高 杉，王鵬偉，馮 曼，王 朔，李 琳，潘 曄，劉昳佳，于春泉

（天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 301617）

冠心?。–HD）是由于冠狀動(dòng)脈粥樣硬化引起的心血管疾病，嚴(yán)重危害人類健康，是世界衛(wèi)生組織（WHO）公認(rèn)的全球死亡的主要原因[1]。中醫(yī)將其歸為“胸痹”“真心痛”等范疇，其病機(jī)“痰”“瘀”“虛”貫穿疾病發(fā)展始末，早期“熱”“毒”相對(duì)較重，后期則由實(shí)轉(zhuǎn)虛，末期多發(fā)展為血瘀、水飲和氣陰兩虛虛實(shí)夾雜之證[2-3]。近10年，中國(guó)將冠心病按中醫(yī)證型分類，其中虛證以氣虛證、陰虛證多見(jiàn)，實(shí)證以血瘀證、痰濁證居多。血瘀和痰濁是致病因素，同時(shí)又是CHD重要的病理產(chǎn)物，兩者多相兼為病，而導(dǎo)致痰瘀互結(jié)之證[4]。有文獻(xiàn)調(diào)研顯示，近年痰瘀互結(jié)證患者人數(shù)逐年增加[5]，開(kāi)展CHD痰瘀互結(jié)證的發(fā)病機(jī)制研究對(duì)防治CHD具有重大意義。課題組前期通過(guò)在高脂飼料喂養(yǎng)的基礎(chǔ)上聯(lián)合冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎的方法成功建立CHD痰瘀互結(jié)證大鼠模型[6]，本實(shí)驗(yàn)以前期實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蜑榛A(chǔ)，通過(guò)檢測(cè)絲氨酸/蘇氨酸激酶（Akt）、磷酸化Akt（p-Akt）、B淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2 相關(guān)的促凋亡蛋白（Bax）、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）蛋白表達(dá)情況，進(jìn)一步探討CHD痰瘀互結(jié)證的發(fā)病機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 健康雄性Wistar大鼠，體質(zhì)量180～220 g，由北京維通利華動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心提供，動(dòng)物合格證編號(hào)：SCXK（京）2016-001。飼養(yǎng)于天津市南開(kāi)醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。

1.2 實(shí)驗(yàn)主要試劑與儀器 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的缺口末端標(biāo)記測(cè)定（Tunel）試劑盒購(gòu)自瑞士 Roche公司；Akt抗體、p-Akt抗體、Bax抗體、Bcl-2抗體、Caspase-3抗體均購(gòu)自 Cell signal technology公司；二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測(cè)定試劑盒（Thermo公司）、渦旋振蕩儀（其林貝爾儀器制造有限公司）、低溫高速離心機(jī)（Eppendorf公司）、電泳儀（美國(guó)GE公司）、轉(zhuǎn)膜儀（美國(guó)GE公司）。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 實(shí)驗(yàn)分組及模型制備 大鼠實(shí)驗(yàn)期間保持自由飲水和進(jìn)食，飼養(yǎng)環(huán)境溫度為（24±1）℃，濕度為55%±5%，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周。根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表將115只大鼠分為空白組（15只）、假手術(shù)組（20只）、痰濁組（20只）、血瘀組（30只）、痰瘀互結(jié)組（30只）。空白組、假手術(shù)組和血瘀組用普通飼料喂養(yǎng)8周。痰濁組和痰瘀互結(jié)組用高脂飼料喂養(yǎng)8周，第49天目?jī)?nèi)眥取血，剔除血脂未升高的大鼠。第54天，血瘀組和痰瘀互結(jié)組行冠狀動(dòng)脈左前降支結(jié)扎術(shù)，假手術(shù)組只穿線，不結(jié)扎。實(shí)驗(yàn)過(guò)程中剔除不符合標(biāo)準(zhǔn)的大鼠，并記錄死亡情況。

1.3.2 標(biāo)本采集與處理 8周末大鼠腹腔注射10%水合氯醛麻醉，腹主動(dòng)脈取血后生理鹽水沖洗心臟，剪取心臟，-80℃冰箱保存待測(cè)。

1.3.3 Tunel染色法觀察大鼠心肌凋亡情況 取心臟組織，進(jìn)行石蠟包埋、切片，依據(jù)Tunel試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，光學(xué)顯微鏡下觀察各組大鼠心肌細(xì)胞凋亡情況。

1.3.4 蛋白免疫印跡（Western blot）法檢測(cè)心肌組織 Akt、p-Akt、Bcl-2、Bax 和 Caspase-3 蛋白表達(dá)情況 取適量左心室心肌組織，按照心肌組織質(zhì)量∶裂解液體積=1∶10的比例加入配置好的裂解液，冰上勻漿。然后13 000 r/min、4℃離心15 min。離心完成后取上清分裝保存。采用BCA法進(jìn)行蛋白定量測(cè)定，計(jì)算上樣量，100℃水浴變性10 min，冷卻后保存于-20℃冰箱中。用移液槍將蛋白標(biāo)記物（Marker）及待測(cè)樣品依次加入到加樣孔內(nèi)，電泳1 h，切膠，將蛋白轉(zhuǎn)印至聚偏氟乙烯（PVDF）膜，TBST漂洗2 min，用5%脫脂奶粉室溫封閉，置于搖床上，輕搖1 h。吸盡封閉液，加入一抗，4℃過(guò)夜。次日回收一抗，加TBST洗液3次，每次5 min。吸盡洗液，加入二抗，孵育2 h，之后洗滌3次，每次5 min。最后用ECL化學(xué)發(fā)光顯示，收集圖片，Image J程序?qū)l帶上的灰度值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，從而進(jìn)行定量分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 23.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，進(jìn)行正態(tài)分布檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)后，多組間比較使用單因素方差分析（One-Way ANOVA），組間兩兩比較采用LSD法，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Tunel染色 空白組和假手術(shù)組未見(jiàn)明顯細(xì)胞凋亡，與假手術(shù)組相比，痰濁組、血瘀組和痰瘀互結(jié)組大鼠心肌細(xì)胞凋亡數(shù)目增加，痰濁組大鼠心肌可見(jiàn)少量細(xì)胞凋亡，血瘀組和痰瘀互結(jié)組大鼠心肌組織存在大量細(xì)胞凋亡。見(jiàn)圖1。

圖1 大鼠心臟病理結(jié)構(gòu)變化的影響（Tunel，×100）Fig.1 Pathological changes in the cardiac tissue of rats(Tunel，× 100)

2.2 心肌組織蛋白表達(dá)變化 與假手術(shù)組相比，空白組大鼠Akt、Bcl-2、Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)水平和Bax/Bcl-2比值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，p-Akt蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.01）；血瘀組和痰瘀互結(jié)組大鼠Akt、p-Akt和Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）；Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05或 P＜0.01）；痰濁組大鼠 p-Akt蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05），Akt、Bcl-2、Bax 和 Caspase-3 蛋白表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異；痰濁組和血瘀組大鼠Bax/Bcl-2比值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但具有升高趨勢(shì)，痰瘀互結(jié)組大鼠Bax/Bcl-2比值顯著升高（P＜0.05）。與痰濁組相比，血瘀組p-Akt蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.01），Akt、Bcl-2、Bax、Caspase-3 蛋白表達(dá)和 Bax/Bcl-2比值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但Akt、Bcl-2蛋白表達(dá)有降低趨勢(shì)，Bax、Caspase-3蛋白表達(dá)和Bax/Bcl-2比值有升高趨勢(shì)；痰瘀互結(jié)組Akt和p-Akt蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05或 P＜0.01），Caspase-3蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05）。與血瘀組相比，p-Akt蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05），Caspase-3蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05），Bax、Bcl-2 蛋白表達(dá)水平和 Bax/Bcl-2 比值無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但Bax蛋白表達(dá)和Bax/Bcl-2比值有升高趨勢(shì)，Bcl-2蛋白表達(dá)有降低趨勢(shì)。見(jiàn)圖2-7。

3 討論

圖2 心肌組織Akt蛋白表達(dá)（）Fig.2 Expression of Akt protein in the myocardial tissue of rats（）

圖3 心肌組織Bax蛋白表達(dá)（）Fig.3 Expression of Bax protein in the myocardial tissue of rats（）

圖4 心肌組織p-Akt蛋白表達(dá)（）Fig.4 Expression of p-Akt protein in the myocardial tissue of rats（）

圖5 心肌組織Bcl-2蛋白表達(dá)（）Fig.5 Expression of Bcl-2 protein in the myocardial tissue of rats（）

CHD屬中醫(yī)“胸痹”范疇，《金匱要略·胸痹心痛氣短脈證治》中記載：“師曰：夫脈當(dāng)取太過(guò)不及，陽(yáng)微陰弦，即胸痹而痛，所以然者，責(zé)其極虛也?！碧岢鲂乇缘牟C(jī)為“陽(yáng)微陰弦”，中醫(yī)證型多屬本虛標(biāo)實(shí)，虛實(shí)夾雜的復(fù)合證型[7]?！栋Y因脈治》云：“胸痹之因，飲食不節(jié)，饑飽損傷，痰凝血滯，中焦混濁，則悶食悶痛之癥作矣?！北砻鳌疤禎帷焙汀把觥睘镃HD重要的致病因素。鄧鐵濤教授認(rèn)為CHD屬本虛標(biāo)實(shí)痰瘀相關(guān)的病機(jī)，本虛主要為心陰、心陽(yáng)虛，標(biāo)實(shí)主要為痰與瘀[8]?！端貑?wèn)·奇病論》云：“食甘美而多肥也?！薄端貑?wèn)·痹論》云：“飲食自倍，腸胃乃傷。”脾為生痰之源，飲食不節(jié)或過(guò)食肥甘厚味，則內(nèi)傷脾胃，脾失健運(yùn)，氣血津液生化障礙，進(jìn)而導(dǎo)致水濕內(nèi)停，聚而生痰，脾胃損傷，氣血生化無(wú)源，中氣不足，氣血運(yùn)行不利，日久則瘀，瘀血阻滯又可引起氣機(jī)不暢，致體內(nèi)津液代謝障礙，痰瘀互生，兩者相互影響，進(jìn)而形成痰瘀互結(jié)的證候造成血流緩慢、血管堵塞引發(fā)CHD[9-10]。CHD痰瘀互結(jié)證病程較長(zhǎng)，病勢(shì)纏綿難愈，由此可見(jiàn)，對(duì)于CHD痰瘀互結(jié)證的研究已更為迫切。

西醫(yī)認(rèn)為CHD的發(fā)病是一個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程，其中幾種較為公認(rèn)的發(fā)病學(xué)說(shuō)包括脂肪浸潤(rùn)學(xué)說(shuō)、血栓形成和血小板聚集學(xué)說(shuō)、內(nèi)皮損傷反應(yīng)學(xué)說(shuō)和平滑肌克隆學(xué)說(shuō)。內(nèi)皮損傷與動(dòng)脈粥樣硬化緊密相連，而動(dòng)脈粥樣硬化又是CHD的最基本病理變化。磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）/Akt作為細(xì)胞內(nèi)重要的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路之一，可調(diào)節(jié)下游效應(yīng)分子的活化狀態(tài)，發(fā)揮凋亡作用。細(xì)胞凋亡會(huì)進(jìn)一步損傷內(nèi)皮功能，導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和發(fā)展[11]。

圖6 心肌組織Bax/Bcl-2蛋白表達(dá)（）Fig.6 Expression of Bax/Bcl-2 protein in the myocardial tissue of rats（）

圖7 心肌組織Caspase-3蛋白表達(dá)（）Fig.7 Expression of Caspase-3 protein in the myocardial tissue of rats（）

Akt是PI3K下游作用的主要介質(zhì)，通過(guò)協(xié)調(diào)各種細(xì)胞內(nèi)信號(hào)和控制細(xì)胞對(duì)外部刺激的反應(yīng)來(lái)調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖和存活。在活化的PI3K/Akt途徑中，PI3K和Akt的表達(dá)和磷酸化水平顯著提高，可以抑制磷酸酶和張力蛋白同源物對(duì)血管平滑肌細(xì)胞存活的抑制作用，使細(xì)胞增殖率增加，細(xì)胞凋亡水平降低，從而保護(hù)心肌細(xì)胞免受傷害[12]。另有研究顯示Akt的磷酸化調(diào)節(jié)可以影響PI3K/Akt/內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）信號(hào)傳導(dǎo)途徑和eNOS去磷酸化，誘導(dǎo)主動(dòng)脈環(huán)的擴(kuò)張，通過(guò)PI3K/Akt/eNOS信號(hào)傳導(dǎo)途徑增強(qiáng)了eNOS釋放，導(dǎo)致血管舒張反應(yīng)[13]。

心肌細(xì)胞富含線粒體，線粒體途徑是細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)途徑中最重要的途徑之一，線粒體介導(dǎo)的凋亡在CHD心肌損傷的發(fā)病機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用。Bcl-2家族蛋白是此途徑中的關(guān)鍵因子，Bcl-2和Bax蛋白均屬于Bcl-2家族，此類蛋白表達(dá)水平的高低與凋亡調(diào)控直接相關(guān)[11，14-15]。LIU等[16]通過(guò)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，大鼠心臟缺血再灌注會(huì)降低Bax和Caspase 3蛋白的表達(dá)，增加Bcl-2的表達(dá)，誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡，從而損傷心臟，引發(fā)功能障礙。

在本次實(shí)驗(yàn)中，Tunel染色結(jié)果顯示痰濁組、血瘀組和痰瘀互結(jié)組心肌細(xì)胞均有明顯凋亡現(xiàn)象，血瘀組和痰瘀互結(jié)組心肌細(xì)胞凋亡較重。提示痰濁組、血瘀組和痰瘀互結(jié)組具有不同程度的心肌損傷，其中血瘀組和痰瘀互結(jié)組損傷程度較重，痰濁組損傷程度較輕。血瘀組和痰瘀互結(jié)組大鼠Akt、p-Akt和Bcl-2蛋白表達(dá)水平明顯降低（P＜0.05或P＜0.01）；Bax和Caspase-3蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05或P＜0.01）；痰濁組大鼠p-Akt蛋白表達(dá)明顯升高（P＜0.05），痰瘀互結(jié)組大鼠Bax/Bcl-2比值顯著升高（P＜0.05），結(jié)果提示痰濁組、血瘀組和痰瘀互結(jié)組大鼠心肌細(xì)胞都有不同程度的凋亡，其中痰瘀互結(jié)組細(xì)胞凋亡損傷最重。研究表明細(xì)胞凋亡可能是CHD痰瘀互結(jié)證的發(fā)病機(jī)制之一。