張?zhí)焓?呂 靜 丁曉歡 欒 佳

(遼寧中醫(yī)藥大學(xué)2018級(jí)碩士研究生，遼寧 沈陽(yáng) 110847)

免疫球蛋白A(IgA)腎病是以腎小球系膜區(qū)IgA沉積為特征的免疫復(fù)合物腎小球腎炎，臨床可見(jiàn)肉眼血尿或鏡下血尿，可伴有不同程度蛋白尿，隨著病情的進(jìn)展可出現(xiàn)腎小球硬化[1]。因此，對(duì)于IgA腎病盡早發(fā)現(xiàn)并積極治療具有重要意義。芪薊腎康湯是我們臨床治療IgA腎病的經(jīng)驗(yàn)方，先前研究已經(jīng)表明芪薊腎康湯對(duì)IgA腎病模型大鼠具有確切的治療作用，并可通過(guò)抑制白細(xì)胞介素6(IL-6)及腫瘤壞死因子α(TNF-α)的表達(dá)抑制炎性反應(yīng),最終起到防治腎小球硬化的目的[2-3]。為進(jìn)一步探討芪薊腎康湯治療IgA腎病的作用機(jī)制，我們擬通過(guò)觀察其對(duì)轉(zhuǎn)基因IgA腎病小鼠轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β1(TGF-β1)/Smads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響進(jìn)行探討，結(jié)果如下。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 無(wú)特定病原體(SPF)級(jí)IgHA1-mut轉(zhuǎn)基因F1代小鼠120只，雌雄各半，12周齡，體質(zhì)量22 g，由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所制作IgHA1-mut轉(zhuǎn)基因F0親代小鼠[SCXK(京)2011-0022]，并于遼寧中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心保種、繁育并鑒定為IgHA1-mut基因型陽(yáng)性的F1代小鼠[4]。C57BL/6J小鼠24只，雌雄各半，12周齡，體質(zhì)量22 g，北京市維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，動(dòng)物生產(chǎn)許可證SCXK(京)2013-0002。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥品 芪薊腎康湯(藥物組成：黃芪25 g，丹參20 g，牡丹皮15 g，仙鶴草15 g，重樓15 g，白花蛇舌草20 g，老頭草20g，小薊25 g。由遼寧中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院藥劑科負(fù)責(zé)加工并制成湯劑。)；替米沙坦片(上海勃林格殷格翰藥業(yè)有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字J20150084)。

1.3 實(shí)驗(yàn)試劑及儀器

1.3.1 主要試劑 DRR047A含gDNA的定量反轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量試劑盒(日本Takara公司)；一抗：兔抗小鼠Smad2與兔抗小鼠TGF-β1(美國(guó)Cell Signaling Technology公司)、兔抗小鼠甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)(英國(guó)Abcam公司)；二抗:辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG(美國(guó)Cell Signaling Technology公司)。

1.3.2 主要儀器 Stratagene Mx3000P型實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Real-time PCR)檢測(cè)儀 (德國(guó)Agilent公司)；DU640型蛋白核酸分析儀(美國(guó)Backman公司)；MR1822型低溫高速離心機(jī)(法國(guó)Jouan公司)；DYY-12型多功能電泳儀、DYCP-40C型半干式碳板轉(zhuǎn)印電泳儀(北京六一生物科技有限公司)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 分組及給藥 全部小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)3 d。然后隨機(jī)取8只C57BL/6J小鼠作為空白組，再取IgHA1-mut轉(zhuǎn)基因F1代小鼠40只，分為模型組、西藥組、芪薊腎康湯低劑量組、芪薊腎康湯中劑量組及芪薊腎康湯高劑量組，每組8只。空白組及模型組按2 mL/100 g予0.9%氯化鈉注射液灌胃，西藥組按2 mg/100 g予替米沙坦藥液灌胃，芪薊腎康湯低、中、高劑量組分別按0.6、1.2、2.4 g生藥/100 g灌胃，每日1次，連續(xù)灌胃28 d。

1.4.2 標(biāo)本采集 各組小鼠均在灌胃14、21、28 d后隨機(jī)取2只小鼠，腹腔麻醉，迅速打開(kāi)腹腔，摘取腎組織，0.9%氯化鈉注射液沖洗后，部分以4%多聚甲醛固定之后保存?zhèn)溆?，剩余部分液氮冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

1.5 觀察指標(biāo)及方法

1.5.1 腎組織Smad3 mRNA及Smad7 mRNA表達(dá) 采用Real-time PCR法檢測(cè)。在液氮中取50～100 mg腎組織，放入研缽反復(fù)研磨3次，加入Trizol裂解細(xì)胞，抽取腎組織細(xì)胞的總RNA。將得到的總RNA樣本根據(jù)37 ℃，15 min，85 ℃，5 s條件，使用DRR047A含gDNA的定量反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)以得到對(duì)應(yīng)的cDNA。逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA 4 ℃保存?zhèn)溆?。后在Real-time PCR儀上按照如下反應(yīng)條件進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)：95 ℃預(yù)變性3 min，95 ℃變性 5 s，60 ℃退火1 min后采集熒光信號(hào)，重復(fù)40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)體系：2×SYBR Green qPCR預(yù)混液(10 μL)，無(wú)酶無(wú)菌水(7 μL)，對(duì)照熒光染料(0.3 μL)，上游引物(2 μL)，下游引物(2 μL)，cDNA(2 μL)，Total(23.3 μL)。使用Primer-BLAST[5]設(shè)計(jì)引物，以GAPDH作內(nèi)參照。采用2-△△CT法分析樣品mRNA的相對(duì)表達(dá)量。Smad3:上游引物序列5'-AGAAGCTCAAGAAGACGGGG-3'，下游引物序列5'-CAGTGACCTGGGGATGGTAA-3'。Smad7：上游引物序列5'-CAAACCAACTGCAGGCTGTC-3'，下游引物序列5'-CCCCAGGGGCCAGATAATTC-3'。GAPDH：上游引物序列5'-CCCTTAAGAGGGATGCTGCC-3'，下游引物序列5'-TACGGCCAAATCCGTTCACA-3'。

1.5.2 腎組織TGF-β1及Smad 2蛋白表達(dá) 采用蛋白質(zhì)免疫印跡法檢測(cè)。將剩余腎組織采用剪碎法制作腎組織勻漿[6]，先測(cè)各個(gè)細(xì)胞樣本蛋白含量(用考馬斯亮藍(lán)法[7])，再進(jìn)行分離、凝固、加樣、蛋白電泳轉(zhuǎn)移、一抗及二抗反應(yīng)、透膜、曝光、洗片，最后采用Scion Image軟件分析相對(duì)灰度值。

2 結(jié) 果

2.1 各組小鼠灌胃14、21、28 d后腎組織Smad3 mRNA及Smad7 mRNA表達(dá)水平比較 見(jiàn)表1。

由表1可見(jiàn)，與空白組灌胃后同期比較，模型組灌胃14、21、28 d后Smad3 mRNA表達(dá)水平均明顯升高(P<0.05)，Smad7 mRNA表達(dá)水平均明顯降低(P<0.05)。與模型組灌胃后同期比較，西藥組及芪薊腎康湯中、高劑量組灌胃14、21、28 d后Smad3 mRNA表達(dá)水平均明顯降低(P<0.05)，Smad7 mRNA表達(dá)水平均明顯升高(P<0.05)，芪薊腎康湯低劑量組僅灌胃28 d后Smad3 mRNA及Smad7 mRNA表達(dá)水平與模型組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。芪薊腎康湯各劑量組組間比較，芪薊腎康湯中、高劑量組灌胃14、21、28 d后Smad3 mRNA表達(dá)水平均明顯低于芪薊腎康湯低劑量組(P<0.05)，Smad7 mRNA表達(dá)水平均高于芪薊腎康湯低劑量組(P<0.05)，且芪薊腎康湯高劑量組灌胃14、21、28 d后Smad3 mRNA及Smad7 mRNA表達(dá)水平改善優(yōu)于芪薊腎康湯中劑量組同期(P<0.05)。

表1 各組小鼠灌胃14、21、28 d后腎組織Smad3 mRNA及Smad7 mRNA表達(dá)水平比較

2.2 各組小鼠灌胃14、21、28 d后腎組織TGF-β1及Smad2蛋白表達(dá)比較 見(jiàn)表2、圖1。

表2 各組小鼠灌胃14、21、28 d后腎組織TGF-β1及Smad2蛋白表達(dá)比較

由表2可見(jiàn)，與空白組灌胃后同期比較，模型組灌胃14、21、28 d后TGF-β1及Smad2蛋白表達(dá)水平均明顯升高(P<0.05)。與模型組灌胃后同期比較，西藥組及芪薊腎康湯中、高劑量組灌胃14、21、28 d后TGF-β1及Smad2蛋白表達(dá)水平均明顯降低(P<0.05)，芪薊腎康湯低劑量組僅灌胃21、28 d后TGF-β1及Smad2蛋白表達(dá)水平明顯低于模型組(P<0.05)。芪薊腎康湯各劑量組組間灌胃后同期比較，芪薊腎康湯中、高劑量組灌胃14、21、28 d后TGF-β1蛋白表達(dá)水平均明顯低于芪薊腎康湯低劑量組(P<0.05)，且芪薊腎康湯高劑量組灌胃28 d后TGF-β1蛋白表達(dá)水平均明顯低于芪薊腎康湯中劑量組(P<0.05)。

3 討 論

IgA腎病是臨床上一種常見(jiàn)的原發(fā)性腎小球疾病，可發(fā)生于任何年齡段人群，但以青壯年患者為主，有30%～40%的患者病情可進(jìn)行性惡化，導(dǎo)致終末期腎衰竭的發(fā)生，給患者的生命健康造成嚴(yán)重威脅，生活質(zhì)量造成嚴(yán)重影響[8-9]。TGF-β1主要來(lái)源于上皮細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞及內(nèi)皮細(xì)胞，是一種多功能的細(xì)胞因子，對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化及免疫功能都有重要的調(diào)節(jié)作用，IgA腎病患者中TGF-β1的高表達(dá)可以促進(jìn)腎小球系膜細(xì)胞大量增殖，促進(jìn)成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)，加速細(xì)胞的纖維化與硬化，對(duì)患者腎功能造成嚴(yán)重?fù)p傷[10]。Smads家族是將TGF-β1信號(hào)從細(xì)胞表面受體傳導(dǎo)至細(xì)胞核的一組關(guān)鍵性蛋白，根據(jù)其在傳導(dǎo)通路中作用的不同可分為受體激活型Smad1、Smad2、Smad3、Smad5、Smad8,共同介導(dǎo)型Smad4,抑制型Smad6、Smad7[11]?；罨腡GF-β1可激活Smad2、Smad3，使其與Smad4結(jié)合，進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)激活相應(yīng)啟動(dòng)子的活性，激活細(xì)胞因子受體轉(zhuǎn)導(dǎo)信號(hào)，促進(jìn)細(xì)胞因子表達(dá)，介導(dǎo)腎纖維化的過(guò)程[12-14]。有研究也證實(shí)，TGF-β1/Smads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路過(guò)度興奮被認(rèn)為是導(dǎo)致細(xì)胞外基質(zhì)沉積的主要原因之一，其高表達(dá)還能夠上調(diào)纖維連接及層粘連蛋白合成量[15-16]。Smad7則是TGF-β1/Smads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的負(fù)調(diào)節(jié)蛋白，可阻止Smad2、Smad3的磷酸化，阻止TGF-β1信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，抑制TGF-β1介導(dǎo)的腎小球硬化，減輕腎臟功能損害，研究表明Smad7水平升高可以明顯延緩腎小球硬化的進(jìn)展[17]。本研究結(jié)果也顯示，模型組小鼠與空白組灌胃后同期比較，腎組織中Smad3 mRNA及TGF-β1、Smad2蛋白表達(dá)水平均明顯升高(P<0.05)，Smad7 mRNA表達(dá)明顯降低(P<0.05)，表明模型組小鼠出現(xiàn)了腎纖維化的變化。

1 空白組；2 模型組；3 西藥組；4 芪薊腎康湯低劑量組；5 芪薊腎康湯中劑量組；6 芪薊腎康湯高劑量組

IgA腎病屬中醫(yī)學(xué)水腫、尿血、腎風(fēng)、虛勞等范疇，病位在腎絡(luò)，屬本虛標(biāo)實(shí)之證，以腎絡(luò)虧虛為本，以邪壅腎絡(luò)為標(biāo)，其發(fā)病與腎絡(luò)虛滯、腎絡(luò)瘀阻有關(guān)。絡(luò)脈是氣血會(huì)聚之處，其生理功能不外聚、流、通、化，即可以貫通營(yíng)衛(wèi)，滲透氣血，互化津血，是內(nèi)外溝通的橋梁，故絡(luò)脈氣血暢通，則周身四肢、五臟六腑得以滋潤(rùn)而健康如常；絡(luò)脈不通，氣血不充，則五臟失和，七竅不通，留而為瘀毒導(dǎo)致絡(luò)病[18]。腎作為絡(luò)脈聚集之所，腎絡(luò)既是聯(lián)系腎臟內(nèi)外之間的橋梁，同時(shí)也是留邪的場(chǎng)所，腎絡(luò)氣血暢達(dá)，則腎臟氣化有序，能升能降，能開(kāi)能闔，能出能入，能收能放，使氣血津液得以施布于五臟六腑、四肢百骸，以保證機(jī)體的各種生理活動(dòng)[19]。腎虛絡(luò)損，瘀毒互結(jié)，氣化失職，封藏失司，導(dǎo)致腎主藏精、主水、主氣化等一系列功能失調(diào)，而引發(fā)腎臟諸病[20]。芪薊腎康湯是我們臨床常用的經(jīng)驗(yàn)方，方中黃芪補(bǔ)氣榮絡(luò)，既能大補(bǔ)元?dú)?，健脾補(bǔ)腎，又能利水消腫；小薊涼血止血，散瘀解毒消癰；重樓、白花蛇舌草清熱解毒，消腫止痛，利濕通淋；牡丹皮、丹參活血化瘀，舒筋通絡(luò)；老頭草清熱涼血，收斂止血止痢。諸藥合用，共奏補(bǔ)氣榮絡(luò)、清熱解毒、消瘀通絡(luò)的功效。

本實(shí)驗(yàn)所用替米沙坦除有降低血壓的作用外，還有減少蛋白尿和延緩腎功能惡化的腎臟保護(hù)作用，其通過(guò)對(duì)腎小球血流動(dòng)力學(xué)的特殊調(diào)節(jié)作用，降低腎小球內(nèi)高血壓、高灌注及高濾過(guò)，起到緩解腎小球硬化進(jìn)展的作用[21]。本研究結(jié)果顯示，西藥組及芪薊腎康湯低、中、高劑量組灌胃28 d后與模型組同期比較對(duì)小鼠腎組織Smad3 mRNA、Smad7 mRNA及TGF-β1、Smad2蛋白表達(dá)均有明顯改善(P<0.05)，且芪薊腎康湯中、高劑量組灌胃14、21、28 d后Smad3 mRNA、Smad7 mRNA及TGF-β1蛋白表達(dá)改善均優(yōu)于芪薊腎康湯低劑量組同期(P<0.05)，芪薊腎康湯高劑量組灌胃14、21、28 d后對(duì)Smad3 mRNA及Smad7 mRNA表達(dá)水平改善優(yōu)于芪薊腎康湯中劑量組同期(P<0.05)，灌胃28 d后TGF-β1蛋白表達(dá)水平低于芪薊腎康湯中劑量組同期(P<0.05)。提示芪薊腎康湯對(duì)轉(zhuǎn)基因IgA腎病小鼠治療作用確切，其可能是通過(guò)多個(gè)靶點(diǎn)調(diào)節(jié)TGF-β1/Smads信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路完成，預(yù)防腎纖維化，延緩腎小球硬化進(jìn)展，增加劑量或延長(zhǎng)療程均可明顯提高療效。