基質(zhì)和結(jié)構(gòu)蛋白的數(shù)量以及營養(yǎng)相關(guān)蛋白、細胞擴散蛋白的數(shù)量都會發(fā)生變化,這種差異性不僅迫使大多數(shù)實驗室進行他們自己的胎牛血清和新生牛血清篩選,并且在此之后使用“預(yù)先選擇”的批次,它也常常使不同研究者的數(shù)據(jù)處理變得困難[5]。

        2 血清濃度對細胞培養(yǎng)的影響

        在一定范圍內(nèi),提高細胞培養(yǎng)基含有的血清含量,可促進細胞分化速度,但血清濃度過高會導(dǎo)致細胞生長狀態(tài)異常[6]。一般來講,在培養(yǎng)基中添加5%~20%的血清可滿足絕大多數(shù)細胞生長所需的營養(yǎng)物質(zhì)。采用T75方瓶和轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)PK15細胞時只需要在培養(yǎng)基中添加5%的血清即可生長狀態(tài)良好,經(jīng)過72 h的培養(yǎng)后,細胞增長倍數(shù)均為10倍以上[7]。

        細胞在含有一定培養(yǎng)基血清濃度的細胞培養(yǎng)基中生長時,血清所含的生長因子可維持細胞的快速生長,有助于阻止細胞的機械損傷[8]。一項培養(yǎng)基中血清添加量對于成纖維細胞的影響表明,10%血清濃度條件下成纖維細胞形態(tài)穩(wěn)定,增殖速率較高,但40%血清濃度對成纖維細胞有損害作用,出現(xiàn)了細胞數(shù)量下降的現(xiàn)象[9],肝細胞原代培養(yǎng)中血清濃度為20%時會對肝細胞造成一定傷害[10]。血清是細胞生物制品生產(chǎn)中的主要成本,幼小倉鼠腎細胞(BHK21細胞)經(jīng)過一段時間的馴化可以逐步適應(yīng)低血清培養(yǎng)條件,但其營養(yǎng)物質(zhì)代謝速率、乳酸和氨的積累速度降低[11]。添加15%FBS的培養(yǎng)基可取得較好的牛原代肌衛(wèi)星細胞和前體脂肪細胞共培養(yǎng)效果[12]。轉(zhuǎn)瓶培養(yǎng)是疫苗生產(chǎn)中常用的貼壁細胞培養(yǎng)方式,豬乙型腦炎病毒可在Vero細胞中增殖,維持液的血清濃度不僅影響細胞生長,對病毒效價也有一定影響,血清濃度在1%~4%范圍內(nèi)時,病毒毒價隨濃度升高而升高,維持液血清濃度超過 4%后,毒液的效價下降[13]。

        3 血清種類對培養(yǎng)效果的影響

        血清根據(jù)來源動物品種不同可分為人血清、馬血清和牛血清等。牛血清來源較豐富,目前廣泛應(yīng)用于細胞培養(yǎng)。牛血清制品可分為小牛血清、新生牛血清和胎牛血清,在這三種血清制品中,胎牛血清品質(zhì)最高,胎牛因未接觸到外界,血清中的細胞毒害成分最少,但其價格在牛血清中是最為昂貴的[15]。

        胎牛血清(Fetal Bovine Serum,簡稱FBS)是經(jīng)心臟采集230~240日齡的胎牛全血,分離血清,經(jīng)濾過除菌制成,是疫苗生產(chǎn)的重要原輔料之一[18]。胎牛血清是細胞培養(yǎng)中效果最好的天然培養(yǎng)基,可提供細胞貼壁、鋪展在塑料培養(yǎng)基質(zhì)上所需因子,還能發(fā)揮酸堿緩沖液作用[17]。新生牛血清指采集出生時間小于24 h的健康牛犢的血清,它是細胞培養(yǎng)中用量最大的天然培養(yǎng)基,含有血小板促生長因子、成纖維細胞生長因子、表皮細胞生長因子等,在可獲得較好的細胞生長增殖效果[19]。

        目前市場上血清種類繁多,李自良等[15]對國產(chǎn)胎牛血清、進口胎牛血清、國產(chǎn)新生牛血清對MDCK細胞促生長效果做了相關(guān)研究,結(jié)果表明,國產(chǎn)新生牛血清可連續(xù)傳代MDCK細胞,細胞生長良好,排列緊密,不同代次MDCK細胞長成致密單層時細胞形態(tài)基本一致,但新生牛血清的有效集落數(shù)低于胎牛血清,這可能與二者所含的激素和其他活性物質(zhì)等組分與比例不同有關(guān)。王梅珂等對于國產(chǎn)血清和進口血清對于Vero細胞形態(tài)、細胞匯合度的影響進行了研究,發(fā)現(xiàn)國產(chǎn)的一批血清細胞收獲量值大于3.00×108個/ml,且細胞相對增長率大于90%,與進口血清促細胞生長效果相近,可替代進口血清[16]。

        4 細胞培養(yǎng)使用血清存在的不足

        牛血清來源廣,即便是同一來源,同一批次的血清質(zhì)量也存在很大差異,具有因化學(xué)、蛋白質(zhì)方面差異和內(nèi)分泌參數(shù)的血清變異性,這提示我們在解釋使用血清補充劑可能具體定量的實驗結(jié)果產(chǎn)生干擾或調(diào)節(jié),血清作為細胞生長和維持的重要物質(zhì),在細胞培養(yǎng)中發(fā)揮重要作用的同時,也帶有許多至今無法解決的問題和弊端[20],如血清中成分復(fù)雜,不能準確加以區(qū)分血清批次間差異很大,且血清的保存期短,給批次生產(chǎn)的標準化和連續(xù)化帶來限制。牛血清在使用時需要低溫儲存,然后解凍使用,血清中的脂蛋白產(chǎn)生沉淀,營養(yǎng)價值流失,從而影響細胞的營養(yǎng)物質(zhì)供應(yīng),造成細胞生長緩慢。

        生物技術(shù)的發(fā)展、生物醫(yī)學(xué)的進步都離不開細胞培養(yǎng),很多牛血清供應(yīng)商為小型企業(yè),質(zhì)檢存在很多局限性,且生產(chǎn)環(huán)境是否合格無菌,設(shè)備的科技程度也因成本的限制而存在問題。2000年10月1日,《中國生物制品主要原輔材料質(zhì)控標準》開始實施,牛血清質(zhì)量雖有提升,但影響牛血清質(zhì)量的主要因素是大腸桿菌或噬菌體的污染,其次是細胞增殖檢查及細菌內(nèi)毒素[21]。此外,血清在培養(yǎng)基中的存在使產(chǎn)品的分離純化變得更加復(fù)雜,牛血清作為細胞培養(yǎng)常用的天然培養(yǎng)基,其成本較高,且易被外界的雜菌污染[22]。牛血清蛋白可能內(nèi)化在干細胞上,刺激產(chǎn)生免疫原性,因此,可能會產(chǎn)生許多潛在的問題,如病毒和朊病毒的傳播,或由于牛蛋白附著在細胞上而引起的免疫反應(yīng),這些細胞在移植后充當(dāng)抗原基質(zhì)。

        5 結(jié)語

        血清作為細胞培養(yǎng)中大量使用的培養(yǎng)基添加物,具有其他物質(zhì)無法比擬的優(yōu)勢,使用血清最大的缺點是其未經(jīng)測試的生物安全性和補充基本培養(yǎng)基的額外成本,針對這些問題,需要制定一個全面,科學(xué)的血清生產(chǎn)行業(yè)規(guī)范,加速產(chǎn)業(yè)升級,使用血清替代品,主要是使用化學(xué)確定的培養(yǎng)基,可減輕風(fēng)險,但目前血清仍然是建立和維持原代細胞系和連續(xù)細胞系的過程中使用最廣泛的添加物,對其化學(xué)組分的不明確也制約著血清的生產(chǎn)和質(zhì)量把控,一旦成分明確,相信血清將會成為生命科學(xué)研究中的一把利器。

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