鄧順江 鄒文斌 廖專

海軍軍醫(yī)大學(xué)長(zhǎng)海醫(yī)院消化內(nèi)科，上海市胰腺疾病研究所，上海 200433

【提要】 羧基酯脂肪酶(CEL)通常由胰腺分泌并轉(zhuǎn)移到十二指腸參與水解消化脂肪、膽固醇酯和脂溶性維生素，是人體內(nèi)重要的消化酶。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)該基因在胰腺疾病的發(fā)病中起重要作用，尤其是慢性胰腺炎和青少年發(fā)病的成人型糖尿病。該基因致病的相關(guān)變異主要包括兩類：可變數(shù)量串聯(lián)重復(fù)區(qū)(VNTR)數(shù)量的改變及內(nèi)部突變；與CEL高度同源的假基因(CELP)發(fā)生重組形成CEL-HYB雜合變異。CEL相關(guān)變異通過(guò)胞內(nèi)自噬和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等機(jī)制參與胰腺疾病的發(fā)生。

羧基酯脂肪酶(carboxyl ester lipase，CEL)通常由胰腺分泌并轉(zhuǎn)移到十二指腸參與水解消化脂肪、膽固醇酯和脂溶性維生素，是人體內(nèi)重要的消化酶。人CEL主要在胰腺腺泡細(xì)胞和乳房泌乳腺體表達(dá)，其中胰腺腺泡細(xì)胞是CEL表達(dá)的主要部位，CEL在胰液中大約占總蛋白的4%[1]。近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)該基因在胰腺疾病的發(fā)病中起重要作用，尤其是慢性胰腺炎和青少年發(fā)病的成人型糖尿病。本文就CEL在胰腺疾病中的作用及其機(jī)制研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

一、CEL的結(jié)構(gòu)與功能

人CEL長(zhǎng)9 850 bp，定位于染色體9q34.3[2]，并靠近ABO基因座，由11個(gè)外顯子和10個(gè)內(nèi)含子組成[3](圖1)。外顯子1最不保守，編碼CEL mRNA 5′非翻譯結(jié)構(gòu)域，外顯子2編碼部分肝素結(jié)合位點(diǎn)[4]，外顯子3和7編碼CEL蛋白上的2個(gè)二硫鍵[5]，其有助于穩(wěn)定酶的結(jié)構(gòu)。外顯子5、8、10分別編碼Ser194、Asp320和His435殘基[6]，它們構(gòu)成CEL催化位點(diǎn)，并參與底物催化[7]。CEL最后一個(gè)外顯子包含一個(gè)GC含量豐富的可變數(shù)量串聯(lián)重復(fù)區(qū)(variable number of tandem repeats，VNTR)。目前發(fā)現(xiàn)的重復(fù)區(qū)數(shù)量有3～23個(gè)不等[8]，13～17個(gè)出現(xiàn)頻率最高，16個(gè)重復(fù)區(qū)是所有類型中最主要的類型[9-11]，有研究將16個(gè)重復(fù)定義為N型，<16個(gè)重復(fù)區(qū)為S，>16個(gè)重復(fù)區(qū)為L(zhǎng)[12]。每一個(gè)重復(fù)區(qū)由33個(gè)堿基的重復(fù)序列組成，可在CEL尾部編碼11個(gè)氨基酸序列。VNTR使得CEL呈現(xiàn)高度的多態(tài)性。

一個(gè)類似CEL的假基因(CEL-like pseudogene, CELP)位于CEL的下游約11 kb的位置，CELP在人體多個(gè)組織中均有轉(zhuǎn)錄，與CEL相比，其缺少第2～7個(gè)外顯子，且在第2個(gè)外顯子中包含一個(gè)終止密碼子，不能翻譯出有功能的蛋白質(zhì)[13](圖1)。學(xué)者提出CELP實(shí)際上是原始基因，因?yàn)樾∈驝EL的啟動(dòng)子區(qū)域與人類CELP基因的啟動(dòng)子區(qū)域高度吻合[14]。

圖1CEL-CELP基因座的結(jié)構(gòu)圖。紅色和藍(lán)色分別表示CEL和CELP的外顯子區(qū)域

CEL包括球狀N-末端和C-末端兩個(gè)主要的結(jié)構(gòu)域，前者包括535個(gè)氨基酸殘基(不含信號(hào)肽)，后者本質(zhì)上是無(wú)序的11個(gè)重復(fù)氨基酸序列的延伸臂[15-16]。N-末端區(qū)域的氨基酸序列(包括催化三聯(lián)體Ser194-His435-Asp320)在迄今為止檢測(cè)到的所有脊椎動(dòng)物物種中均高度保守[17]，該區(qū)域也與其他脂肪酶和酯酶具有相似性[6,18]。

CEL在十二指腸中被膽鹽激活后可水解食用脂肪、膽固醇酯和脂溶性維生素[19]。CEL還可催化脂肪酸和乙醇合成，后者的非氧化代謝物可能導(dǎo)致胰腺損傷和酒精性胰腺炎。有研究表明，脂肪酸乙酯通過(guò)對(duì)線粒體的直接毒性作用而引起胰腺腺泡細(xì)胞的病理改變[20]。此外有學(xué)者提出，CEL可以降解支鏈脂肪酸酯，該類分子具有增強(qiáng)胰島素敏感性和抗炎作用[21]。

二、 CEL與胰腺炎

1．CEL在急性胰腺炎(AP)中的作用：CEL和淀粉酶一樣，是由胰腺外分泌部分泌的消化酶，參與食物的消化，反映胰腺的功能，與胰腺的損傷密切相關(guān)。有研究證實(shí)在急性間質(zhì)性胰腺炎或壞死性胰腺炎患者血清中CEL水平明顯上升[22]。 因此，即使在血清淀粉酶水平正常的情況下，CEL的血清水平如果異常升高，也可提示AP[23]。然而CEL在AP發(fā)病機(jī)制中的研究較少。

2．CEL在慢性胰腺炎(CP)中的作用：CP的特征是長(zhǎng)期的胰腺炎癥-纖維化改變，缺乏理想的治療方法。有研究顯示，胰腺炎的發(fā)生機(jī)制與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)相關(guān)，而吸煙和乙醇都會(huì)增加ERS[24]。實(shí)際上，在吸煙和乙醇的作用下內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)含有的CEL發(fā)生結(jié)構(gòu)功能的改變并形成二聚體，進(jìn)而使更多的蛋白質(zhì)聚集成核，這已經(jīng)被證明是CEL的結(jié)構(gòu)改變而參與CP的致病機(jī)制[25-26]。

歐洲報(bào)道了一種缺失型雜合基因(CEL-HYB)[27]。它由CEL與CELP發(fā)生非等位基因同源重組而成，CEL-HYB近端部分(由外顯子1～10構(gòu)成)來(lái)源于CEL，而包含VNTR的遠(yuǎn)端部分來(lái)源于CELP，命名為CEL-HYB1。CEL-HYB1在歐洲CP患者中的攜帶率顯著高于正常對(duì)照組，通過(guò)體外細(xì)胞模型發(fā)現(xiàn)CEL-HYB1脂肪酶的活性只有野生型CEL活性的40%，且在腺泡細(xì)胞內(nèi)聚集誘發(fā)自噬，從而損害胰腺細(xì)胞。中國(guó)牽頭的一項(xiàng)國(guó)際多中心研究發(fā)現(xiàn)[28]，在亞洲人群中很少存在CEL-HYB1，而是出現(xiàn)融合部位更靠前的CEL-HYB2，該變異目前認(rèn)為與CP的發(fā)生無(wú)直接關(guān)聯(lián)，功能實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)。

日本一項(xiàng)研究報(bào)道酒精性CP(alcoholic chronic pancreatitis, ACP)與VNTR的長(zhǎng)度的相關(guān)性[11]，共納入100例ACP、52例酗酒者(經(jīng)ERCP檢查未發(fā)現(xiàn)胰腺炎)、50例非酒精性CP、96例高脂血癥以及435例健康者。結(jié)果顯示，相比于其他組，ACP中NN型顯著減少，L等位基因頻率增加，提示攜帶L等位基因可能是ACP的易感因素；另外，與非酒精性CP和高脂血癥者相比，ACP中S等位基因頻率也顯著增加，但與酗酒和正常對(duì)照組的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，因此，S等位基因的存在不會(huì)增加酗酒者患胰腺炎的風(fēng)險(xiǎn)。由于該研究中高脂血癥組的平均年齡偏大，而且非酒精性CP病因復(fù)雜，所以S等位基因的意義還有待進(jìn)一步研究。

另一項(xiàng)德國(guó)的研究發(fā)現(xiàn)，相比于健康者，ACP和特發(fā)性CP個(gè)體中L和S等位基因的頻率有所升高，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.4)[29]。人種和試驗(yàn)分組的差異或可解釋歐洲和日本研究結(jié)果的不同。為了闡明VNTR與CP的關(guān)系，尚需大樣本量進(jìn)行確證。

三、CEL與胰腺癌

與其他腺泡細(xì)胞標(biāo)記類似，當(dāng)胰腺腫瘤細(xì)胞出現(xiàn)導(dǎo)管表型時(shí)CEL的表達(dá)喪失[30]。有研究發(fā)現(xiàn)德國(guó)和挪威人群患者的CEL VNTR與胰腺癌無(wú)相關(guān)性[31]，而存在于CEL VNTR的第2重復(fù)區(qū)中的常見(jiàn)單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism, SNP, rs488087)被認(rèn)為是增加發(fā)生胰腺癌風(fēng)險(xiǎn)的標(biāo)志[32]。需要注意的是，該研究?jī)H包括30例確診為胰腺導(dǎo)管腺癌的患者，提示上述SNP有待在大樣本患者隊(duì)列中進(jìn)一步研究。

2017年Martinez等[33]在胰腺SOJ-6細(xì)胞中檢測(cè)到CEL VNTR區(qū)域發(fā)生的C堿基插入突變，該突變使得終止密碼子提前出現(xiàn)，從而導(dǎo)致翻譯的蛋白質(zhì)序列變短；在胰液或胰腺組織中，可通過(guò)特異性抗體檢測(cè)突變后CEL的C-末端特有氨基酸序列，該突變序列或許可作為胰腺癌的診斷標(biāo)志物。

四、CEL與胰腺內(nèi)外分泌功能不全

胰腺的主要功能包括內(nèi)分泌和外分泌功能，胰腺內(nèi)分泌細(xì)胞主要存在于胰島，可以合成胰島素、胰高血糖素、生長(zhǎng)抑素和胰多肽，內(nèi)分泌功能障礙與糖尿病相關(guān)；胰腺外分泌細(xì)胞主要分泌消化酶和碳酸氫鹽，其功能障礙可引起消化吸收障礙。胰島和胰腺外分泌組織共同構(gòu)成胰腺實(shí)質(zhì)，結(jié)構(gòu)上彼此相鄰，功能上也存在相互依賴的關(guān)系。有研究發(fā)現(xiàn)，在1型糖尿病和2型糖尿病中15%～30%的個(gè)體會(huì)出現(xiàn)嚴(yán)重的胰腺外分泌功能不全[34]。

青少年發(fā)病的成人型糖尿病( maturity-onset diabetes of the young，MODY)是一種常染色體顯性遺傳性糖尿病，通常在25歲以前出現(xiàn)。MODY8患者除了糖尿病的表現(xiàn)，還具有緩慢進(jìn)展的胰腺外分泌功能損害。Raeder等[11]在羅威家系中發(fā)現(xiàn)在CEL VNTR區(qū)發(fā)生的單堿基缺失突變可以導(dǎo)致MODY8和胰腺外分泌功能不全。在第1個(gè)家系中發(fā)現(xiàn)的突變發(fā)生在VNTR中的第1個(gè)重復(fù)區(qū)(c.1686delT，p.C563fsX673，命名為 DEL1)，該突變引起移碼改變，導(dǎo)致第672個(gè)氨基酸殘基后提前出現(xiàn)終止密碼子，且與該家系糖尿病和糞彈力蛋白酶不足(<200 mg/g)共分離(lod值分別為4.47和11.6)，攜帶這個(gè)突變的家庭成員基本都會(huì)發(fā)展為糖尿病，早期需要檢測(cè)糞彈力蛋白以明確其胰腺外分泌功能的狀態(tài)，因?yàn)檫@種類型的突變攜帶者最先出現(xiàn)的是胰腺外分泌功能受損。第2個(gè)家系突變發(fā)生在VNTR的第4個(gè)重復(fù)區(qū)(c.1785delC, p.C596fsX695)，改變了自第596個(gè)氨基酸殘基起始的閱讀框，導(dǎo)致第694位氨基酸殘基后提前出現(xiàn)終止密碼子，該突變存在于該家庭有糖尿病或糞彈力蛋白酶不足的個(gè)體中。在以上2個(gè)家系中，攜帶上述兩個(gè)突變的個(gè)體胰腺內(nèi)分泌和外分泌功能表現(xiàn)類似，所有突變攜帶者都出現(xiàn)了糞彈力蛋白酶不足， 在未患病的家族成員及無(wú)血緣關(guān)系的糖尿病志愿者中不存在這兩種突變。

有研究顯示，過(guò)表達(dá)DEL1的細(xì)胞促進(jìn)形成蛋白聚集體，進(jìn)而刺激產(chǎn)生未折疊蛋白應(yīng)答，這種現(xiàn)象在未突變的細(xì)胞內(nèi)不會(huì)出現(xiàn)[35]。在MODY8患者中，異常蛋白的聚集、再攝取和降解過(guò)程可能會(huì)導(dǎo)致胰腺外分泌功能障礙[26]。有研究證實(shí)，DEL1 突變體比正常CEL分泌減少，且大部分蛋白保留在細(xì)胞內(nèi)，在大鼠AR42J腺泡細(xì)胞和人HEK293細(xì)胞中，突變蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)聚集引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激并刺激產(chǎn)生未折疊蛋白質(zhì)應(yīng)答，這種異常蛋白還會(huì)引起細(xì)胞凋亡和NF-κB的激活， 因此，作者提出DEL1通過(guò)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的蛋白毒性增強(qiáng)，引起功能不適應(yīng)而導(dǎo)致MODY8[36]。

有學(xué)者運(yùn)用一種多重PCR和序列分析結(jié)合的方法可以高效地檢測(cè)CEL VNTR區(qū)的單堿基插入或缺失突變，以及VNTR的數(shù)量，他們分析了95例丹麥MODY基因陰性(MODYX)患者的CEL VNTR區(qū)，在前8個(gè)重復(fù)區(qū)中沒(méi)發(fā)現(xiàn)任何單堿基突變，然而一個(gè)先證者只含3個(gè)VNTR，并發(fā)現(xiàn)該家系中有7個(gè)成員攜帶該基因型，其中4人患糖尿病[7]。提示攜帶3個(gè)VNTR的基因型可能是MODYX的危險(xiǎn)因素，但由于樣本量太少，還有待后續(xù)研究證實(shí)并探索其機(jī)制。此外，他們還在MODYX和健康人群中檢測(cè)到了含有3個(gè)完整VNTR拷貝的情況(2.5%和5%)，作者認(rèn)為這可能是同源不規(guī)則重組引起的。有研究在該類基因攜帶者中發(fā)現(xiàn)了至少兩種不同的重復(fù)突變體(CEL-DUP)，其在北歐人群中具有高于1%的攜帶率，CEL-DUP是否與胰腺疾病有關(guān)還有待研究[27]。

五、小 結(jié)

富含GC的VNTR和高度同源的CELP使得全基因組關(guān)聯(lián)研究和深度測(cè)序分析很難全面覆蓋CEL的所有遺傳突變，因此該基因仍然是進(jìn)一步深入探索與胰腺疾病相關(guān)的優(yōu)勢(shì)候選基因。CEL變異可能是CP、胰腺癌以及胰腺內(nèi)外分泌功能不全的重要危險(xiǎn)因素。由于CEL的下游相隔11 kb的位置有一個(gè)假基因CELP，CEL的這種特殊結(jié)構(gòu)決定了其多態(tài)性，主要表現(xiàn)為散在分布的SNP、不同數(shù)量的VNTR重復(fù)、VNTR內(nèi)的單堿基插入或缺失、涉及整個(gè)CEL-CELP基因座的拷貝數(shù)變化這4類遺傳變異。突變蛋白在胰腺細(xì)胞內(nèi)聚集引起胞內(nèi)自噬和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，以及未折疊蛋白質(zhì)應(yīng)答可能是CEL突變參與胰腺疾病發(fā)病的機(jī)制，需要新的動(dòng)物模型以及細(xì)胞功能研究來(lái)進(jìn)一步探索。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突