趙曦，鄭德洪

（廣西大學(xué)農(nóng)學(xué)院 南寧市 530004）

1 植物病原細(xì)菌的概述及其為害

許多植物病原細(xì)菌引發(fā)的重要病害，給各國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)造成巨大的經(jīng)濟損失，盡管許多研究學(xué)者不斷研究對抗植物病原細(xì)菌的防治辦法，但依然較難防控病原細(xì)菌病害。

1.1 丁香假單胞菌

丁香假單胞菌能夠引起菜豆暈疫病、桃樹潰瘍病、十字花科黑斑病、番茄細(xì)菌性葉斑病等，現(xiàn)已感染300 多種經(jīng)濟作物，包括豆科、十字花科、薔薇科、茄科等，是引發(fā)植物病害十大病害之首[1]。

1.2 青枯雷爾氏菌

青枯雷爾氏菌可能是世界上最具破壞性的植物病原細(xì)菌。它是一種土壤傳播的病原體，通過植物的傷口、根尖或側(cè)根出芽處的裂縫感染植物，造成植物整株萎蔫。由于青枯雷爾氏菌遍布世界許多國家和地區(qū)，它們的地理來源、宿主范圍和致病行為各不相同，在熱帶地區(qū)的許多發(fā)展中國家的農(nóng)業(yè)中發(fā)病率較高[2]。

1.3 農(nóng)桿菌

農(nóng)桿菌是冠癭瘤的病原體，冠癭瘤是世界范圍內(nèi)影響各種作物的最嚴(yán)重的植物病害之一。在自然界中，這種土壤細(xì)菌在寄主植物的傷口部位誘導(dǎo)腫瘤生長，嚴(yán)重限制了作物的生長能力和產(chǎn)量。

1.4 水稻黃單胞菌

水稻黃單胞菌是一種棒狀革蘭氏陰性細(xì)菌。它產(chǎn)生一種黃色的可溶性色素（稱為菌黃素）以及胞外多糖。胞外多糖在保護細(xì)菌免受環(huán)境影響以及幫助細(xì)菌在風(fēng)、雨傳播擴散方面具有重要作用。水稻黃單胞菌的傳播途徑包括灌溉用水系統(tǒng)、水花飛濺或風(fēng)吹雨淋，以及最重要的初級接種源是受侵染的上一季稻茬。水稻黃單胞菌引起的水稻白葉枯病對水稻產(chǎn)量影響非常大，減產(chǎn)達20%～30%嚴(yán)重可達50%～60%甚至顆粒無收[2]。

2 植物細(xì)菌病害防治手段

國內(nèi)外研究學(xué)者對植物病害的防治進行了大量的研究，目前的防治措施有以下幾類：

2.1 化學(xué)藥劑

由于化學(xué)藥劑成本較低，人們對其使用不加以限制，出現(xiàn)濫用、過量使用化學(xué)藥劑的情況。不同種類的化學(xué)藥劑的使用，對環(huán)境和人體都存在負(fù)面影響?？股氐臑E用還會導(dǎo)致一些植物病原菌對抗生素的抗性，植物病原菌對抗生素的耐藥性已成為防治病原細(xì)菌的嚴(yán)重問題[3-5]。常用的抗生素類殺菌劑如農(nóng)用硫酸鏈霉素、中生菌素等使病原細(xì)菌產(chǎn)生較強的抗藥性，防治效果較差且對人體、動物及環(huán)境有較強的毒害作用，國家即將出臺政策將抗生素類化學(xué)藥劑列為“處方藥”，不得濫用[6]。

常用的銅基化合物殺菌劑如無機銅化物、堿式硫酸銅（波爾多液）等。自1885 年波爾多液首次用于植物病害防治以來，大量的銅基抗菌化合物被開發(fā)應(yīng)用于植物保護，銅基化合物對植物病原細(xì)菌有較強的毒性，對動物的毒性較低且制作成本低廉。隨著銅基抗菌化合物大量頻繁的使用，許多病原細(xì)菌對銅基化合物產(chǎn)生了抗性。銅基化合物大多為堿性，無法與其他農(nóng)藥混用，可混性差，且重金屬對環(huán)境的污染，引起人們對生態(tài)系統(tǒng)長期可持續(xù)性的擔(dān)憂[4]。

2.2 土壤處理

土壤處理法處理一些土傳病害，使用土壤添加劑、土壤暴曬和熏蒸等方法。例如利用塑料薄膜覆蓋地面，膜下灌水淹沒土壤，密封30 d左右，如遇連續(xù)高溫，土壤溫度可達60℃，20 d 即可起到殺蟲殺菌的作用[7]。缺點是操作有一定難度，同時會對土壤中的一些有益微生物造成損害。

2.3 輪作

合理的輪作能夠在一定程度上降低少數(shù)植物的病原細(xì)菌的為害。如煙草黑脛病、蠶豆根腐病、甜菜褐斑病、西瓜蔓割病和番茄青枯病等均通過土壤侵染。如將感病的寄主作物與非寄主作物實行輪作或水旱作物輪作，便可較大程度地減少這種病菌在土壤中的數(shù)量，減輕病害；同時也可減少作物根部的線蟲，使其在土壤中的蟲卵數(shù)量減少，達到減輕危害的目的。

2.4 選育抗病品種

抗病品種是利用常規(guī)雜交育種技術(shù)結(jié)合分子標(biāo)記輔助選擇技術(shù)，快速高效地選育優(yōu)良品種的一種技術(shù)手段[8]?？共∑贩N的選育能夠使該品種在一定程度上減少病蟲害的發(fā)生。例如雜交得到感溫型常規(guī)稻品種白絲占，能夠抗白葉枯強病毒菌系Ⅴ型菌兼抗稻瘟病，抗白葉枯病（Ⅳ型菌1 級，Ⅴ型菌3級）[9]。

3 噬菌體

3.1 噬菌體

噬菌體是一種專門殺死細(xì)菌的病毒，但對非靶向的細(xì)菌和人類無毒[10]。早在100 多年前被發(fā)現(xiàn)，但當(dāng)時抗生素的崛起，導(dǎo)致科研人員擱置了對噬菌體的研究。由于時代的發(fā)展，人們越來越重視生態(tài)環(huán)境的保護。細(xì)菌對抗生素產(chǎn)生耐藥性，以及使用化學(xué)品對環(huán)境可能產(chǎn)生的不良影響，使人們重新對開發(fā)替代控制策略來防治植物中的細(xì)菌性病害產(chǎn)生了興趣[11]。噬菌體是通過在細(xì)菌內(nèi)感染、復(fù)制、傳播。噬菌體在生態(tài)系統(tǒng)中廣泛存在且種類豐富，存在于所有可以發(fā)現(xiàn)細(xì)菌的環(huán)境中，在人類和動物身上也有他們的身影，在生態(tài)系統(tǒng)營養(yǎng)循環(huán)、細(xì)菌病原體的進化等方面起著非常重要的作用。噬菌體和細(xì)菌在進化中勢均力敵，不相上下。盡管我們看不到噬菌體，但它對我們的生活依然起到相當(dāng)重要的作用。噬菌體作為生物農(nóng)藥正在被廣泛研究。

3.2 噬菌體的分類

噬菌體根據(jù)核酸類型可分為四大類：單鏈DNA（ssDNA）、雙鏈DNA（dsDNA）、單鏈RNA（ssRNA）、雙鏈RNA（dsRNA）。由于噬菌體專性寄生于易感染病原細(xì)菌，按照噬菌體在宿主細(xì)胞體內(nèi)呈現(xiàn)的生命狀態(tài)可分為4 種：裂解性、溶原性、偽溶原性和慢性感染[12]。根據(jù)形態(tài)大體分為頭尾、瓶狀、絲狀、水滴狀、桿狀、球狀等[13]?，F(xiàn)有關(guān)于噬菌體的報道大多為裂解性噬菌體，近幾年相繼出現(xiàn)了利用絲狀噬菌體治療的報道[14-15]。

頭尾結(jié)構(gòu)的噬菌體是通過中空的尾部將遺傳物質(zhì)注射到宿主菌細(xì)胞內(nèi)，一旦進入細(xì)胞，噬菌體就會利用宿主菌細(xì)胞的代謝機制，在細(xì)胞內(nèi)完成遺傳物質(zhì)的復(fù)制、組裝，最后裂解宿主細(xì)胞。宿主細(xì)胞被裂解后釋放大量子代噬菌體，子代噬菌體再次侵入相鄰細(xì)胞，循環(huán)往復(fù)。絲狀噬菌體，由幾千個不等（例如M13由6 407個核苷酸）的核苷酸構(gòu)成一個環(huán)狀單鏈DNA，呈螺旋陣列排列，再由長絲的管狀衣殼蛋白包裹著[16]。絲狀噬菌體相對溫和，不會溶解宿主細(xì)胞，與宿主細(xì)胞共生共存。絲狀噬菌體進入細(xì)胞后，在細(xì)胞內(nèi)繁殖，再從細(xì)胞內(nèi)源源不斷地分泌出來，噬菌體在細(xì)胞內(nèi)持續(xù)釋放病毒粒子，但噬菌體的合成和釋放都不會破壞細(xì)胞或使細(xì)胞裂解，細(xì)胞處于持續(xù)感染狀態(tài)。例如絲狀噬菌體VGJφ、CTXφ和φRSM1從霍亂弧菌基因組中切除一部分堿基對，但不會殺死宿主細(xì)胞[17]。

4 噬菌體防治細(xì)菌病害的應(yīng)用

在許多年前，研究學(xué)者已經(jīng)認(rèn)識到噬菌體能夠很大程度影響細(xì)菌基因組進化[15]。利用基因工程改造噬菌體，能夠直接或間接賦予噬菌體殺菌能力，例如將rpsL和gyrA基因整合到溫和噬菌體中，受感染的病原細(xì)菌對鏈霉素敏感[18]。隨著人口增長對糧食產(chǎn)量的巨大需求，噬菌體防治病害的應(yīng)用與日俱增，噬菌體既可以作為單獨的防治策略，也可以作為綜合防治的一部分。

Kelvin Kimutai Kering 發(fā)現(xiàn)噬菌體混合物可以與低濃度的CuSO4一起用于殺死更多的植物病原菌[19]。Flaherty 等人利用突變噬菌體對天竺葵白葉枯病進行防治，每日噴灑突變噬菌體混合液于濕潤天竺葵葉片表面，與對照組（未噴灑噬菌體混合液）相比，每天使用噬菌體混合物降低了70%～85%的發(fā)病率[11]。Obradovic 利用噬菌體合成孔徑雷達誘導(dǎo)劑在6周左右的番茄根部施藥，能夠顯著降低番茄細(xì)菌斑病的發(fā)生[20]。Adriaenssens 利用噬菌體?AS1浸泡受感染的馬鈴薯種子塊莖，軟腐病病情明顯減輕，產(chǎn)量增加13%[21]。Das等人利用噬菌體雞尾酒療法提前處理未發(fā)病的葡萄藤，預(yù)防通過昆蟲傳播的葡萄皮爾斯病，能夠明顯降低葡萄皮爾斯病的發(fā)病率[22]。Rombouts 利用從韭菜白葉枯病地區(qū)土壤中分離、篩選到噬菌體，提前用噬菌體浸泡韭菜苗再將其種植在含有紫丁香單胞菌的地區(qū)，韭菜白葉枯病的發(fā)病率明顯降低。或種植韭菜后噴灑噬菌體混合液，噴灑噬菌體混合液的韭菜與未噴灑噬菌體的對照組發(fā)病率分別為38.5%和63%。兩種方法都能能夠明顯抑制韭菜白葉枯病的發(fā)病[23]。Wei利用噬菌體雞尾酒療法防治馬鈴薯青枯病，將6種噬菌體混合液注入植株能使80%的馬鈴薯免受青枯病困擾，噴灑混合液一周后能夠殺滅土壤中98%的青枯菌[24]。Muturi利用噬菌體抑制果膠桿菌引起的肯尼亞馬鈴薯軟腐病，在馬鈴薯切片上接種細(xì)菌前后1 h，涂抹噬菌體，可使軟腐病減輕90%以上[25]。Denyes 等人利用噬菌體具有特異性的特點對大量食源性細(xì)菌進行穩(wěn)健和特異性診斷，不僅可以降低食源性疾病的發(fā)病率，還可以降低傳統(tǒng)病原體檢測的昂貴費用[26]。越來越多的研究學(xué)者利用噬菌體防治病原細(xì)菌，噬菌體作為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)防治有很大的發(fā)展前景。

5 噬菌體的優(yōu)勢

5.1 噬菌體在環(huán)境中的優(yōu)勢

噬菌體是包括根系在內(nèi)的生態(tài)系統(tǒng)中最豐富的生物之一，在細(xì)菌的進化過程中起到了至關(guān)重要的作用。而且噬菌體對環(huán)境沒有毒性，不會造成環(huán)境污染。1921年Bruynoghe等最先使用噬菌體制劑治療皮膚葡萄球菌化膿性感染，病情在2 d內(nèi)有所好轉(zhuǎn)，身體其他部位未受影響[27]。

由于噬菌體有很強的生物特異性，只感染宿主細(xì)菌，對非靶向細(xì)胞沒有識別能力，對環(huán)境中的其他菌群不產(chǎn)生影響，不會破壞土壤微生物的多樣性，可滿足當(dāng)代提倡的綠色無公害農(nóng)業(yè)要求。

5.2 噬菌體在基因組學(xué)方面的優(yōu)勢

盡管噬菌體的基因組相對較小，但是對宿主細(xì)胞的影響卻很大[16]。由于噬菌體基因組堿基或堿基對數(shù)量少，使得噬菌體的基因組測序、分子克隆和基因組學(xué)研究都相對容易[28]。噬菌體基因組較小，但是依舊能夠從已被大家熟知的噬菌體中揭示新的信息，說明與它們的小體積相比，它們對病原菌的行為和進化都有重要影響[16]。噬菌體也會根據(jù)病原菌的突變產(chǎn)生適當(dāng)?shù)淖儺?，傳統(tǒng)細(xì)菌病害防治手段則不具備這種優(yōu)勢。

5.3 噬菌體在實際應(yīng)用中的優(yōu)勢

噬菌體由于基因組序列較小，研制開發(fā)所需的時間短、成本低，僅需將噬菌體與宿主菌細(xì)胞共培養(yǎng)，通過離心就可以去除細(xì)菌碎片獲得噬菌體粗提物。例如Wei從不同地區(qū)含有青枯病的土壤中分離到的噬菌體，通過噬菌體與高濃度的宿主菌細(xì)胞共培養(yǎng)一段時間后離心得到的噬菌體用于實驗[24]。得到的噬菌體易于保存，在4℃條件下可以儲存幾個月沒有明顯的消亡。

6 噬菌體在實際應(yīng)用中面臨的問題

噬菌體無法自我復(fù)制，需要在宿主細(xì)胞內(nèi)復(fù)制繁殖，如果沒有宿主細(xì)胞，噬菌體無法在環(huán)境中長期存活，會在較短時間內(nèi)凋亡。一般噬菌體對植物病原細(xì)菌的防治是將噬菌體施用于植物根際，由于噬菌體的結(jié)構(gòu)不太穩(wěn)定，在環(huán)境中長期儲存有一定困難，會受到土壤中其他微生物、土壤的pH、紫外線等因素影響。

由于細(xì)菌和噬菌體之間無休止的爭奪，細(xì)菌已經(jīng)進化出噬菌體抗性，例如毒素—抗毒素系統(tǒng)、CRISPR CAS免疫系統(tǒng)，會使噬菌體無法進入病原細(xì)菌或一旦進入，病原細(xì)菌啟動自殺系統(tǒng)，防止噬菌體在細(xì)菌內(nèi)復(fù)制合成[29]。宿主細(xì)胞對噬菌體也可以產(chǎn)生抗性突變，宿主菌細(xì)胞的受體對于噬菌體侵染細(xì)菌起著至關(guān)重要的作用。如果宿主菌細(xì)胞突變與噬菌體結(jié)合的受體，使噬菌體受體不可接近宿主細(xì)菌或與宿主細(xì)菌受體結(jié)合蛋白不互補，噬菌體就失去了有效感染宿主的能力。受體結(jié)構(gòu)的改變以及噬菌體受體的喪失也可能導(dǎo)致吸附受阻[30]。

化學(xué)物質(zhì)對噬菌體的影響研究至今還相對較少，但是表面活性劑和天然有機物會影響噬菌體的存活，其中表面活性劑破壞性較強[31]。

施用噬菌體24 h 后，其存活率明顯降低。頻繁施用噬菌體是目前提高防治效果最有效的方法。但在日常應(yīng)用上，經(jīng)濟條件是主要問題，需要評估和尋找延長作物中的噬菌體壽命的化合物平衡環(huán)境與條件。

7 如何提高噬菌體對細(xì)菌病害的防治效果

由于噬菌體結(jié)構(gòu)的特點，不易在環(huán)境中長期存活，但在溶液中具有一定的穩(wěn)定性[32]，考慮到噬菌體的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)，可以添加賦形劑或者將噬菌體溶液轉(zhuǎn)化成粉末制劑作為提高噬菌體穩(wěn)定的手段[19]。針對噬菌體對溫度、pH、紫外線等環(huán)境因素的敏感性，可調(diào)整施用時間，如夜間或清晨使用噬菌體制劑，延長噬菌體存活時間，以盡可能多的感染病原細(xì)菌。此外，噬菌體可以通過基因改造，降低病原細(xì)菌對噬菌體產(chǎn)生抗性的可能[33]?？梢岳檬删w依附在無毒性的病原細(xì)菌內(nèi)投入環(huán)境中進行生物防治。

8 展望

隨著社會的發(fā)展，人們越來越重視抗生素等傳統(tǒng)防治手段對環(huán)境的破壞，為實現(xiàn)自然生態(tài)協(xié)調(diào)可持續(xù)發(fā)展的環(huán)境友好型社會，各界研究學(xué)者努力尋找新型生物防治辦法抵御病原細(xì)菌。噬菌體有價格低廉、數(shù)量龐大、易于生產(chǎn)、保存便利等特點，已然成為極其重要的生物防治手段之一。噬菌體作為生態(tài)系統(tǒng)中存在范圍最廣，數(shù)量、種類都非常繁多的生物，對特定病原細(xì)菌的特異性極強，且對環(huán)境、人體及其他細(xì)菌沒有毒害作用，有利于環(huán)境保護。在噬菌體與細(xì)菌爭奪戰(zhàn)中，噬菌體一直占據(jù)著有利條件。相比化學(xué)藥劑在很大程度上降低了病原細(xì)菌抗性的產(chǎn)生。噬菌體作為植物病害生物防治還處于研究階段，研究學(xué)者可以通過各種途徑對噬菌體進行探索和研究，未來利用噬菌體作為植物病害的生物防治手段有良好的發(fā)展前景。