秦菱涔 杜先智

重慶醫(yī)科大學附屬第二醫(yī)院呼吸內科400010

結核病是由結核分枝桿菌傳播所引起的一種全球流行性疾病,是造成人類死亡的十大原因之一。該疾病每年造成140萬人死亡,盡管目前有多種抗結核藥物用于抗結核治療,結核病依然對全球公共衛(wèi)生造成極大威脅。結核病是一種以空氣傳播為主要傳播途徑的肺部疾病,亦有少數可傳播到人體其他器官引起肺外結核。研究發(fā)現,結核菌通過阻斷巨噬細胞的凋亡、促進細胞壞死、誘導細胞自噬以及避免凋亡等途徑來避免機體產生免疫反應并誘發(fā)機體感染[1-3]。正常的吞噬過程可以概括為細胞外受體與病原體發(fā)生初始相互作用后,信號通路誘導肌動蛋白絲聚合,使細胞膜伸長形成偽足包圍病原體。細菌等病原微生物一旦被巨噬細胞所吞噬,細胞膜就會閉合成為一種叫做初期吞噬體的結構,隨后該結構與溶酶體融合成為晚期核內體或吞噬溶酶體。同時該結構中的數種溶酶體裂解酶在酸性環(huán)境下(最適pH值為4.5～5.0)降解病原體。結核分枝桿菌能通過以下幾種機制阻止吞噬體成熟。

1 抑制吞噬體內的酸化

結核分枝桿菌通過胞吞作用或與CR3、FcγR等特異性受體結合的方式進入巨噬細胞中,并聚集在吞噬體內。巨噬細胞處于靜息狀態(tài)時,吞噬體未與溶酶體融合,吞噬體內呈弱酸性,pH值為6.2左右;當結核分枝桿菌進入巨噬細胞中將巨噬細胞激活后,含有結核分枝桿菌的吞噬體將會與溶酶體融合形成吞噬溶酶體,融合過程中溶酶體中的大量蛋白水解酶將被激活,這些被激活的蛋白水解酶分解細菌等大分子物質形成的終產物使得吞噬體酸化,其pH值甚至可低至4.5[4]。然而事實上結核分枝桿菌能在巨噬細胞中生存、繁殖,且生存的微環(huán)境pH值較高,這表明結核分枝桿菌可能抑制吞噬體的酸化[5]。

研究表明,巨噬細胞內結核分枝桿菌將LAM和脂多糖等成分分泌到吞噬體中,同時LAM、脂多糖被轉運到囊泡內作為脂膜循環(huán),吞噬體將會與胞內的某些囊泡發(fā)生融合。在融合過程中,吞噬體與來自囊泡的膜蛋白結合,吞噬體對與之結合的膜蛋白具有一定選擇性,能選擇性地抑制其與H+-ATP酶結合,導致吞噬體始終缺乏H+-ATP酶參與酸化作用。這樣就使吞噬體酸化過程障礙,吞噬體始終處于一個較高的pH值,從而阻止了吞噬性溶酶體的形成[6]。同時結核分枝桿菌在巨噬細胞內生長時會產生并釋放大量的氨,升高溶酶體內pH值同時抑制溶酶體內蛋白質的降解,干擾溶酶體內蛋白質的代謝減少酸性終產物形成,從而抑制了吞噬體-溶酶體的結合[7]。

2 結核分枝桿菌感染誘導的細胞因子微環(huán)境影響Rab家族分子表達

研究結果顯示,結核分枝桿菌在真核細胞內通過膜融合調節(jié)Rab分子功能[8]。Rab家族分子是RAS蛋白超家族的成員,其通常具有GTPase折疊和低相對分子質量;它們位于細胞內膜中,與人體膜融合過程和囊泡運輸功能相關[9]。Rab20依賴的膜轉運通路通過增加膜流入吞噬體的數量,有助于將結核分枝桿菌維持在膜結合室中,減少具有胞質通路的吞噬體數量,從而清除病原菌[10]。Rab分子是吞噬體成熟的標志物,Rab5出現在吞噬體的早期,Rab9出現在吞噬體的晚期[11]。在正常條件下,Rab7的活性形式(aRab7)與位于吞噬體膜中的Rab7相互作用溶酶體蛋白結合。aRab7/Rab7相互作用溶酶體蛋白復合物促進與微管相關的吞噬體/動力蛋白-動力蛋白激活蛋白復合物之間的聯系。因此,吞噬體沿向心方向移動,促進吞噬體小管延伸到晚期內吞區(qū)室并誘導吞噬體成熟過程[12]?；罘种U菌釋放出一種催化Rab7 GTP/GDP轉換的因子,削弱Rab7與Rab7相互作用溶酶體蛋白相互作用的能力,從而阻礙感染的吞噬體與溶酶體融合[13]。同時研究表明Rab22a是晚期內體的主要調節(jié)因子,感染結核分枝桿菌的吞噬體積累Rab22a以阻止Rab7聚集,使吞噬體成熟延遲。

3 含色氨酸天冬氨酸的外殼蛋白 (tryptophan-aspartate containing coat protein,TACO)/coronin 1的潴留

保持細胞外信號與細胞質整合的一個重要分子是TACO,也稱為p57、coronin 1或CORO1A[14-15]。TACO對于調節(jié)多種F-肌動蛋白依賴性細胞過程至關重要[16-17]。90%左右含有活細菌的吞噬體保留了TACO,但與死菌結合的巨噬細胞在吞噬作用后的前2小時內釋放出TACO。因此,TACO在吞噬體膜上的長時間潴留可能是活細菌阻礙吞噬體成熟的原因。

在牛分枝桿菌卡介苗感染模型中發(fā)現,TACO潴留是對細菌吞噬產生的細胞內信號的反應,但是只有當細菌以團塊形式吞噬而不是作為單一生物體時才能觀察到TACO潴留。此外,TACO定位于吞噬體膜中的Toll樣受體2型(Toll-like receptor-2,TLR-2),表明TACO潴留是細菌聚集體阻斷TLR2依賴性抗微生物機制的結果[18]。

另一方面,TACO參與抑制吞噬體成熟并非直接作用:因TACO促進細胞內Ca2+流入增加,激活鈣調磷酸酶(鈣依賴的磷酸酶),后者直接阻止吞噬體-溶酶體融合[19]。

4 ESX-1系統(tǒng)的蛋白質阻斷吞噬體-溶酶體融合

分枝桿菌屬Ⅶ型分泌系統(tǒng)即ESAT-6分泌系統(tǒng)-1(ESX-1),由RD-1及周圍區(qū)域基因編碼,該系統(tǒng)釋放的抗原有以下4種:具有高度免疫原性的CFP-10、ESAT-6以及MM1553和Mh3881c 2種新蛋白。研究證明,以上抗原在抑制吞噬體成熟的過程中是不可或缺的。其中CFP-10、ESAT-6和Mh3881c以抗原依賴的方式分泌,特別是Mh3881c抗原,在其羧基末端斷裂后,會導致吞噬體成熟停滯。而缺乏該系統(tǒng)的分枝桿菌在感染24、72 h后抑制吞噬體-溶酶體融合的效率較低,在巨噬細胞內存活的效率也較低。

ESX-1的吞噬體干擾作用為結核分枝桿菌的胞外DNA等物質提供了細胞質通路,細胞外DNA作為一種特異性激活配體,直接識別結核分枝桿菌DNA并激活STING的胞質DNA傳感器環(huán)狀GMP-AMP合成酶[20],作用于STING-TBK1-IRF3信號軸,誘導Ⅰ型干擾素產生[21]。有趣的是,缺乏IRF3的小鼠對長期結核分枝桿菌感染具有耐藥性[22]。實驗室發(fā)現,吞噬體破壞將導致結核分枝桿菌DNA的胞質定位觸發(fā)了負責發(fā)病機制的STING-TBK1-IRF3-Ⅰ型干擾素通路[23]。綜上,ESX-1系統(tǒng)能通過胞質結核分枝桿菌DNA誘導Ⅰ型干擾素產生破壞吞噬體而阻斷吞噬體-溶酶體融合。

5 自噬參與延遲吞噬體成熟

自噬是細胞器和細胞溶質分子在自噬體囊泡內被識別和降解的過程。自噬和吞噬作用具有共同的特征,研究表明自噬可能調節(jié)吞噬作用[24]。在自噬中,吞噬細胞的雙膜結構將細胞質中大分子成分包圍,演變成一個自噬體,與溶酶體融合形成自噬溶酶體[12]。這個過程涉及與自噬有關的家族蛋白 (Atg)[25],它以復雜的交互級聯和多種功能運作。自噬包括參與囊泡形成的4種蛋白質:Atg13、FIP2000、Atg101和Atg1/ULK1復合物 (ULK1/2)。

哺乳動物雷帕霉素靶蛋白、哺乳動物雷帕霉素靶蛋白非依賴性途徑和活化蛋白激酶靶點等途徑調控自噬的起始。Ⅲ型磷脂酰肌醇3-激酶Vps34、p150、Atg14和Beclin 1等組成的空泡蛋白分選復合體影響吞噬體的形成。吞噬體膜的延長首先需要Atg12與Atg5結合,并與Atg16L形成復合物[26]。然后與微管相連接的LC3分裂,產生胞質LC3-i(Atg8),通過與磷脂酰乙醇胺結合形成LC3-ii,導致LC3-ii附著在隔離膜上[27]。關閉隔離膜使得自噬體形成過程得以完成,隔離膜與溶酶體融合形成自溶酶體并加工和消化細胞內病原體。

結核分枝桿菌可能通過阻止自噬體發(fā)展為自噬溶酶體或抑制其在自噬體內的降解等機制逃避自噬過程。磷脂酰肌醇3-激酶依賴性結合PI3P,PI3P參與自噬體成熟。因此,結核分枝桿菌的糖基化磷脂酰肌醇充當了細胞內運輸途徑的抑制劑,這對結核分枝桿菌抑制自噬體成熟是不可或缺的。

另一方面,LC3相關吞噬作用 (LC3-associated phagocytosis,LAP)在對抗多種細胞內病原體的感染中發(fā)揮重要作用。LAP包括傳統(tǒng)受體和自噬受體,但作為自噬作用的觸發(fā)因子的確切機制目前仍不清楚。TLR和c型凝集素等模式識別受體在啟動細胞內信號傳導中起關鍵作用,該信號傳導導致吞噬體內LC3結合,誘導促炎細胞因子的合成。研究表明,結核分枝桿菌可以防止LAPosome融合,促進結核分枝桿菌的存活和增殖。

只有部分吞噬體與LC3有關[28]。研究表明,吞噬溶酶體囊泡中發(fā)現的beclin和LC3等分子在小鼠巨噬細胞吞噬體中的易位與雙膜囊泡無關。該機制由識別受體如Fc、TLR、磷脂酰絲氨酸受體TIM4或β-葡聚糖Dectin-1受體啟動;一旦發(fā)生受體識別,病原體就被吞噬并隔離在一個單膜吞噬體內,此時,在LAP下,磷脂酰肌醇-3-磷酸生成的Ⅲ類pi3-激酶復合物特異性結合到該單膜吞噬體腔室內,最后LC3-Ⅱ介導吞噬體與溶酶體快速融合[29]。

與傳統(tǒng)的吞噬作用不同,在LC3介導的吞噬作用中,細胞類型和病原體將影響抗原表達。例如,在小鼠巨噬細胞中,抗原處理速度加快,而在人類細胞中,吞噬體的成熟似乎有所延遲[30]。有些微生物已具有完全避免吞噬體作用的功能,在這些區(qū)室內或在宿主細胞胞質內繁殖。

綜上所述,結核分枝桿菌是一種細胞內病原體,它具有多種機制來逃避宿主的免疫反應。抑制吞噬體成熟、阻止吞噬體溶酶體形成作為機制之一將直接影響抗原加工和呈遞,導致其他細胞群的無效激活,從而使結核分枝桿菌在巨噬細胞內生存、繁殖。盡管在該領域已有相關研究,但這種機制的確切性質仍然是難以捉摸的,需要進一步研究其阻止吞噬體成熟的分子機制。同時抑制吞噬體溶酶體形成并非結核分枝桿菌存活、增殖、致病的唯一機制,除此之外,還有降低抗原呈遞分子的表達、通過壞死促進細胞死亡、防止細胞凋亡等機制。因此,進一步探討吞噬體成熟和吞噬體-溶酶體融合的機制對于在早期階段更好地控制疾病至關重要,為開發(fā)新的診斷方法和治療提供了新思路。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突