王貴芳，岳占龍，崔元璐

（天津中醫(yī)藥大學中醫(yī)藥研究院，天津 301617）

骨關(guān)節(jié)炎是一種以關(guān)節(jié)軟骨退行性病變和繼發(fā)性骨質(zhì)增生為特征的慢性關(guān)節(jié)疾病。其病理特點為關(guān)節(jié)軟骨退行性改變，組織結(jié)構(gòu)破壞，軟骨下骨硬化，關(guān)節(jié)邊緣和軟骨下反應(yīng)性增生，骨贅形成。西醫(yī)學對骨關(guān)節(jié)炎的研究已經(jīng)非常深入，但其發(fā)病機制仍未完全明確。目前學術(shù)界普遍認為骨關(guān)節(jié)炎與多個病理機制相關(guān)，包括軟骨細胞外基質(zhì)的酶降解，缺乏新細胞外基質(zhì)合成，軟骨細胞的異常分化等[1]。骨關(guān)節(jié)炎患者的軟骨自我修復能力差，傳統(tǒng)治療僅能夠在一定程度上緩解癥狀、延緩病情發(fā)展，缺少有效的治療措施。近年來興起的間充質(zhì)干細胞（MSCs）移植療法，為骨關(guān)節(jié)炎的治療帶來新的希望[2]。細胞3D培養(yǎng)技術(shù)相比傳統(tǒng)2D培養(yǎng)，更貼近人體生理條件，使細胞更好地表達出生理功能[3]，除了為細胞提供充足的生長空間，也能夠滿足細胞進行各種營養(yǎng)物質(zhì)和氧的交換。

研究發(fā)現(xiàn)，正常人體關(guān)節(jié)腔內(nèi)關(guān)節(jié)液的鈣離子濃度為4 mmol/L左右，骨關(guān)節(jié)炎患者關(guān)節(jié)液中鈣離子濃度明顯升高[4-5]，基于此課題組前期設(shè)計制備了一種葛根素參與的鈣離子響應(yīng)的海藻酸水凝膠，可用于骨關(guān)節(jié)炎的治療[6]。本研究在前期工作基礎(chǔ)上，針對葛根素-海藻酸鈣水凝膠的生物相容性進行了體內(nèi)生物相容性評價，為其臨床應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。

1 試劑與儀器

海藻酸鈉[生工生物工程（上海）股份有限公司，中國]；葛根素（＞99%）（上海永恒生物科技有限公司，中國）；葡萄糖酸鈣[生工生物工程（上海）股份有限公司，中國]；粉防己堿（＞98%）（江蘇永健醫(yī)藥科技有限公司，中國）；白細胞介素-6（IL-6）酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒（PeproTech公司，美國）；白細胞介素-1β（IL-1β）ELISA 試劑盒（PeproTech公司，美國）；腫瘤壞死因子-α（TNF-α）ELISA 試劑盒（PeproTech公司，美國）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白測定試劑盒（Pierce公司，美國）；UNIQ-10柱式Trizol總RNA提取試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司，中國]；PrimeScript Reverse Transcription試劑盒和逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）reaction試劑盒（TAKARA公司，日本）。

7500型實時熒光定量 PCR儀（Applied Biosystems公司，美國）；PCR-C1000PCR儀（Bio-Rad公司，美國）；Infinite M200型多功能讀板機（TECAN公司，瑞士）；VCX 130型超聲波破碎儀（Sonics&Materials公司，美國）；Avanti J-25型高速離心機（Beckman Coulter公司，美國）；ASP300S全自動封閉脫水機（Leica儀器公司，德國）；BMJ-1生物組織包埋機（天津航空機電公司，中國）；RM2135型石蠟切片機（Leica儀器公司，德國）。

2 實驗方法

2.1 葛根素-海藻酸鈣凝膠的制備、體內(nèi)埋植和取材 葛根素-海藻酸鈣可注射凝膠的制備參照課題組以往研究方案[6]。將制備的載粉防己堿葛根素-海藻酸鈣注射水凝膠轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)基瓶中進行121℃高壓滅菌，備用。

4～5周齡SD雄性大鼠36只，購買于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司[許可證號：SCXK（京）2012-0001]。對大鼠進行適應(yīng)性喂養(yǎng)，實驗前對大鼠稱質(zhì)量，植入手術(shù)前按照0．35 mL/100 g劑量腹腔注射10%水合氯醛麻醉，在大鼠前后肢肌肉處進行局部褪毛處理。大鼠分組包括假手術(shù)組、海藻酸鈣凝膠組、低濃度葛根素-海藻酸鈣組（濃度為0．01%）、中濃度葛根素-海藻酸鈣組（濃度為0．04%）、高濃度葛根素-海藻酸鈣組（濃度為0．2%）、葛根素（濃度為0．2%）/粉防己堿（濃度為 0．05%）-海藻酸鈣組，每組6只大鼠。用1 mL注射器注射高壓滅菌后的凝膠按照每個點注射0．5 mL[7-8]，每只注射4點進行皮下埋植凝膠，埋植完成后觀察大鼠活動狀態(tài)以及進食飲水情況。

取材按照預(yù)先設(shè)計時間點，在埋植凝膠后的3d、1周、2周、8周對大鼠進行稱質(zhì)量、腹腔注射麻醉、除去埋植點的鼠毛、頸椎脫臼處死，立即打開大鼠背部皮膚，取埋植凝膠附近的淺筋膜層組織，轉(zhuǎn)移至凍存管中精確稱質(zhì)量并進行液氮速凍，每個組織樣本質(zhì)量為50 mg左右，然后轉(zhuǎn)移至-80°C冰箱儲存?zhèn)溆谩Ｑ啬z塊取下皮膚，去除鼠毛，于中性福爾馬林溶液中固定。每組取材時對皮下埋植部位及凝膠樣本拍照，測量凝膠直徑大小，初步判斷凝膠在埋植期間的降解速率。

2.2 ELISA法測定注射凝膠附近組織炎性因子分泌的變化 取埋植凝膠手術(shù)后3 d的組織樣本，轉(zhuǎn)移至1．5 mL離心管，加預(yù)冷的含有蛋白酶抑制劑蛋白裂解液，于冰上進行超聲組織破碎，每個樣品裂解 5～6 min，將裂解后的樣品 14 000 r/min、4℃離心15 min，離心后得到的上清液轉(zhuǎn)移至新的1．5 mL離心管中，每個樣品分裝3份，所有樣品保存于-80℃冰箱備用。取1份組織裂解上清液樣品，按照BCA試劑盒說明書檢測樣品中總蛋白的濃度，按照ELISA試劑盒說明書檢測組織裂解液中炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α的含量，根據(jù)標準曲線求出濃度，以組織裂解液總蛋白的濃度作為比較，計算炎癥因子的相對濃度。

2.3 實時定量（Real time）RT-PCR分析注射凝膠附近組織炎性因子mRNA表達的變化 首先采用UNIQ-10柱式Trizol總RNA提取試劑盒提取各組織樣本的總RNA，以PrimeScriptReverseTranscription試劑盒將提取的總RNA逆轉(zhuǎn)成cDNA，然后進行Real time PCR擴增，引物序列如表1，RT-PCR reaction試劑盒分析炎性相關(guān)因子IL-1β、IL-6和TNF-α的mRNA表達變化，實驗操作按照說明書進行。引物序列見表1。

表1 Real time RT-PCR引物序列Tab.1 Oligonucleotide primers of the real-time RT-PCR

2.4 組織切片 蘇木精-伊紅（HE）染色分析不同時間點注射凝膠附近組織病理變化 將埋植實驗后不同時間（3 d、1周、2周、8周）取材的大鼠背部組織，在中性福爾馬林中固定，取出組織后按照改刀、脫水、透明化、包埋、切片、展片、烤片、脫蠟、染色、脫水、封片一系列步驟對組織進行切片及HE染色，將切片標本在顯微鏡下觀察、拍照。

2.5 統(tǒng)計學分析 采用Origin Pro 8．0軟件進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析并繪圖。實驗數(shù)據(jù)以均值±標準誤（x±SE）表示，多組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA），組間兩兩比較采用 LSD 法，P＜0．05 為差異具有統(tǒng)計學意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 凝膠的體內(nèi)埋植降解分析 實驗所制備的凝膠可以通過1 mL注射器進行皮下注射，注射后無感染現(xiàn)象，大鼠飲食和活動狀態(tài)良好。不同取材時間點隨機選取的埋植材料直徑均在1～1．5 cm，從埋植后3 d到8周時間，凝膠直徑無下降趨勢，凝膠體內(nèi)降解速率緩慢，觀察凝膠附近的皮下組織，未出現(xiàn)充血、紅腫的現(xiàn)象，說明未出現(xiàn)明顯的炎癥反應(yīng)。見圖1。

圖1 凝膠皮下注射埋植與不同時間點降解情況Fig.1 Degradation of subcutaneous injection gels in different time points

3.2 凝膠體內(nèi)埋植后周圍組織炎性因子分泌量 皮下埋植凝膠3 d后，各實驗組埋植物周圍組織中IL-1β濃度與假手術(shù)組相比明顯降低。隨著凝膠中葛根素含量的增加，IL-1β濃度依次遞減，表現(xiàn)出明顯的劑量依賴性（P＜0．05 或 P＜0．01），含有粉防己堿的實驗組也明顯低于假手術(shù)組（P＜0．05）。見圖2A。

IL-6濃度測試結(jié)果與IL-1β相似，通過統(tǒng)計分析可知，皮下埋植凝膠3 d后，各實驗組埋植物周圍組織中IL-6濃度均低于假手術(shù)組的濃度。隨著凝膠中葛根素含量的增加，IL-6濃度依次遞減，表現(xiàn)出明顯的劑量依賴性，除高濃度組（0．2%）具有統(tǒng)計學差異（P＜0．05），其他組均無統(tǒng)計學差異。與假手術(shù)組比較，載粉防己堿組也能夠顯著降低 IL-6（P＜0．05）。見圖2B。

埋植3 d后，空白凝膠組埋植物周圍組織中的TNF-α濃度略高于假手術(shù)組，但不具有統(tǒng)計學差異。隨著凝膠中葛根素含量的增加，TNF-α濃度依次遞減，高濃度葛根素凝膠和含有粉防己堿的凝膠組能夠顯著降低 TNF-α 的濃度（P＜0．05）。見圖 2C。

3.3 凝膠體內(nèi)埋植后周圍組織炎性相關(guān)因子mRNA表達的變化 凝膠埋植3 d后埋植物周圍組織中3種炎癥因子mRNA表達水平相對空白組沒有明顯上調(diào)，除低濃度葛根素-海藻酸鈣凝膠組的IL-1β mRNA表達有明顯下調(diào)外，其余各組3種炎癥因子mRNA表達與假手術(shù)組相比均沒有統(tǒng)計學差異，3種炎癥因子mRNA表達水平在各實驗組之間無明顯規(guī)律，見圖3。結(jié)果說明海藻酸鈣凝膠、葛根素-海藻酸鈣凝膠以及葛根素/粉防己堿-海藻酸鈣凝膠皮下埋植后，在埋植組織周圍未產(chǎn)生炎癥反應(yīng)，該注射型凝膠具有良好的體內(nèi)生物相容性，可用于關(guān)節(jié)原位注射給藥。

3.4 凝膠體內(nèi)埋植后周圍組織病理變化 見圖4-7。由HE染色組織切片分析，經(jīng)皮下注射埋植的凝膠分布于結(jié)締組織層，被凝膠占據(jù)的位置產(chǎn)生大量空腔。正常大鼠皮膚的結(jié)締組織層纖維細胞分布均勻，細胞核主要呈長扁狀，靠近肌肉的有少量毛細血管分布。凝膠皮下埋植3 d后觀察到結(jié)締組織層有被凝膠占據(jù)的空腔，沿凝膠注射位置產(chǎn)生明顯的炎癥反應(yīng)，淋巴細胞和巨噬細胞大量聚集，伴隨有明顯的毛細血管形成，對凝膠組織進行包裹，其中炎癥反應(yīng)并未蔓延至肌肉組織層。1周后炎癥反應(yīng)持續(xù)發(fā)生，相對于3 d淋巴細胞和巨噬細胞數(shù)量減少，炎癥反應(yīng)有所緩解，結(jié)締組織增生，毛細血管周圍肉芽組織已經(jīng)形成，這個階段仍能觀察到大量藍色細胞核，其中有大量的增生纖維細胞，形成結(jié)締組織，還有增生毛細血管內(nèi)皮細胞。埋植2周后，結(jié)締組織層中存在增生纖維細胞和毛細血管，炎癥反應(yīng)基本消失。皮下埋植8周后，隨著時間延長炎癥反應(yīng)完全消失，沿凝膠位置保留比較致密的增生結(jié)締組織，仍保留增生的毛細血管。

圖 2 凝膠皮下埋植 3 d 后組織中 IL-1β（A）、IL-6（B）和 TNF-α（C）濃度的變化（x±SE）Fig.2 Change of IL-1β（A）、IL-6（B）and TNF-α（C）concentration after 3 days subcutaneous injection gels（x±SE）

圖3 凝膠皮下埋植 3 d后組織中IL-1β mRNA（A）、IL-6 mRNA（B）和 TNF-α mRNA（C）表達變化（x±SE）Fig.3 mRNA expression of IL-1β（A）、IL-6（B）and TNF-α（C）after 3 days subcutaneous injection gels（x±SE）

圖4 凝膠埋植3 d后埋植物附近組織HE染色結(jié)果（×200）Fig.4 HE straining of the host tissues surrounding the different gels after 3 days subcutaneous injection（×200）

圖5 凝膠埋植1周后埋植物附近組織HE染色結(jié)果（×200）Fig.5 HE straining of the host tissues surrounding the different gels after 1 week subcutaneous injection（×200）

圖6 凝膠埋植2周后埋植物附近組織HE染色結(jié)果（×200）Fig.6 HE straining of the host tissues surrounding the different gels after 2 weeks subcutaneous injection（×200）

圖7 凝膠埋植8周后注射凝膠附近組織HE染色結(jié)果（×200）Fig.7 HE straining of the host tissues surrounding the different gels after 8 weeks subcutaneous injection（×200）

皮下埋植早期僅在埋植的結(jié)締組織中產(chǎn)生炎癥，緊密連接的肌肉組織并受到到影響。隨著埋植時間的延長，從3 d到8周皮下埋植凝膠的直徑并未減小，在未被降解條件下炎癥反應(yīng)快速消失。所以推測皮下埋植所產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)是由于注射凝膠在結(jié)締組織中產(chǎn)生的物理機械力損傷造成的，結(jié)締組織受到物理牽引，將結(jié)締組織物理分開，同時凝膠的植入產(chǎn)生一定的壓力，組織在修復過程中而產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)，而葛根素-海藻酸鈣凝膠未引起明顯的炎癥反應(yīng)，生物相容性良好。

4 討論

本研究前期采用海藻酸與氯化鈣（CaCl2）直接快速混合構(gòu)建海藻酸鈣凝膠，有別于傳統(tǒng)使用的不溶性鈣鹽由凝膠內(nèi)部緩慢釋放鈣離子膠凝化的方法，其中海藻酸對CaCl2濃度十分敏感，探索出海藻酸、CaCl2、葛根素比較窄的處方濃度范圍，制備得到可用于關(guān)節(jié)注射的鈣離子敏感葛根素海藻酸凝膠[6]。可植入生物材料的生物相容性對其長期功能具有至關(guān)重要的作用[9]。制備的不同處方凝膠均能達到無菌、均一、透明、等滲的要求，大鼠皮下注射埋植，埋植后大鼠生理狀態(tài)良好，取材時未發(fā)現(xiàn)皮下埋植凝膠引起充血、紅腫等炎癥反應(yīng)現(xiàn)象，通過對比不同時間點皮下凝膠的直徑，埋植8周凝膠無明顯降解。異體植入的生物材料能夠引發(fā)急性和慢性炎癥反應(yīng)[10-11]，巨噬細胞在炎癥的發(fā)生和發(fā)展過程中起關(guān)鍵作用，被激活的巨噬細胞能夠分泌大量炎性因子，如 IL-1β、IL-6、TNF-α 等[12-13]。埋植凝膠附近組織中的炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α濃度未發(fā)生明顯變化，說明埋植凝膠未對周圍組織產(chǎn)生刺激，炎癥因子濃度與假手術(shù)組相比無統(tǒng)計學差異，隨著葛根素濃度的升高，炎癥因子反而受到劑量依賴的抑制作用。組織中3種炎癥因子的mRNA表達量與假手術(shù)組比較也無統(tǒng)計學差異。對各個時間點取材的組織進行切片HE分析，結(jié)果顯示3 d和1周時的皮下結(jié)締組織產(chǎn)生單核細胞聚集和血管增生，并形成凝膠占據(jù)的空腔，從2周開始炎癥反應(yīng)明顯減輕，基本恢復正常，原因推測是埋植短期內(nèi)產(chǎn)生的炎癥反應(yīng)為凝膠埋植物理損傷造成的，而埋植材料生物相容性良好。通過以上一系列實驗證明，葛根素-海藻酸鈣凝膠具有良好的生物相容性，皮下組織未產(chǎn)生明顯的刺激和炎癥反應(yīng)，可作為骨關(guān)節(jié)炎的可注射載體材料用于該疾病的治療。