蘇潔，成扶雨，卜軍

（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院心血管內(nèi)科，上海 200127）

核受體（nuclear receptors，NRs）是一種配體調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子，多數(shù)NRs 在配體激素誘導(dǎo)后，可與核受體輔助調(diào)節(jié)因子結(jié)合，從而調(diào)控下游基因的表達(dá)。NRs 參與調(diào)節(jié)能量代謝，包括脂質(zhì)的利用與儲存、膽固醇的合成與分解、胰島素信號和葡萄糖代謝信號通路等。另外，NRs 在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)及晝夜節(jié)律等生物學(xué)功能方面發(fā)揮著重要作用。視黃酸受體相關(guān)的孤兒核受體（retinoic acid-related orphan receptors，RORs）和REV-ERBs（reverse viral erythroblastosis oncogene product）是2 種特殊的核受體亞群，參與調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律等多種生理過程。得益于二者的脂溶性，RORs 和REV-ERBs 能夠直接進(jìn)入胞核參與下游基因的調(diào)控。有研究顯示，在RORs 和REV-ERBs 參與調(diào)控的不同生理過程中[1]，其對血管穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)以及對心血管系統(tǒng)的作用是多方面的，本文將通過二者在維持血管穩(wěn)態(tài)與調(diào)節(jié)血管病理重構(gòu)方面的貢獻(xiàn)進(jìn)行綜述，進(jìn)一步歸納生物鐘核受體RORs 和REV-ERBs 在血管病理生理過程中的作用。

1 RORα 和REV-ERBα 的結(jié)構(gòu)與功能

NRs 作為重要的配體激活因子，可與其他蛋白質(zhì)協(xié)同作用，調(diào)節(jié)對機(jī)體發(fā)育、代謝平衡有重要作用的基因表達(dá)。當(dāng)配體與NRs 的配體結(jié)合域結(jié)合后，NRs 的構(gòu)象發(fā)生改變，從而募集輔因子蛋白，以配體依賴的方式調(diào)節(jié)靶基因轉(zhuǎn)錄的水平。大多數(shù)NRs以二聚體的形式與DNA 結(jié)合，包括同型二聚體（如類固醇激素）和異型二聚體[如類視黃醇X 受體（retinoid X receptors，RXRs）][2-3]；少量NRs 可作為單體與DNA 結(jié)合，被稱為孤兒核受體。

REV-ERBs 作為孤兒核受體家族的一員，之前由于尚未發(fā)現(xiàn)其配體，其參與調(diào)節(jié)重要生理功能的作用一直被忽視。直至紫質(zhì)/原血紅素（porphyrin/heme）被發(fā)現(xiàn)是REV-ERBα/β 的配體[4-5]，REVERBs 的作用才開始逐漸受到重視。另一個(gè)孤兒核受體亞群——RORs，也是十分重要的晝夜節(jié)律調(diào)節(jié)因子，它與REV-ERBs 具有相同的DNA 結(jié)合位點(diǎn)，并且常常與之在相同的組織中表達(dá)。它們的表達(dá)與機(jī)體免疫反應(yīng)和代謝過程密切相關(guān)，了解這些受體包括它們動(dòng)態(tài)的相互作用以及它們在機(jī)體生理學(xué)中的作用可進(jìn)一步提高研究人員對NRs 家族的認(rèn)識。

1.1 RORs

RORs 由3 種亞型組成，分別為RORα、RORβ和RORγ，3 種亞型呈現(xiàn)出高度的序列相似性，僅在受體的氨基末端區(qū)域有一定變化[6]。RORα 廣泛存在于哺乳動(dòng)物的各種組織中，如肝臟、骨骼肌、皮膚、肺、脂肪組織、腎臟、胸腺和大腦等[7]。人體中存在4種RORα 亞基（α1～α4），而小鼠體內(nèi)只存在2 種亞基（α1 和α4）[8]。RORβ 在體內(nèi)分布不及RORα 廣泛，其僅限于在中樞神經(jīng)系統(tǒng)表達(dá)，且小鼠體內(nèi)含有2 種亞基（β1 和β2），而其中只有β1 存在于人體[9]。RORγ 的2 種亞基γ1、γ2 均存在于人體和小鼠體內(nèi)，其分布較為廣泛。RORγ（主要是RORγt，即RORγ2）在胸腺中表達(dá)量最高，參與機(jī)體免疫反應(yīng)[10]，同時(shí)也表達(dá)在肝臟、骨骼肌、脂肪組織和腎臟。總之，這3 種RORs 亞型均表現(xiàn)出不同的組織表達(dá)模式，并參與特定靶基因調(diào)控的生理過程。

所有的RORs 都能識別特定的DNA 序列并以單體形式與之結(jié)合，這種特定的DNA 序列被稱為ROR 反應(yīng)元件（ROR response elements，ROREs）。當(dāng)與該元件結(jié)合時(shí)，ROR 蛋白會招募共激活因子，促進(jìn)靶基因的轉(zhuǎn)錄。在控制節(jié)律方面，ROR基因轉(zhuǎn)錄具有生物節(jié)律性，它可通過調(diào)控生物時(shí)鐘關(guān)鍵因子BMAL1、CLOCK 等對晝夜節(jié)律產(chǎn)生影響，在敲除Rorα和Rorβ后，小鼠機(jī)體代謝表現(xiàn)出明顯的晝夜節(jié)律紊亂[11]。

1.2 REV-ERBs

REV-ERBs 包含2 個(gè)亞單位REV-ERBα 和REVERBβ，顯示出與RORs 同等重要的結(jié)構(gòu)特異性[1]。REV-ERBs 多存在于脂肪組織、骨骼肌、大腦和肝臟等組織。然而，不同組織REV-ERBα 和REVERBβ 特異性表達(dá)水平不同。REV-ERBα 在分布部位廣泛高表達(dá)，而REV-ERBβ 只在特定的組織中高度表達(dá)，如REV-ERBβ 在大腦局部組織（松果腺和前額葉皮層）、甲狀腺、子宮和垂體等呈現(xiàn)出高水平表達(dá)的特征，在脂肪組織等表達(dá)量極低。與RORs基因的轉(zhuǎn)錄激活作用相比，REV-ERBs 是轉(zhuǎn)錄抑制因子，這是由于REV-ERBs 缺乏AF-2（activationfunction-2）區(qū)域，該區(qū)域是參與基因共激活結(jié)合過程的關(guān)鍵DNA 區(qū)域。因此，REV-ERBs 與RORs 結(jié)合在相同的RORE 的DNA 反應(yīng)元件上，但REVERBs 負(fù)責(zé)結(jié)合輔阻遏蛋白，如核受體輔阻遏蛋白（nuclear receptor corepressor，NCoR）。REV-ERBs可以作為單體結(jié)合到AGGTCA 序列，形成5' AT 富集延伸區(qū)域，這種功能為轉(zhuǎn)錄沉默過程。REV-ERBs也可以作為同型二聚體與RORE 直接結(jié)合，形成高度穩(wěn)定的同型二聚體，起著轉(zhuǎn)錄抑制子的作用。

2 晝夜節(jié)律與RORα 和REV-ERBα

2.1 晝夜節(jié)律

晝夜節(jié)律是指在一天內(nèi)基因表達(dá)、行為以及許多生理過程發(fā)生的周期性振蕩。生理節(jié)律的調(diào)節(jié)與行為、代謝活動(dòng)、免疫反應(yīng)和許多其他生理功能的晝夜控制是相互聯(lián)系的。晝夜節(jié)律對生物體至關(guān)重要，它使機(jī)體能夠預(yù)測和優(yōu)化代謝調(diào)節(jié)、激素分泌和運(yùn)動(dòng)活動(dòng)，以適應(yīng)環(huán)境每天的變化，如晝/夜和活動(dòng)/休息周期、食物供應(yīng)時(shí)間等。哺乳動(dòng)物的晝夜節(jié)律鐘位于下丘腦視交叉上核（suprachiasmatic nucleus，SCN），調(diào)控并維持晝夜交替與生理功能的同步性。在晝夜周期性振蕩過程中，SCN 的時(shí)鐘振蕩器通過整合明暗周期信號，同時(shí)同步外周組織的自主振蕩，驅(qū)使晝夜節(jié)律相關(guān)的激素水平和酶活性發(fā)生變化，從而調(diào)控多種代謝過程，實(shí)現(xiàn)包括脂質(zhì)和碳水化合物代謝、激素（胰島素、瘦素、皮質(zhì)醇）分泌等的晝夜節(jié)律性改變。當(dāng)晝夜節(jié)律紊亂時(shí)，多種生物鐘基因表達(dá)水平及代謝過程也會相繼發(fā)生混亂[12]。規(guī)律的工作周期及晝夜節(jié)律對于人體新陳代謝穩(wěn)態(tài)的維持至關(guān)重要，現(xiàn)代社會不健康的生活方式如倒班工作、倒時(shí)差、不規(guī)律的睡眠習(xí)慣或長期暴露于人造光下會對晝夜節(jié)律的平穩(wěn)運(yùn)作產(chǎn)生不良影響。有研究表明[13-15]，晝夜節(jié)律紊亂可導(dǎo)致許多疾病的發(fā)生，包括睡眠和情緒障礙、糖尿病、肥胖、神經(jīng)精神疾病和癌癥。

2.2 RORα 和REV-ERBα 的節(jié)律性調(diào)控

核受體RORα 和REV-ERBα 的表達(dá)被認(rèn)為是受晝夜節(jié)律鐘調(diào)節(jié)的，同時(shí)，新近研究發(fā)現(xiàn)，RORα和REV-ERBα 的表達(dá)或功能異常還影響諸多病理過程，如腫瘤、心血管疾病[16]、免疫炎癥性疾病和代謝性疾病等，而這些疾病的發(fā)生發(fā)展與晝夜節(jié)律密切相關(guān)[17-18]。目前，研究者們已經(jīng)建立了由生物鐘驅(qū)動(dòng)的NRs 表達(dá)、NRs 功能和晝夜節(jié)律之間的相互交叉聯(lián)系。生物鐘的周期性振蕩是通過調(diào)控幾種轉(zhuǎn)錄/翻譯反饋回路實(shí)現(xiàn)的（見圖1）。在該反饋回路中，RORα 與REV-ERBα 的核心功能最為關(guān)鍵，它們通過調(diào)控幾種生物鐘基因的轉(zhuǎn)錄，包括Bmal1和Clock等[19]，實(shí)現(xiàn)對下游 Period-2（Per2）、隱花色素-1（cryptochrome-1，Cry1）和隱花色素-2（cryptochrome-2，Cry2）等依賴Bmal1和Clock轉(zhuǎn)錄的基因的調(diào)控作用。而PER/CRY 異源二聚體濃度一旦達(dá)到臨界水平，PER/CRY 異源二聚體又可進(jìn)入細(xì)胞核，轉(zhuǎn)而抑制BMAL1/CLOCK 的活化和自身轉(zhuǎn)錄，并開始一個(gè)新的調(diào)節(jié)周期。這個(gè)反饋循環(huán)致使BMAL1/CLOCK和PER/CRY 的表達(dá)振蕩遵循晝夜節(jié)律模式。有研究表明，RORα 可同時(shí)接受BMAL1/CLOCK 和REVERBα 的雙重調(diào)控[20]。在大鼠肝臟的RORα 近端啟動(dòng)子上，BMAL1/CLOCK 和REV-ERBα 可被分別被招募到E-box 和RORE[17]。E-box 元件中包含2 個(gè)突變位點(diǎn)，單獨(dú)E1 或E2 的突變可降低RORα 的激活，雙突變則可完全消除BMAL1/CLOCK 對RORα 的誘導(dǎo)。另外，BMAL1/CLOCK 激活的啟動(dòng)子可被Cry1抑制。另外有研究顯示，在Bmal1敲除小鼠肝臟中，RORγ 亞型的表達(dá)極大地增強(qiáng)，尤其是在ZT4-8 階段，繼而很大程度上抑制了RORγ 的節(jié)律性表達(dá)模式。RORγ 的mRNA 表達(dá)增加很大程度上是由于在Bmal1敲除肝臟中，REV-ERBs 的生物活性喪失，導(dǎo)致本應(yīng)在ZT4-8 進(jìn)行Rorγ基因抑制的過程丟失[21]。

圖1 RORα 和REV-ERBα 參與的生物鐘節(jié)律性調(diào)控的分子機(jī)制Figure 1 The molecular mechanisms of RORα and REV-ERBα involved in the circadian clock

同時(shí)，由于核受體REV-ERBs、谷胱甘肽還原酶（gluathione reductase，GR）、RORs 和過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome proliferatorsactivated receptors，PPARs）均與生物鐘系統(tǒng)相互作用，能夠從分子水平介導(dǎo)巨噬細(xì)胞、T 細(xì)胞活性，因此是聯(lián)系炎癥和節(jié)律的關(guān)鍵，參與多種免疫性疾病的發(fā)生發(fā)展。目前研究已經(jīng)證實(shí)類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（rheumatoid arthritis，RA）不僅顯示出病理癥狀的晝夜節(jié)律性[22]，而NRs 及其調(diào)控的代謝通路紊亂也參與RA 的病理過程，現(xiàn)已證實(shí)RA 病理基礎(chǔ)是免疫炎癥反應(yīng)，并且存在生物鐘晝夜節(jié)律紊亂的表現(xiàn)。因此，通過對以上NRs 與節(jié)律和炎癥等相關(guān)性的研究，有望促進(jìn)對RA、腫瘤等難治性疾病發(fā)病機(jī)制認(rèn)識的提升，拓展難治性疾病的治療手段，進(jìn)一步指導(dǎo)臨床用藥。

另一項(xiàng)研究表明，在回腸中，RORα 和REVERBα 調(diào)節(jié)與Toll 樣受體（Toll-like receptor，TLR）信號相關(guān)的多個(gè)節(jié)律性基因的表達(dá)。健康個(gè)體和炎癥性腸?。╥nflammatory bowel diseases，IBD）患者中包括ARNTL2、NPAS2、PER1和RORα在內(nèi)的幾個(gè)晝夜節(jié)律基因的表達(dá)上調(diào)，這與這些蛋白在病理生理學(xué)中的作用一致[23]。生理行為學(xué)實(shí)驗(yàn)中觀察到，敲除Rorα或Rorβ后的小鼠的神經(jīng)精神疾病風(fēng)險(xiǎn)增加，包括自閉癥、雙相情感障礙、精神分裂癥、抑郁癥和創(chuàng)傷后應(yīng)激綜合征，這些病癥可能與晝夜節(jié)律障礙相關(guān)[24]。

綜合來看，這些研究都表明RORα 和REVERBα 作為生物鐘系統(tǒng)的重要調(diào)控因子，調(diào)節(jié)各種免疫炎癥通路的調(diào)節(jié)，并為晝夜節(jié)律紊亂與多種疾病風(fēng)險(xiǎn)增加提供了一個(gè)可能的機(jī)制。

3 晝夜節(jié)律與血管穩(wěn)態(tài)

人類的各項(xiàng)生理活動(dòng)，從大腦活動(dòng)到心臟、腎臟或免疫功能等各個(gè)方面都表現(xiàn)出節(jié)律性。近年來的證據(jù)顯示，在心血管系統(tǒng)中，晝夜節(jié)律與血管健康、血管穩(wěn)態(tài)與重構(gòu)之間關(guān)系密切[25-26]，同時(shí)也對心血管系統(tǒng)的生理運(yùn)作產(chǎn)生了重要影響[27]。人類最明顯的晝夜節(jié)律是睡眠/覺醒周期，心率變化和血流、血管張力、纖溶活性和內(nèi)皮功能都自然地受到日/夜變化的影響，這些隨時(shí)間變化的影響不僅是睡眠/清醒或休息/鍛煉變化的結(jié)果，而且還與血管固有特性的顯著波動(dòng)有關(guān)。因此，晝夜節(jié)律紊亂已成為破壞血管穩(wěn)態(tài)和促進(jìn)心血管疾病發(fā)生發(fā)展的一大危險(xiǎn)因素。雖然心血管疾病和晝夜節(jié)律之間的聯(lián)系已有大量研究[28-29]，但心血管生物鐘調(diào)控病理生理的機(jī)制仍有待闡明，這就需要進(jìn)一步探討組成血管系統(tǒng)的主要細(xì)胞類型固有的生物節(jié)律，包括內(nèi)皮細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、成纖維細(xì)胞和干細(xì)胞。

3.1 晝夜節(jié)律在血管穩(wěn)態(tài)中的作用

上世紀(jì)90 年代，外科手術(shù)證明了SCN 的消融可破壞血壓的晝夜變化以及行為和內(nèi)分泌節(jié)律[30]。但這種初步的方法并不能從分子水平上直接洞察晝夜節(jié)律/生物鐘和血壓之間的相互作用。隨后有研究者制定了另一種方案[31]，即通過檢測大鼠主動(dòng)脈對血管活性物質(zhì)的敏感性，以確定一天中收集組織的時(shí)間。作者發(fā)現(xiàn)主動(dòng)脈血管反應(yīng)性呈現(xiàn)出明顯的時(shí)間依賴效應(yīng)，提示血管中存在潛在分子特性的周期性變化。這些發(fā)現(xiàn)與Zhang 等[32]近年的一項(xiàng)研究一致，該研究表明，小鼠主動(dòng)脈轉(zhuǎn)錄組中有相當(dāng)高比例（約5%）的蛋白編碼基因顯示出晝夜節(jié)律性。

在改變了控制外周時(shí)鐘的基因的轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)，血管生理的晝夜節(jié)律控制發(fā)生了明顯的改變；在小鼠主動(dòng)脈管中生物鐘基因的晝夜節(jié)律表達(dá)被首次報(bào)道后[33]，后續(xù)的一系列研究證實(shí)這些生物鐘基因參與了血管生理變化。例如，將主動(dòng)脈從Bmal1敲除小鼠移植到野生型小鼠后，受體小鼠仍然發(fā)展為嚴(yán)重的動(dòng)脈粥樣硬化，而血流動(dòng)力學(xué)沒有改變，這也意味著外周時(shí)鐘在這種表型的產(chǎn)生中起著重要的作用[34]。也有研究表明，生理時(shí)鐘的其他基因（如Per）的遺傳缺失會影響乙酰膽堿的內(nèi)皮依賴性舒張功能障礙，導(dǎo)致血管功能紊亂[35]。另外，在睡眠剝奪（sleep deprivation，SD）小鼠模型中，晝夜節(jié)律鐘功能障礙會導(dǎo)致血管系統(tǒng)硬化，而這一現(xiàn)象與細(xì)胞外基質(zhì)調(diào)控功能受損有關(guān)。

在人體試驗(yàn)中，也得到了相似的結(jié)論。有研究入組了60 名健康男性，在不同時(shí)間的SD 后，分析其對心臟、血流動(dòng)力學(xué)和內(nèi)皮參數(shù)的影響，并確定這些影響是否隨著SD 期延長而持續(xù)；結(jié)果發(fā)現(xiàn)健康男性的SD 與血壓升高有關(guān)，血壓升高出現(xiàn)在SD發(fā)作24 h 后，并在SD 發(fā)作期間持續(xù)升高；觀察到的血流動(dòng)力學(xué)變化可能是由于血管內(nèi)皮功能紊亂引起的，與血管對L-精氨酸（L-Arginine，L-Arg）和非對稱二甲基精氨酸（asvmmetric dimethylarginine，ADMA）的反應(yīng)性有關(guān)[36]?？梢姇円构?jié)律發(fā)生紊亂后，血管功能與血管內(nèi)皮反應(yīng)性均有不同程度影響。

3.2 晝夜節(jié)律與血管疾病

在時(shí)間節(jié)律規(guī)律的概念出現(xiàn)之前，人們相信心血管事件的發(fā)生是隨機(jī)的。然而，一系列的流行病學(xué)研究表明，幾乎所有的急性心血管事件，如不穩(wěn)定型心絞痛、心肌梗死、心源性猝死或卒中等，都表現(xiàn)出晝夜節(jié)律，在清晨出現(xiàn)的頻率最高；這些心血管事件與晨起血壓升高、血管舒張功能下降、血小板聚集能力增強(qiáng)和復(fù)極化改變相一致[37-38]。而如今，大量研究表明，心肌梗死面積隨癥狀出現(xiàn)時(shí)間的變化而變化，并且這種關(guān)系與晝夜節(jié)律周期相關(guān)，支持了心肌易受缺血/再灌注影響的24 h 周期這一假設(shè)，且這些結(jié)果與缺血時(shí)間和護(hù)理質(zhì)量無關(guān)，二者在白天和晚上都有顯著差異[39-40]。

現(xiàn)代生活方式強(qiáng)加了外部的時(shí)間限制和行為模式的改變，這極易使人體暴露于晝夜節(jié)律紊亂的環(huán)境中。長期的不良睡眠習(xí)慣和夜間持續(xù)暴露在光線下導(dǎo)致的睡眠障礙是造成生物鐘紊亂的主要因素。事實(shí)上，相當(dāng)一部分人的睡眠時(shí)間達(dá)不到建議的7～8 h[27]。基礎(chǔ)研究顯示，剝奪睡眠會改變小鼠的晝夜基因表達(dá)，從而導(dǎo)致心臟和肺中基因表達(dá)的改變[41]。此外，流行病學(xué)研究表明，夜班工人患心血管疾病、糖尿病和肥胖的風(fēng)險(xiǎn)增加，這可能是由于直接改變活動(dòng)-休息周期和不斷暴露在光線下，通過抑制褪黑素的產(chǎn)生而造成睡眠障礙[35]。這些變化繼而可能會導(dǎo)致內(nèi)部節(jié)律振蕩器之間失去協(xié)調(diào)。雖然在早期的研究中，由于飲食改變、更高的工作量和伴隨的疾病可能產(chǎn)生的間接影響，因果關(guān)系沒有被明確定義。但對健康輪班工人的研究表明，晝夜節(jié)律失調(diào)會使血壓升高，炎癥標(biāo)志物水平升高[42]。此外，一些關(guān)于輪班工作和心血管疾病的薈萃分析顯示，輪班工作會導(dǎo)致心血管事件的風(fēng)險(xiǎn)增加。

綜上所述，考慮到晝夜節(jié)律紊亂和心血管疾病（cardiovascular disease，CVD）之間的聯(lián)系[43]，了解生物鐘節(jié)律內(nèi)的節(jié)律基因的表達(dá)變化，找出關(guān)鍵因子，從而加強(qiáng)血管功能的保護(hù)和CVD 的防治是一種潛在的治療策略，這有助于開發(fā)新的治療策略，提高治療方案的療效和患者耐受性。

4 RORα 和REV-ERBα 在血管病理生理中的作用

異常生長的微血管和大血管生長被視為結(jié)構(gòu)性冠狀循環(huán)阻塞和功能障礙的臨床病理改變，可以誘發(fā)多種心血管疾?。ㄈ毖俟嘧p傷、動(dòng)脈粥樣硬化易損斑塊破裂、血管重建、內(nèi)皮功能障礙等[44]）。在這些血管的病理變化中，動(dòng)脈粥樣硬化性血管疾病已成為急性心血管疾病的主要病因[45]。易損斑塊破裂已被認(rèn)為是心肌梗死、卒中甚至猝死的主要威脅，以脂質(zhì)代謝紊亂為主要病理改變。針對斑塊內(nèi)巨噬細(xì)胞極化過程，在動(dòng)脈粥樣硬化和易損動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成的上游效應(yīng)物中尋找新的治療靶點(diǎn)和干預(yù)策略是有必要的，這將會促進(jìn)研究人員加強(qiáng)對穩(wěn)定的動(dòng)脈粥樣硬化斑塊向易損斑塊轉(zhuǎn)變的過程的理解。如前所述，幾乎所有器官中存在的晝夜節(jié)律鐘都會影響組織的代謝穩(wěn)態(tài)。因此，生物鐘控制的節(jié)律基因異常是血管功能受損不容忽視的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。研究表明，一些核受體參與了動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生和進(jìn)展，更重要的是，由于其對斑塊纖維帽降解的正向調(diào)控作用，斑塊的穩(wěn)定性也受到了影響[1]。本文歸納了RORα 和REV-ERBα 在生物鐘節(jié)律中對血管病理生理變化的幾種影響。

4.1 RORα 和REV-ERBα 與血管功能

4.1.1 RORα與血管功能 動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病在系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）患者中具有很高的發(fā)病率和死亡率。有研究探究了SLE 誘發(fā)的內(nèi)皮功能障礙和RORα 的作用之間的關(guān)系[46]。該研究發(fā)現(xiàn)，SLE 患者的血清可誘導(dǎo)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞（human umbilical vein endothelial cell，HUVEC）出現(xiàn)功能損傷，而褪黑素的作用可通過增加HUVEC 中超氧化物歧化酶-1（superoxide dismutase-1，SOD1）、谷胱甘肽過氧化物酶-1（glutathione peroxidase-1，GPX1）、過氧化氫酶（catalase，CAT）活性，減少活性氧水平，從而延緩內(nèi)皮細(xì)胞衰老，促進(jìn)損傷后HUVEC 的增殖和修復(fù)；并且，SLE 炎性介質(zhì)誘導(dǎo)的RAW264.7 巨噬細(xì)胞遷移也被抑制，細(xì)胞間黏附分子-1（intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1）和血管細(xì)胞黏附分子-1（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）表達(dá)減少，這些保護(hù)作用在很大程度上是由于RORα 的參與。當(dāng)特異性抑制RORα 活性后，褪黑素的抗炎、抗氧化和抗凋亡作用即消失，可見RORα 有潛力成為預(yù)防或治療內(nèi)皮功能障礙和動(dòng)脈粥樣硬化性心血管疾病的有效治療靶點(diǎn)。

近期有研究顯示，RORα 可激活活化蛋白激酶（AMP-activated protein kinase，AMPK），這與血管平滑肌細(xì)胞（vascular smooth muscle cell，VSMC）增殖的抑制作用相關(guān)[47]。其一，RORα 及其激活劑膽固醇硫酸（cholesterol sulfate，CS）可誘導(dǎo)人體主動(dòng)脈VSMC 和大鼠A7r5 細(xì)胞激活A(yù)MPK 通路，并伴隨著哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白（mammalian target of rapamycin，mTOR）和p70 核糖體蛋白S6 激酶1的活性抑制。其二，RORα 和CS 還參與調(diào)控細(xì)胞周期因子的表達(dá)，如p53、p27 和cyclin D。激活的RORα 可能通過細(xì)胞周期G1期的抑制作用，抑制人體主動(dòng)脈VSMC 和大鼠A7r5 細(xì)胞的增殖。二維和三維細(xì)胞遷移實(shí)驗(yàn)也驗(yàn)證了過表達(dá)RORα 或使用CS 能夠抑制A7r5 細(xì)胞的遷移。其三，體內(nèi)使用腺病毒在主動(dòng)脈內(nèi)過表達(dá)RORα 后，球囊誘導(dǎo)的大鼠的動(dòng)脈損傷也得到了緩解。這些結(jié)果都表明，RORα 通過AMPK 誘導(dǎo)的mTOR 通路，抑制VSMC的增殖和遷移，提示RORα 可能是心血管疾病的一個(gè)潛在治療靶點(diǎn)。同時(shí)，針對RORα 與內(nèi)皮祖細(xì)胞（endothelial progenitor cell，EPC）的關(guān)系，也有研究認(rèn)為，RORα 可誘導(dǎo)循環(huán)中促紅細(xì)胞生成素的產(chǎn)生，繼而激活EPC 分化所需的AMPK 活性，促進(jìn)EPC 的分化與新生血管形成，加速組織修復(fù)并維持血管功能的穩(wěn)定[48]。

4.1.2 REV-ERBα 與血管功能 大部分研究都表明，REV-ERBα 主要表達(dá)于VSMC。有研究顯示，過表達(dá)REV-ERBα 可上調(diào)白細(xì)胞介素-6（interleukin 6，IL-6）和環(huán)氧酶（cyclo-oxygenase，COX）的表達(dá)，活化核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB），促進(jìn)p65 向A7r5 細(xì)胞核的轉(zhuǎn)位；此外，在A7r5 VSMCs 中，RORα 可上調(diào)REV-ERBα 的表達(dá)，但這種作用可被REV-ERBα 本身抑制[49]。這些結(jié)果提示REV-ERBα 和NF-κB 通路之間存在相關(guān)性。

另有研究探索了REV-ERBα 與血管內(nèi)皮功能之間的關(guān)系。Li 等[50]發(fā)現(xiàn)由機(jī)械損傷或慢性炎癥引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷是引起血管疾病的重要原因。該研究證明，低劑量、安全的外源性一氧化碳（carbon monoxide，CO）可通過誘導(dǎo)REV-ERBα 促進(jìn)染色質(zhì)重構(gòu)和組蛋白H3 乙酰化實(shí)現(xiàn)，從而增強(qiáng)內(nèi)皮細(xì)胞的遷移能力。該研究通過觀察靶細(xì)胞REV-ERBα調(diào)控DNA 表達(dá)的作用，發(fā)現(xiàn)其可以招募組蛋白脫乙酰酶/核受體輔阻遏物（histone deacetylase/nuclear receptor corepressor，HDAC/N-CoR），調(diào)節(jié)負(fù)責(zé)內(nèi)皮細(xì)胞遷移和血管生成的轉(zhuǎn)錄基因生成。當(dāng)正常野生型小鼠移植了REV-ERBα+/-小鼠骨髓后，受體小鼠體內(nèi)REV-ERBα 表達(dá)水平降低，導(dǎo)致CO 對金屬絲損傷后新內(nèi)膜形成的保護(hù)作用喪失?？偟膩碚f，REV-ERBα 作為CO 對內(nèi)皮細(xì)胞保護(hù)作用機(jī)制中的關(guān)鍵因子，它參與調(diào)節(jié)EPC 和內(nèi)皮細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)，增強(qiáng)了血管損傷后的組織修復(fù)。因此，通過調(diào)控REVERBα 及其下游基因可能有利于治療與血栓形成失調(diào)和血管生成有關(guān)的血管綜合征等血管疾病。

4.2 RORα 和REV-ERBα 與動(dòng)脈粥樣硬化

4.2.1 RORα 與動(dòng)脈粥樣硬化 由于RORα 在血管壁細(xì)胞（包括VSMC、內(nèi)皮細(xì)胞和單核細(xì)胞）上的節(jié)律性表達(dá)[51]，可以推測RORα 也參與易損斑塊的發(fā)生發(fā)展。研究顯示，RORαsg/sg突變小鼠可發(fā)生嚴(yán)重的動(dòng)脈粥樣硬化，并伴隨著血清總膽固醇和高密度脂蛋白膽固醇含量顯著降低[52]。另有研究顯示，RORα 的激活可有效抑制動(dòng)脈粥樣硬化的產(chǎn)生；另外，通過心臟切片形態(tài)學(xué)以評估冠狀動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的發(fā)生率，研究者們發(fā)現(xiàn)Rorα敲除小鼠可發(fā)生嚴(yán)重的冠狀動(dòng)脈粥樣硬化[53]。除了在動(dòng)脈粥樣硬化中可發(fā)揮有益作用外，RORα 也被報(bào)道參與調(diào)控脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)相關(guān)基因APOA Ⅴ的轉(zhuǎn)錄，這些結(jié)果均提示RORα 可以作為治療動(dòng)脈粥樣硬化的潛在靶標(biāo)；在體外細(xì)胞HepG2 和HuH7 中，RORα 缺失條件下，APOA Ⅴ活動(dòng)強(qiáng)度降低，APOA Ⅴ轉(zhuǎn)錄被抑制，而過表達(dá)RORα，可增加APOA Ⅴ的表達(dá)水平；有趣的是，APOA Ⅴ對RORα 的功能性依賴，以及對脂質(zhì)代謝的影響只在人體中產(chǎn)生，并不存在于小鼠體內(nèi)[54-55]。

高發(fā)生率的自發(fā)性斑塊破裂和腔內(nèi)血栓形成是動(dòng)脈粥樣硬化的主要特征。最近的一項(xiàng)研究表明[53]，通過部分結(jié)扎動(dòng)脈可以刺激小鼠形成主動(dòng)脈易損斑塊。頸動(dòng)脈結(jié)扎的同時(shí)，增加左腎動(dòng)脈處結(jié)扎可誘導(dǎo)腎血管性高血壓，促進(jìn)內(nèi)生Ang II 的產(chǎn)生，這種手術(shù)可導(dǎo)致頸部脂質(zhì)斑塊的產(chǎn)生，促進(jìn)血栓形成，斑塊自發(fā)破裂，這些形態(tài)學(xué)表現(xiàn)均得到了證實(shí)。研究通過斑塊免疫熒光染色和mRNA 水平分析證明，在易損頸動(dòng)脈斑塊中，RORα 水平被抑制。此外，RORα 缺乏的小鼠血小板功能受損，RORα 產(chǎn)生各種異?，F(xiàn)象，如易損斑塊出血的發(fā)生率更高，自發(fā)的斑塊破裂和血栓，收縮期血流速度改變，脂質(zhì)過度堆積等。重要的是，異常表達(dá)的RORα還影響著一些炎癥因子的釋放，包括IL-1β、IL-2、IL-6、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein 1，MCP-1）、巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-1α（macrophage inflammatory protein 1α，MIP-1α）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor α，TNF-α），這進(jìn)一步加劇了血管損傷。鑒于RORα 對脂質(zhì)的調(diào)控作用，正如前面所示，相較于野生型小鼠，RORαsg/sg小鼠血漿三酰甘油和總膽固醇水平降低，表明RORα可能通過抗炎活動(dòng)穩(wěn)定斑塊。

不過，也有研究得出了相反的結(jié)論，即抑制RORα 可有效抑制動(dòng)脈粥樣硬化的形成[56]。該研究使用低密度脂蛋白受體（low-density lipoprotein receptor precursor，LDL-R）-/-小鼠，以高膽固醇飲食作為動(dòng)脈粥樣硬化模型組，隨后使用ROR 抑制劑SR1001 給藥4 周。結(jié)果發(fā)現(xiàn)該藥可有效降低血漿LDL 水平，增加腸內(nèi)膽固醇排泄，但不影響高密度脂蛋白水平。同時(shí)SR1001 處理組還可誘導(dǎo)抗免疫作用，其特征是Th17 細(xì)胞減少，Treg 和Th2 細(xì)胞增多。該數(shù)據(jù)表明，RORα 在動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)展上發(fā)揮重要作用，抑制RORs 的活性可有效抑制斑塊形成。

總的來說，RORα 作為轉(zhuǎn)錄因子可調(diào)控代謝和炎癥反應(yīng)，參與動(dòng)脈粥樣硬化的形成，但其具體作用還需進(jìn)一步的研究確認(rèn)。

4.2.2 REV-ERBα 與動(dòng)脈粥樣硬化 代謝綜合征和血脂異常均具有導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化血栓形成的共同機(jī)制，成為心血管疾病的高危因素。晝夜節(jié)律在脂質(zhì)代謝紊亂中起著關(guān)鍵作用，晝夜節(jié)律的紊亂同樣會破壞其他生物過程的平衡，尤其是血管，從而引發(fā)炎癥、內(nèi)皮功能障礙和血栓形成。巨噬細(xì)胞被廣泛認(rèn)為是參與炎癥和脂質(zhì)代謝相互作用的斑塊發(fā)展各個(gè)階段的關(guān)鍵組織者。REV-ERBα 在巨噬細(xì)胞中表達(dá)豐富，這使REV-ERBα 參與動(dòng)脈粥樣硬化斑塊形成成為可能。在人肝細(xì)胞HepG2 中，轉(zhuǎn)染REVERBα 顯示出特定的ApoC--III 水平抑制作用，這可能為REV-ERBα 抑制三酰甘油脂蛋白的產(chǎn)生提供新的途徑[57]。越來越多的證據(jù)闡明，在巨噬細(xì)胞內(nèi)REV-ERBα 主要控制膽固醇體內(nèi)平衡與脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）引起的炎癥反應(yīng)，進(jìn)一步驗(yàn)證了REV-ERBα 的抗動(dòng)脈粥樣硬化作用。此外，動(dòng)脈粥樣硬化的過程中炎癥反應(yīng)加速可能是由于體內(nèi)缺乏REV-ERBα，而動(dòng)脈粥樣硬化后，斑塊中巨噬細(xì)胞傾向于過表達(dá)REV-ERBα 從而延緩炎癥反應(yīng)。Wang 等[58]發(fā)現(xiàn)ERV-ERBα 可有效抑制纖溶酶原激活物抑制物-1（plasminogen activator inhibitor type 1，PAI-1）的節(jié)律性表達(dá)，PAI-1 的水平變化被視為調(diào)節(jié)炎癥和動(dòng)脈粥樣硬化的核心細(xì)胞因子，ERV-ERBα通過結(jié)合PAI-1 啟動(dòng)子，達(dá)到抑制PAI-1 活性的作用。節(jié)律性表達(dá)的PAI-1 可導(dǎo)致急性血栓和其他嚴(yán)重的心血管事件，如缺血性疾病。另一項(xiàng)研究使用REV-ERBα 特定合成配體SR9009，測試藥理學(xué)激活REV-ERBα 是否能類似地抑制血管并發(fā)癥；結(jié)果發(fā)現(xiàn)LDL 受體缺陷小鼠在接受SR9009 處理后，油紅染色和HE 染色均顯示斑塊沉積明顯減少，顯示出潛在的抗動(dòng)脈粥樣硬化的效果，處理組與對照組相比血漿脂質(zhì)沒有顯著性差異；在分子水平上，骨髓來源的小鼠巨噬細(xì)胞中，藥理學(xué)激活REV-ERBα 后，干擾素γ（interferon γ，IFNγ）的mRNA 和促炎因子的表達(dá)被明顯抑制，如IL-6、巨噬細(xì)胞移動(dòng)抑制因子（macrophage migration inhibitory factor，MIF）和MCP-1，說明激活的REV-ERBα 可能通過抑制巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)從而保護(hù)血管功能[59]?？傊?，這項(xiàng)最新研究得出的結(jié)論與之前的研究基本一致。

從這些研究發(fā)現(xiàn)可見，REV-ERVα 可在一定程度上預(yù)防和治療動(dòng)脈粥樣硬化，并且在穩(wěn)定斑塊問題上，抑制巨噬細(xì)胞炎癥可能成為REV-ERBα 保護(hù)動(dòng)脈粥樣硬化的主要作用機(jī)制。因此，藥理學(xué)干預(yù)REV-ERBα，增強(qiáng)其內(nèi)源活性或可作為抗動(dòng)脈粥樣硬化，延緩動(dòng)脈粥樣硬化進(jìn)展的有效治療手段。

4.3 RORα 和REV-ERBα 與高血壓

如前所述，由于交感神經(jīng)活動(dòng)的節(jié)律性變化，人體血壓也在一天中呈現(xiàn)節(jié)律性改變。血壓一般在清晨覺醒時(shí)開始升高，在上午10 點(diǎn)左右達(dá)到最高值，而后不斷下降，在凌晨3 點(diǎn)左右達(dá)到最低點(diǎn)[60]。正是因?yàn)榻桓猩窠?jīng)系統(tǒng)的晝夜節(jié)律與心血管穩(wěn)態(tài)之間的關(guān)系，所以清晨較高的心血管事件發(fā)生率與早晨血壓峰值有關(guān)。血壓變化受節(jié)律基因調(diào)控，有研究指出，Bmal1的遺傳缺失可以消除血壓的晝夜變化，減少兒茶酚胺的產(chǎn)生[61]。臨床數(shù)據(jù)表明，急性心肌梗死、心源性猝死和缺血性卒中的發(fā)生率在清晨最高[37,62]。而血壓變化受生物節(jié)律鐘基因軸調(diào)節(jié)。有證據(jù)表明，不良或短暫的睡眠習(xí)慣（即睡眠時(shí)間少于6.5 h）極易導(dǎo)致健康個(gè)體血壓和心率升高[27,63]，產(chǎn)生嚴(yán)重的心血管疾病，并與發(fā)病率和死亡率升高相關(guān)。

褪黑素作為交感神經(jīng)系統(tǒng)中時(shí)鐘基因的授時(shí)因子，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)如SCN、外周組織如脂肪細(xì)胞和心肌細(xì)胞中發(fā)揮重要作用。褪黑素對野生型SD（Sprague-Dawley）大鼠和高血壓大鼠Bmal1和Per2的表達(dá)呈晝夜節(jié)律作用，但未改變SCN 中時(shí)鐘基因的表達(dá)。研究顯示，在高血壓大鼠SCN 中，注射褪黑素的首個(gè)24 h 的夜晚并不影響生物鐘基因轉(zhuǎn)錄，但它卻改變了生物鐘的表達(dá)模式，在第2 個(gè)周期夜晚顯示褪黑素明顯維持REV-ERBα 的mRNA長期高表達(dá)，特別是在褪黑素治療后12 h 內(nèi)，避免了REV-ERBα 的mRNA 下降[64]。因此，可以推測，在成年大鼠心肌細(xì)胞內(nèi)，REV-ERBα 在光信號傳導(dǎo)至外周器官（如心臟）時(shí)，調(diào)節(jié)外周器官的血壓節(jié)律性中發(fā)揮重要作用。具體機(jī)制可能是褪黑素受體MT1和MT2的活性被抑制，喪失了對REV-ERBα 表達(dá)的調(diào)控。而褪黑素對心肌細(xì)胞生物鐘的作用可能也涉及翻譯后機(jī)制，這需要進(jìn)一步研究。另一項(xiàng)研究也表明，大鼠的程序性高血壓事件與節(jié)律基因表達(dá)相關(guān)，當(dāng)給予褪黑素治療后，交感神經(jīng)系統(tǒng)接受褪黑素刺激，從而使腎臟內(nèi)MT2受體活性增加，導(dǎo)致RORα 表達(dá)明顯升高，有效保護(hù)程序性高血壓大鼠的血壓[65]。

綜上可見，受交感神經(jīng)系統(tǒng)釋放的褪黑素支配，血壓變化與REV-ERBα 和RORα 的活性密切相關(guān)，升高REV-ERBα 和RORα 的基因表達(dá)水平可有效保護(hù)高血壓帶來的危害。

5 臨床前景

由于在血管病理生理過程中發(fā)揮的重要作用，以REV-ERBα 和RORα 為靶點(diǎn)的藥物正不斷被研發(fā)，以期獲得較好的血管健康及臨床療效。

褪黑素是松果體分泌的一種吲哚類神經(jīng)內(nèi)分泌素，而RORα 作為內(nèi)源性褪黑素受體，可能在晝夜節(jié)律、血管功能、血運(yùn)重建中存在一定的作用。在一般人群和心血管疾病患者中，心率和血壓升高是各種原因死亡的危險(xiǎn)因素。夜間心率下降不足，即心率不下降，也會增加心血管風(fēng)險(xiǎn)。心率/血壓異常反映了自主神經(jīng)系統(tǒng)中交感神經(jīng)張力相對地不平衡。一項(xiàng)臨床試驗(yàn)中，對26 名健康清醒的男性以仰臥位給予2 mg 褪黑素，60 min 后，與給予安慰劑的受試者相比，觀察到心率和血壓明顯下降，心率變異性增加，血漿去甲腎上腺素和多巴胺含量顯著降低[66]。在另一項(xiàng)臨床試驗(yàn)中，共篩選了97 位正常血壓和高血壓老年志愿者，于睡覺前持續(xù)2 周給予1.5 mg 褪黑素，結(jié)果顯示受試者的收縮壓和舒張壓出現(xiàn)了不同程度的降低，于3:00 — 8:00 間（最易發(fā)生心血管事件的時(shí)間段）產(chǎn)生心率降低現(xiàn)象[67]。一項(xiàng)涉及78 名體位性心動(dòng)過速綜合征患者的研究表明，與安慰劑相比，褪黑素在使用后2 h 內(nèi)站立時(shí)間明顯延長[68]。綜合上述臨床試驗(yàn)結(jié)果可見，褪黑素可以降低心率和血壓，同時(shí)褪黑素的時(shí)間生物學(xué)作用可以使夜間心率下降不足現(xiàn)象恢復(fù)正常。褪黑素的抗高血壓和抗心動(dòng)過速等特性預(yù)示著它在對抗心率升高及控制血壓方面很有前途。

雖然RORα 與REV-ERBα 的特異性小分子激動(dòng)劑，如REV-ERBα 藥理性激動(dòng)劑SR9009、GSK4112等已被研制并可用于細(xì)胞實(shí)驗(yàn)與動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，但由于目前關(guān)于穩(wěn)定晝夜節(jié)律對冠心病和心力衰竭的影響的前瞻性研究還很少，該類小分子新型藥物仍處于臨床前研究階段，而目前已知的大部分基礎(chǔ)研究均表明，以RORα 與REV-ERBα 為靶點(diǎn)進(jìn)行抗動(dòng)脈粥樣硬化、抗高血壓的藥物有樂觀的臨床研究前景，未來圍繞二者開展的藥物臨床試驗(yàn)具有極大的臨床意義和治療前景。

6 結(jié)語

綜上所述，RORα 和REV-ERBα 是生物鐘系統(tǒng)的重要組成部分，其不僅是經(jīng)典生物鐘基因，更是生物鐘調(diào)節(jié)的關(guān)鍵因子，在維持生物節(jié)律中發(fā)揮關(guān)鍵作用，并且在血管穩(wěn)態(tài)及心血管系統(tǒng)疾病中占有重要地位。近年來很多研究都在關(guān)注RORα 和REVERBα，在維持血管結(jié)構(gòu)穩(wěn)態(tài)、血管健康以及動(dòng)脈粥樣硬化疾病發(fā)展中具有重要作用。在RORα 和REVERBα 基因水平改變后，容易在促動(dòng)脈粥樣硬化的危險(xiǎn)因素下造成血管損傷，促進(jìn)脂質(zhì)斑塊形成，并且易轉(zhuǎn)變?yōu)橐环N易損斑塊表型。但仍有部分研究對于RORα 和REV-ERBα 這2 種生物鐘核受體在機(jī)體內(nèi)的作用持對立觀點(diǎn)，因此RORα 和REV-ERBα 對人體心血管疾病發(fā)展的影響仍有待進(jìn)一步的深入探討。隨著人們對生物鐘基因的認(rèn)識和研究的不斷加深，生物節(jié)律在血管病理生理過程中發(fā)揮的作用將逐漸被解密，有理由相信，干預(yù)生物節(jié)律將為預(yù)防和治療心血管疾病提供重要的理論依據(jù)。